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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
应用随机 PCR方法鉴定一株真养产碱杆菌
姚四新1  赵淑秋1  王宪文 1  王丽荣 1  赵朴 1  陈仕钧 1
张兆沛1  王青 1  刘兴友 1  刘金华 2
( 1河南科技学院动物科学学院,新乡 453003; 2中国农业大学动物医学院,北京 100094 )
  摘  要:  采用随机引物 PCR技术从新建细胞培养室空气中获得一段长 414 bp的片段,通过克隆测序及序列分析, 结果
表明所测序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性分别高达 79% - 83% ,由其推导的氨基酸序列与真养产碱杆菌主要参
考菌株的同源性高达 86
4% - 89
1% ,从而确定所分离菌株为真养产碱杆菌。
关键词:  植物 真养产碱杆菌  随机引物  随机 PCR
Identification of theGenome of an Isolate ofCupriavidusmetallidurans
Using Random PCR
Yao S ix in
1  Zhao Shuqiu1  W ang X ianwen1  W ang L irong1  Zhao Pu1  Chan Shijun1
Zhang Zhaopei
1  W ang Q ing1  L iu X ingyou1  L iu J inhua2
(
1
H enan Institute of Science and T echnology, College of Animal Science, X inx iang 453003;
2
China Agricultural University, College of Veter inaryM edicine, Beijing 100094)
  Abstrac:t  The PCR product o f leng th o f 414 bp was de riv ed from a ir of new cell culture room by using random PCR, and w as
cloned into pGEMT vec to r for sequenc ing and ana lys is. Results showed that the identity o f the nuc leo tide sequence o f obta ined gene
betw een HN09 isolate and o therCup riavidus m etallidurans refe rence stra ins w ere from 79% - 83% , the identity o f the deduced am ino
acid sequence o f obta ined gene be tw een HN09 iso la te and other Cup riavidus m etallidurans refe rence stra ins we re from 86
4% -
89
1% . The present study ind ica ted that HN09 iso latem ay be am em ber o fCup riav idusm etallidurans.
Key words:  P lant Cup riavidusm etallidurans Random pr im er Random amp lified po lym orphic DNA ( RAPD )
收稿日期: 20100613
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30972202) ,河南科技学院院级重点项目
作者简介:姚四新,男,副教授,兽医博士,研究方向:动物分子病毒学; Em ai:l 32147857@ s ina. com
通讯作者:刘兴友, Em ai:l lxy63@ h ist. edu. cn
真养产碱杆菌 (A lcaligenes eutrophus )是优良的
积累聚 
羟基丁酸 ( PHB )的菌种。 PHB具有良好
的生物降解性,其分解产物可全部为生物利用,对环
境没有任何污染,而且可制备优良的可降解塑料,是
解决当前危害严重的 白色污染!问题的有效措施
之一, 在农业、医药、环保、光学等领域具有广阔的应
用前景。笔者在进行细胞培养,核酸提取的过程中
意外地发现新建的细胞培养室空气中存在真养产碱
杆菌, 随即对该菌进行了随机 PCR鉴定。
1 材料与方法
1
1 材料
新建细胞培养室空气。TaK aR a Ex TaqTM HS、
E. co li JM 109、pMD18T、dNTPs、RN ase Free W a
ter、凝胶 DNA 快速纯化回收试剂盒 ( TaK aR a
Aga rose DNA Pu rif ica tion K it V er
2
0 )购自大连
宝生物公司; 随机引物 S60购自上海生物工程
公司。
1
2 DNA的提取
取装有 1
5 mL生理盐水的 EP管开口于新建
细胞培养室操作台上, 室温放置 10 m in。按照
RNA /DNA提取试剂盒 (M in iBEST V ira l RNA /DNA
Ex tract ion K itV er
3
0)的说明书操作。
1
3 随机 PCR扩增
1
3
1 随机 PCR引物设计  因为随机引物 PCR
2010年第 12期 姚四新等:应用随机 PCR方法鉴定一株真养产碱杆菌
不需要特异引物, 选择引物时亦不能按已知 DNA
序列进行设计合成, 所以任何 DNA序列均可用
rPCR方法扩增出 rPCR指纹图。关于引物的碱基数
目,从理论上讲, 引物越短, 造成与模板错配的机会
越多, 因而显示的指纹图条带越多,依据这一原则选
用长度为 10 bp的随机引物。
1
3
2 PCR反应  在 0
2 mL M icrotube管中配制
下列混合液,同时设空白对照, 成分如下: 上述 DNA
提取物 4
5 L, 10 ∀ PCR Buffer # 5 L, dNTP M ix
ture( 10mmo l /L each) 2 L,随机引物 2 L, TaKaR a
ExTaq
TM
HS ( 5 U /L) 0
5 L, RNase Free ddH2O
36 L共 50 L。反应程序: 94∃ 5m in; 94∃ 1m in,
35∃ 2m in, 72∃ 2 m in, 共 40个循环; 最后于 72∃
