全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
小梅山猪 Ghrelin基因的克隆及其在生殖轴的表达
张舒 1 潘孝青 2 丁家桐1
( 1扬州大学动物科学与技术学院,扬州 225009; 2江苏省农业科学院,南京 210000)
摘 要: 以小梅山母猪为试验材料, 通过 RTPCR、克隆及荧光定量,研究 Ghre lin在其生长发育不同阶段生殖轴表达情
况, 旨在探究 Ghre lin对动物繁殖性能的影响。结果表明,初生、初情期至性成熟卵巢 Ghre lin mRNA表达量呈上升趋势, 不同
阶段间差异显著 (P < 0 05)。性成熟时生殖轴不同组织 Ghre lin mRNA表达量, 卵巢明显高于垂体和下丘脑 (P < 0 05), 而垂
体与下丘脑间差异则不显著 (P > 0 05)。
关键词: 小梅山猪 Ghre lin 生殖轴 克隆 实时荧光定量 PCR
Cloning and Expression ofGhrelin Gene in X iaoM eishan
Pig s Reproduction Axis
Zhang Shu
1 Pan X iaoqing2 D ing Jiatong1
(
1
Co llege of A nimal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009;
2
Institute
of A nimal Science J iangsu A cademy of A gricultural Sciences, N anjing 210000)
Abstrac:t In orde r to research the b io log ical functions of Ghre lin, its expression lev el during diffe rent g row th deve lopm ent stage of
X iao M e ishan p igs reproduction ax is w ere ana lyzed. The results show ed that the expression o f Ghre lin mRNA expression leve l showed a
upw ard trend and have a s ignificant difference(P < 0 05). The highest expression of Ghre lin mRNA was in sexualm a tur ity p ig s ovary
wh ich is sin ificant h ighe r than pituitary and hypotha lam us(P < 0 05), but the d ifference of expression leve l between p itu itary and hypo
tha lamus w as not s ignificant(P > 0 05).
Key words: X iao M eishan pig Ghre lin Reproduction ax is Gene c lone F luo rescence quantitative PCR
收稿日期: 20100719
基金项目:江苏省自然科学基金项目 ( BK200505 )
作者简介:张舒,女,硕士研究生,研究方向:动物胚胎工程与生物技术; Em ai:l zhangshu_0301@ 163. com
通讯作者:丁家桐,男,博士生导师,教授,研究方向:动物遗传育种与繁殖; Em ai:l jtd ing@ yzu. edu. cn
动物生殖内分泌功能受多种内分泌因子调节,
这些调节因子大部分是由脑、垂体和性腺合成并释
放的。除此之外,脂肪和肠道组织也会生成一些促
进生殖功能的因子。生长激素释放肽 ( Ghrelin)即
是一种主要由胃组织合成和分泌的脑肠肽。Ghrelin
是生长激素促分泌素受体 ( GHSR )的一种内源性
配体 [ 1 - 3] , 1999年由日本国立循环器病中心 Ko jima
等 [ 4]从小鼠和人的胃组织中成功分离并鉴定。就
