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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
两株真养产碱杆菌部分基因的
克隆与序列分析
姚四新1 赵淑秋1 李学斌1 王丽荣1 王宪文1 陈仕钧1 张兆沛1
王青1 刘兴友1 刘金华2
(1河南科技学院动物科学学院，新乡 453003;2中国农业大学动物医学院，北京 100094)
摘 要: 采用随机引物 PCR技术从新建细胞培养室空气中获得两段长度 414 bp及 450 bp的片段。通过克隆测序及序
列分析，结果表明，所测序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性分别高达 79% － 83%及 79% － 84%，由其推导的氨基酸
序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性高达 86． 4% － 89． 1%，由两分离菌株所获得基因片段推导的氨基酸序列之间的
同源性高达 98． 1%，从而确定所分离两菌株为真养产碱杆菌不同亚型的菌株。
关键词: 真养产碱杆菌 随机 PCR 基因克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Part Gene of Two Strains of
Cupriavidus metallidurans
Yao Sixin1 Zhao Shuqiu1 Li Xuebin1 Wang Lirong1 Wang Xianwen1
Chen Shijun1 Zhang Zhaopei1 Wang Qing1 Liu Xingyou1 Liu Jinhua2
(Henan Institute of Science and Technology，College of Animal Science，Xinxiang 453003;
China Agricultural University，College of Veterinary Medicine，Beijing 100094)
Abstract: The PCR products of length of 414 bp and 450 bp were derived from air of new cell culture room by using random
PCR，and were cloned into pGEM-T vector for sequencing and analysis． Results showed that the identity of the nucleotide sequence of
obtained genes between HN09 and HN10 strains and other Cupriavidus metallidurans reference strains were from 79% －83% and
79% －84%，respectively，and the identity of the deduced amino acid sequences of obtained genes between HN09，HN10 strains and
other Cupriavidus metallidurans reference strains were from 86． 4% － 89． 1% ． The present study indicated that these two strains may be-
long to different subtypes of Cupriavidus metallidurans．
Key words: Cupriavidus metallidurans Random amplified polymorphic DNA(RAPD) Gene clone Sequence analysis
收稿日期:2010-07-25
基金项目:国家自然科学基金项目(30972202) ，河南科技学院院级重点项目(2010012)
作者简介:姚四新，男，博士，副教授，研究方向:动物分子病毒学;E-mail:32147857@ sina． com
通讯作者:刘兴友，E-mail:lxy63@ hist． edu． cn
近年来的研究认为真养产碱杆菌(Alcaligenes eu-
trophus)为革兰氏阴性菌，可产生丰富的聚-β-羟基丁
酸(PHB) ，而该物质可降解的生物塑料特性为当今
社会白色污染的困扰解决了燃眉之急，由此引起了
世界各国的极大关注。目前对该菌的基因结构已有
相关报道［1，2］，随着对该菌基因结构研究的深入，有
望对这一有着极大潜力的细菌产生极大的关注。
PHB作为一种天然高分子聚合物，具有无刺激性、
生物可降解性、无免疫原性、组织相容性和生物相容
性等特殊性能，在医用手术缝合线、骨科、药物缓释
控释系统及组织工程领域获得成功的应用。PHB
对环境无任何污染，有良好的生物降解性，其分解产
物可全部为生物利用;是一种可完全分解的热塑性