目前的研究报道, Ghre lin除调节生长激素分泌外,
还具有调节采食量、促进胃酸分泌和胃肠运动、能量
代谢及调节生殖功能等广泛的生物学作用。
Ghre lin基因在生殖系统不同组织中有着广泛
的表达,并且通过旁分泌和自分泌对各组织器官如
子宫、胎盘、睾丸和卵巢等起调节作用 [ 5, 6 ]。M iller
等 [ 7]利用免疫组化的方法在绵羊不同发育阶段的
卵泡中也发现了 Ghrelin。 Cam inos等 [ 8, 9 ]研究表
明, Ghrelin在小鼠和人性周期各个时期的生殖系
统中都有表达, mRNA 含量在周期不同阶段有
所不同。
本试验通过 RTPCR和荧光定量等技术手段对
小梅山猪 Ghre lin基因 cDNA片段进行序列分析, 同
时研究该基因在生殖轴中的表达情况,在分子水平
上探索 Ghrelin在家畜繁殖中的作用。
1 材料
11 试验动物
试验用初生、初情期、性成熟期纯种小梅山母猪
2011年第 2期 张舒等:小梅山猪 Ghrelin基因的克隆及其在生殖轴的表达
各 3头,由江苏省小梅山猪育种中心提供,为保证试
验结果的准确性,本试验选取的试验用猪均来自同
日龄的同一窝仔猪。屠宰后迅速取出下丘脑、垂体
和卵巢组织,投入液氮中保存待用。
12 引物及主要试剂
根据 NCB I搜索信息 ( GenBank登录号: NM _
213807, SSU 07786)设计两对引物, 由上海捷瑞生物
工程有限公司合成。引物序列见表 1。
表 1 两对特异性引物序列、退火温度及目的片段长度
基因 目的片段长度 ( bp ) 引物序列 ( 5- 3)
Gh relin 341
F: CTCATGGCAGACTTGGC
R: GGGAGAACAGAGGTGGC
actin 233 F: GGACTTCGAGCAGGAGATGG
R: GCACCGTGTTGGCGTAGAGG
Trizo l购自 Inv itrogen公司; F irst Strand cDNA
Synthesis K it购自 Ferm entas公司; Taq DNA多聚酶、
dNTP购自大连宝生物工程有限公司; DNA M arker
克隆载体 pMD19T,购自大连宝生物工程有限公司;
DL2000、Go ldv iew、小提质粒试剂盒、IPTG、Xgal、
SYBR Prem ix ExTaq购自天根生化科技有限公司;
B iosp in胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司;
三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、异戊醇和 DEPC均为
分析纯级。
2 试验方法
21 总 RNA的提取
小梅山猪各个组织经液氮冷冻后研磨, 移入离
心管中,在 50- 80mg组织中加 1mL T rizo l试剂,吹
打均匀,按使用说明提取总 RNA。分光光度计测定
OD 260 /OD280值及浓度。
22 RTPCR反应
RTPCR分两步完成。 cDNA第一链的合成
用 Super Scrip tTM第一链合成系统完成, 反应体系
为 20 L, 所加 RNA量约 2 L。反应程序按试剂
盒说明书设定。 PCR反应体系为 25 L, 10
Bu ffer 25 L, 25 mmo l /L M gC l2 12 L, 25
mmo l /L的 dNTP 2 L, 上、下游引物各 15 L
( 10 mo l/L ) , cDNA 第一链产物 15 L, Taq酶
0 25 L( 5 U /L) , 无菌水 1455 L。 PCR反应
程序: 94 预变性 5 m in, 然后进行 29个循环的
PCR: 94 变性 30 s, 58 退火 40 s, 72 延伸 30
s, 循环完成后 72 延伸 10 m in。 PCR产物用
1%琼脂糖凝胶电泳检测。
23 PCR产物的回收及基因片段的克隆
从胃组织总 RNA中扩增出目的大小片段, 用
B iospin胶回收试剂盒回收 (按试剂盒说明进行 )。
在连接酶的作用下, 将 pMD19T载体与回收的 Gh
relin基因片段在 16 条件下保温过夜连接。取 100
L DH5感受态细胞,加 5 L DNA连接产物,冰浴