塑料，其熔融温度为 175 － 180℃，它的分子结构及
物理性质与聚丙烯(PP)很类似，如拉伸强度、结晶
度、摩尔质量和软化点等，目前主要应用于工业、包
2011 年第 4 期 姚四新等:两株真养产碱杆菌部分基因的克隆与序列分析
装、医疗及农业等领域［3，4］。笔者在进行细胞培养
及核酸提取的过程中意外地获取两株真养产碱杆菌
的部分基因，并对其进行了基因的克隆及序列分析。
1 材料与方法
1． 1 材料
新建细胞培养室空气。RNA /DNA 提取试剂
盒、TaqTM HS、E． coli JM109、pMD18-T、RNase Free
Water、dNTPs、凝胶 DNA 快速纯化回收试剂盒
(TaKaRa Agarose DNA Purification Kit Ver． 2． 0)购自
大连宝生物公司;随机引物 S60 购自上海生物工程
公司。
1． 2 DNA的提取及随机 PCR扩增
参照姚四新等［5］的方法。
1． 3 随机 PCR产物的克隆测序及序列分析
取 150 μL PCR产物经琼脂糖电泳，切取大小为
400 及 450 bp 左右条带回收后，以合适比例与
pMD18-T载体相连接，转化感受态细菌 E． coli JM109，
挑取经 PCR 和酶切鉴定的阳性克隆，在 ABI377 型
全自动测序仪上进行序列测定。利用互联网上的
Blast软件将所测序列与 GenBank 数据库进行比对，
以确定其同源性。
2 结果
2． 1 随机 PCR扩增
将提取的 DNA，以随机引物 S60进行 PCR扩增，
其 PCR产物在琼脂糖凝胶上出现若干条带(图 1)。
1． Marker DL2000;2． HN09 菌株;3． HN10 菌株;
M． Marker DL2000
图 1 HN09 及 HN10 菌株随机 PCR产物
2． 2 PCR产物的克隆测序
将 400 bp 及 450 bp 左右(图 1 箭头所示)的
PCR产物纯化后与 pMD18-T 载体连接，转化 JM109
菌株，并经鉴定后送大连宝生物工程有限公司进行
序列测定，所测序列如图 2 所示。
图 2 测序结果
2． 3 所测序列及其推导的氨基酸序列的同源性
分析
在 GenBank数据库中进行检索，结果见表 1，发
现 HN09 及 HN10 菌株所测序列与 Cupriavidus met-
allidurans的不同菌株具有高度的同源性，同源率分
别为 79%－83%、79%－84%(表 1，表 2)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
表 1 HN09 菌株基因在 GenBank中同源性比较结果
GenBank编号 同源菌株 最大分值 总分值 覆盖率(%) E值 同源率(%)
CU633749． 1
Cupriavidus taiwanensis str．
LMG19424 chromosome 1，complete
genome
320 320 83 4e-84 83
AM260479． 1
Ralstonia eutropha
H16 chromosome 1
320 320 84 4e-84 83
CP000352． 1
Cupriavidus metallidurans
CH34，complete genome
239 239 84 1e-59 79
Ralstonia taiwanensis = Cupriavidus taiwanensis
表 2 HN10 菌株基因在 GenBank中同源性比较结果
GenBank编号 同源菌株 最大分值 总分值 覆盖率(%) E值 同源率(%)
AM260479． 1
Ralstoniaeutropha
H16 chromosome 1
429 429 99 7e-117 84
CU633749． 1
Cupriavidus taiwanensis
str． LMG19424 chromosome 1，
complete genome
414 414 98 2e-112 83
CP000090． 1
Ralstonia eutropha
JMP134 chromosome 1，
complete sequence
342 342 99 9e-91 80
CP000352． 1
Cupriavidus metallidurans
CH34，complete genome
315 315 99 2e-82 79
Ralstonia taiwanensis = Cupriavidus taiwanensis
应用 DNAstar7． 0 软件进行分析发现，HN09 及
HN10 菌株所测序列各包括一个 ORF，该 ORF 编码
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白水解酶的一部分，由此推导
的氨基酸序列二者之间的同源率为 98． 1%，二者与
参考菌株的同源率均为 86． 4% － 89． 1% (表 3)。
HN09 菌株所测片段与 HN10 比较，在 61 － 99 bp 位
置间有 39 个碱基发生了缺失;HN09 菌株所测片段
与 Ralstonia eutropha H16 chromosome 1 比较，在