30m in, 42 热激 90 s,立即冰浴 1- 2 m in, 加 400
L不含 AMP的 LB液体培养基, 37 摇床复苏 2 h。
取 100 L转化的感受态细胞均匀涂布到含氨苄青
霉素、Xgal和 IPTG的 LB琼脂平板上培养 12 - 16
h。挑取白色菌落于含有 Amp的 LB液体培养基中
37 震荡培养 12 h。
24 质粒提取和鉴定
离心菌液分离菌体,用天根质粒提取试剂盒提
取质粒,经菌液 PCR和质粒 PCR两种方法鉴定重
组质粒正确后,将质粒和 15%甘油保存的菌液一并
寄至天根生化科技有限公司测序。
25 荧光定量 RCR反应
以 cDNA为模板,按照荧光定量 PCR试剂盒说
明书进行荧光定量 PCR反应,每个日龄样本做 3个
重复。总反应体系 20 L: SYBR Prem ix Ex Taq 9
L, FPrimers ( 10 mo l/L ) 05 L, PPrimers ( 10
mo l/L) 05 L,模板 ( cDNA ) 2 L, DEPC水 8 L。
荧光定量 PCR反应程序: 94 预变性 90 s, 然后进
行 40个循环的 PCR: 94 20 s, 58 30 s, 68
45 s。扩增后进行熔解曲线分析。
3 结果与分析
31 小梅山猪总 RNA的检测
用紫外分光光度计检测所得 RNA的质量 ,
A 260 /A 280 18。通过 1% 的琼脂糖检测 (图 1) ,
可见清晰条带分别为 28S、18S和 5S, 说明所提
RNA较为完整, 无 DNA 污染, 可进行 RTPCR
反应。
32 Ghrelin基因的 PCR扩增和阳性克隆的 PCR
鉴定
提取的总 RNA按上述条件进行 RTPCR扩增,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
得到的产物经 1%的琼脂糖胶电泳, 在 341 bp左右
有一条特异性 DNA条带 (图 2) ,与引物设计的预期
扩增结果一致,证明了设计及反应条件具有较好的
特异性。
用质粒 DNA作为模板进行 PCR扩增, 然后用
1%的琼脂糖电泳检测,得到扩增片段结果 (图 3)与
预期结果一致,克隆效果较好。
M. DL2000 Marker; 1, 2. Ghrelin基因 M. DL2000M ark er; 1, 2. Gh relin基因
图 1 RNA琼脂糖凝胶电泳图 图 2 小梅山猪 Ghrelin基因 PCR扩增片段 图 3 阳性克隆 PCR扩增片段
33 核酸序列测定和分析
对 RTPCR产物进行纯化、克隆、菌液 PCR鉴
定后, 将阳性新鲜菌液送北京天根生化科技有限公
司测序,得到了小梅山猪 Ghre lin基因的 341 bp片
段, 将此序列在 G enB ank上所获得的野猪 Ghre lin序
列对比分析,同源性为 99% (图 4,图 5)。
图 4 小梅山猪 Ghre lin基因序列同源性比较
图 5 小梅山猪 Ghre lin基因目的产物波峰图
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此段序列在所测 Ghrelin基因的起始为 6终点
为 346,通过测序获得目的基因片段长度为 341 bp,
与公布的基因序列仅有一个碱基不同, 从波峰图中
可以看出波峰峰值很好。可见,所设计的引物以及
其 PCR产物为目的基因序列。
34 Ghrelin mRNA表达实时荧光定量检测
341 PCR产物的特异性检测 实时荧光定量
PCR的扩增曲线表明效果良好, 经溶解曲线分析
Ghrelin和 actin分别在 825 和 85 出现单一产
物峰 (图 6), 均与引物设计后预期产物 Tm值相同。
图 6 Ghrelin基因的扩增曲线 (A )和熔解曲线 ( B)以及 actin基因的扩增曲线 ( C)和熔解曲线 (D)
342 Ghrelin和 actin基因扩增效率一致性的判
定 以质粒为模板, 调整 Ghrelin和 actin的质粒
浓度一致,然后分别进行 10倍梯度稀释, 制作 Ghre
lin和 act in的标准曲线 (图 7) ,相关系数分别为
0997和 0999, 斜率分别为 - 1801和 - 1782。
由此可知其斜率之差小于 01, 因此可以用 2- CT
法进行相对定量分析。
343 Ghrelin在生殖轴中的相对表达变化 通过
上述 RTPCR试验结果表明, 小梅山猪 Ghrelin mR
NA在初生、初情期及性成熟生殖轴中均有表达。
以性成熟小梅山猪卵巢 Ghrelin mRNA表达量为校
正样本,表达量为 1,下丘脑相对表达量为 0449, 垂
体相对表达量为 0316, 与卵巢差异显著 ( P <
005) ,垂体与下丘脑之间差异不显著 (P > 05); 根
据生长发育不同阶段 GhrelinmRNA表达量分析, 同
样以卵巢 Ghre lin mRNA表达量为校正样本, 初生期
卵巢、初情卵巢相对表达量分别为 0421与 0740,
与性成熟之间差异显著 (P < 005) (图 8)。
图 7 Ghre lin基因 (A )与 ac tin基因 (B )的标准曲线
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
不同字母代表差异显著 (P < 005)
图 8 小梅山猪 Ghre lin基因在生殖轴的相对表达丰度
4 讨论
Ghre lin是新发现的生长激素释放调节多肽。
到目前为止,已经获得了人、大鼠、小鼠、沙鼠、犬、牛
和绵羊等哺乳动物以及鸡、鹅等禽类动物 Ghrelin基
因的序列。人和大鼠的 Ghre lin基因由 5个外显子
和 4个内含子构成,经转录翻译后生成了 Ghrelin前
体 ( P reproGhrelin) [ 11 ] ,经加工修饰后合成有生物活
性的 Ghrelin蛋白。人和大鼠 Ghre lin前体由 117个
氨基酸组成,其中 23个氨基酸为信号肽。野猪 Gh
re lin前体编码 118个氨基酸残基,信号肽同样为 23
个氨基酸。Ghrelin前体分裂后产生初期 Ghrelin,在
加工过程中产生 Ghrelin C末端的 PR结构 (脯氨
酸 -精氨酸 ), 即为其识别部位 [ 4 ]。本研究中根据
野猪的 Ghrelin序列,设计引物, 通过 RTPCR及克
隆,得到了小梅山猪 Ghre lin基因部分 cDNA序列,
扩增长度为 341 bp。本序列编码 113个氨基酸,包
含完整成熟 Ghrelin蛋白部分。通过 b last分析, 发
现其序列与 GenBank上公布的仅有一个碱基的区
别,这有可能是由于反转录过程中的错配引起的,也
可能是小梅山猪与野猪的种间差异造成的, 但并不
改变氨基酸序列。
近几年研究发现 Ghrelin在哺乳动物正常生殖
中占据着重要的地位。H ou等 [ 12]在大鼠下丘脑免
疫组化试验中,发现 Ghrelin免疫反应细胞分布于下
丘脑外侧、室旁核和弓状核。在垂体,也观察到 Gh
re lin肽表达, 许多研究发现, Ghrelin mRNA和 Ghre
lin肽在大鼠、人和猪垂体中也普遍存在。Ghre lin及
其受体广泛存在于哺乳动物的性腺中 [ 7 ]。Gay tan
等 [ 8]发现, 大鼠和人卵巢卵泡中存在 Ghre lin免疫弱
阳性细胞,黄体则显示强阳性; M iller等 [ 7]在绵羊卵
巢上的研究发现,不同发育阶段的卵泡中均有 Ghre
lin免疫阳性细胞, 尤其是生长卵泡的颗粒层和闭锁
卵泡的卵泡外腺细胞呈现强阳性。Ghre lin对生殖
激素、性腺、早期胚胎的发育、妊娠和泌乳均有一定
的影响 [ 10]。
本研究首次利用实时荧光定量 PCR技术,探讨
了 Ghrelin在小梅山猪不同发育阶段生殖轴中的表
达模式,为进一步研究 Ghrelin在小梅山猪生殖调控
中的作用打下基础。
参 考 文 献
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2011年第 2期 覃晓琳等 :小鼠可溶性 PD1的克隆、真核表达及生物学活性检测
得到可溶性 mPD1蛋白,经 Western b lo tting检测证
实其有表达,并通过混合淋巴细胞增殖作用反映了
重组蛋白 mPD1具有生物学活性, 为进一步研究分
泌性 mPD1对动物肿瘤治疗的效果奠定了基础。
参 考 文 献
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