352 － 357 bp 位置间有 6 个碱基发生了突变，在
362 － 363 bp 位置有 2 个碱基发生了变异同时或
缺失 3 个碱基;在其他区域还存在较多的点突
变;HN10 菌株所测片段与 Ralstonia eutropha H16
chromosome 1 比较，在 391 － 396 bp 位置间有 6
个碱基发生了突变，在 401 － 403 bp 位置有 2 个
碱基发生了变异同时或缺失 3 个碱基;在其他区
域还存在较多的点突变。
表 3 HN09 及 HN10 菌株所得基因与其他参考
菌株对应基因推导的氨基酸序列同源性比较
1 2 3 4 5 6
1 98． 1 88． 3 89． 1 87． 4 86． 4
2 2． 0 88． 3 89． 1 87． 4 86． 4
3 11． 7 11． 7 98． 0 90． 3 92． 2
4 10． 8 10． 8 2． 0 92． 1 93． 1
5 13． 9 13． 9 10． 4 8． 4 91． 3
6 14． 0 14． 0 8． 2 7． 3 8． 2
1． HN10;2． HN09;3． AM260479． 1;4． CU633749． 1;5． CP000090． 1;
6． CP000352． 1;对角线以上为相似性(%) ，对角线以下为遗传
距离
将 HN09 及 HN10 分离株所得基因与参考菌株
对应基因的氨基酸序列进行遗传进化树的绘制与分
析，结果(图 3)表明，HN09 及 HN10 分离株所测基
因推导的氨基酸序列归属不同的分支。
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2011 年第 4 期 姚四新等:两株真养产碱杆菌部分基因的克隆与序列分析
图 3 HN09 及 HN10 菌株所得基因与其它
参考菌株氨基酸序列的遗传进化树
3 讨论
本试验采用随机 PCR 技术从细胞培养室的空
气中获得两个基因片段，经分析为真养产减杆菌的
部分基因，目前国内主要开展的研究集中在针对真
养产减杆菌培养条件的研究［6，7］，姚四新等［5］和王
宇等［8］进行了有关酞亚胺酶基因结构的研究。国
外学者 Pohlmann 等［9］研究的结果表明真养产减杆
菌(Ralstonia eutropha H16)的全基因包含染色体 1
号(4 052 032 bp)及染色体 2 号(2 912 490 bp)编码
6 116 个蛋白。本试验获取的基因片段编码胰蛋白
酶样丝氨酸蛋白水解酶的部分序列与 Pohlmann A
等获取的片段比较同源率达 88%，推测两者间存在
一定的亲缘关系。本研究分离的真养产碱杆菌其血
清分型及主要特性还有待进一步研究。
参 考 文 献
［1］Reinecke F，Steinbüchel A． Ralstonia eutropha strain H16 as model
organism for PHA metabolism and for biotechnological production of
technically interesting biopolymers． J Mol Microbiol Biotechnol，
2009，16(1-2) :91-108．
［2］York GM，Lupberger J，Tian J，et al． Ralstonia eutropha H16 Encodes
two and possibly three intracellular poly［D-(-)-3-hydroxybutyrate］
depolymerase genes． Journal of Bacteriology，2003，185 (13) :
3788-3794．
［3］刘宝全，蒋本国．聚 β羟基丁酸(PHB)的研究进展．大连民族学
院学报，2000，1(4) :15-20．
［4］苏涛，周河治，梁静娟． 微生物合成可降解塑料聚羟基链烷酸
(PHA) ，工业微生物，1997，27(3) :37-48．
［5］姚四新，赵淑秋，王宪文，等．应用随机 PCR 方法鉴定一株真养
产碱杆菌．生物技术通报，2010(12) :222-225．
［6］吕嘉枥，韩迪．一株真养产碱杆菌增菌条件的研究．生物学杂志，
2007，24(2) :41-43．
［7］于平，励建荣．真养产碱杆菌发酵生产 PHB的培养条件优化．中
国食品学报，2007，7(1) :59-63．
［8］王宇，张英姿，丁久元，等． 真养产碱杆菌 112R4 酰亚胺酶基因
的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达．微生物学报，2002，
42(2) :153-162．
［9］Pohlmann A，Fricke WF，Reinecke F，et al． Genome sequence of the
bioplastic-producing“Knallgas”bacterium Ralstonia eutropha H16．
Nat Biotechnol，2006，24(10) :1257-1262．
(责任编辑 马鑫)
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