延伸 10 m in。反应产物用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定
1
3
3 琼脂糖凝胶电泳  称取 2
0 g琼脂糖, 加入
200mL 1 ∀TAE缓冲液,混匀后, 用微波炉加热使琼
脂糖完全溶解,冷却至 50∃ - 60∃ , 然后加入 5 L /
100mL Go ldview,混匀后倒入电泳倒胶槽中,凝胶厚
度在 3- 5mm。电泳时加入 1 ∀TAE缓冲液,用 6 ∀
Load ing Buffer稀释样品, 每个样品点样 5 L,同时
加入 DNA M arker DL2000为标准分子量对照。以
5 V /cm用 100V的恒压, 电泳 30- 40m in。用凝胶
成像系统观察结果并拍照保存。
1
4 随机 PCR产物的克隆测序及序列分析
取 150 L PCR产物经琼脂糖电泳,切取目的条
带回收后 ,以适当比例与 pMD 18T载体相连接,
转化感受态细菌 E. coli JM 109,挑取经 PCR和酶
切鉴定的阳性克隆 , 在 AB I377型全自动测序仪
上进行序列测定。利用互联网上的 B last软件
将所测序列与 G enB ank数据库进行比对, 以确
定其同源性。
2 结果
2
1 随机 PCR扩增
经上述方法处理后提取的 DNA, 以随机引物
S60进行 PCR扩增,其 PCR产物在琼脂糖凝胶上出
现若干条带 (图 1)。
1. M ark er DL2000; 2. HN09
图 1 HN09基因随机 PCR产物
2
2 随机 PCR产物的克隆测序
将 400 bp左右的 PCR产物纯化后与 pMD18T
载体连接, 转化 E. coli JM 109, 挑取白色菌落, 小提
质粒后经 PCR鉴定及 E coR%酶切鉴定后, 挑取阳
性克隆进行序列测定,所测序列如图 2。
ACCCGGTCACGATGTGGGTGACTTCCGGCCGACCTTGTACTTGCAGACCATTCGGACAATCAATTCAAGCTCTTTTGTTT
TCATTTTCAGCCCAAACTCCAATATGTTGCGCCGCTTCTGGCTGTTCTTTGCCCAGGCCGTCACAGTTGTGCTGGCCATC
TGGTTTGTCGTGGCGACATTGAAACCGGAATGGCTGCAACGCGGGCGCGTCGCGGTCCAATCCGGTTCGCCAATCGTCGC
GCTCAAGGAAGTGGCGCCAAATGTCACCGGACCGTCGGCGGAACGCTCGTATAGCGAGGCGGCGCAGTTGGCGATGCCGG
CGGTGGTCAATATCTTCACCAGCAAGAACGGTGCGCGGCGCGGCAATCCACAGGCCGACGATCCGTGGTTCCGCTTCTTC
TTCGGTGACCGGGT
带下划线的序列为随机引物序列及其反向互补序列
图 2 测序结果
2
3 所测序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析
在 GenBank数据库中进行检索, 发现所测序列
与 Cupriavidusmetallidurans的不同菌株具有高度的
同源性,同源率达 79% - 83% (表 1)。
进一步的序列分析表明, 所测序列包括一个
ORF, 由该基因推导的氨基酸与参考菌株的同源性
为 86
4% - 89
1% , 见表 2, 与 Cupriavidus taiw anen
sis str. LMG19424 chromosome 1比较,在 352- 357 bp
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
表 1 随机 PCR克隆序列在 GenBank中同源性比较结果
G enB ank登录号 同源菌株 最大分值 总分值 覆盖率 (% ) E值 同源率 (% )
CU633749
1 Cupriav idus ta iw an ensis str. LMG19424
chrom osom e 1, comp lete genom e
320 320 83 4 e84 83
AM260479
1 R alstonia eu tropha H 16 ch rom osom e 1 320 320 84 4 e84 83
CP000352
1 Cupriav idu s me ta llidurans CH 34,
com p lete genom e 239 239 84 1 e59 79
  Ra lston ia ta iw anen si s = C upriavidu s taiwan en sis
位置间有 6个碱基发生了突变,在 362 - 366 bp位
置有 5个碱基发生了变异或缺失; 在其它区域还存
在较多的点突变。
表 2 HN09株 S60基因与其它参考菌株对应基因
推导的氨基酸序列同源性比较
1 2 3 4
1 88. 3 86. 4 89. 1
2 11. 7 92. 2 98. 0
3 14. 0 8. 2 93. 1
4 10. 8 2. 0 7. 3
  1. S60; 2. AM 2604791; 3. CP0003521; 4. CU6337491;
  对角线以上为相似性 (% ) ,对角线以下为遗传距离
将 HN09分离株的 S60基因与参考菌株对应基
因的氨基酸序列分别进行遗传进化树的绘制与分
析,结果表明分离株 HN09所测基因 (图 3)归属不
同的分支。
图 3 HN09株 S60基因与其它参考菌株
氨基酸序列的遗传进化树
3 讨论
目前, 细菌的基因序列分析正成为微生物鉴定
和分类的重要内容之一。了解一株细菌的基因结构
将有助于对其进行鉴定、分类甚至分型,这对于那些
用传统方法鉴定存在困难或争议的细菌尤为重要,
本研究中的细菌就是一例。该细菌是从新建细胞培
养室空气中分离而来, 形态学、血清学、理化特性资
料未能明确该细菌是何种, 因此测定细菌的基因序
列可能有助于明确细菌的分类。因此有必要采用一
种能够扩增未知序列的方法对该细菌的基因进行扩
增、克隆和分析。采用随机引物对未知微生物基因
进行扩增, 不失为一种有效方法 [ 3- 5]。由 Reyes和
K im
[ 6]于 1991年建立的 SISPA ( sequence independ
ent sing le primer amp lification)技术, 需要在 DNA模
板钝末端连接一非对称引物,经过若干循环的变性、
退火和延伸后,模板的数量得到扩增, 后经克隆、测
序、分析得到基因序列, 也是一种很好的方法, 但由
于复杂的操作环节,限制了其应用。A llander、Zhang
等 [ 7, 8 ]采用改良的 SISPA技术测定了未知微生物的
序列,研究证实应用这一方法对于不同类型和来源
的微生物均有良好效果, 所获得的微生物全基因序
列大小从 3- 15 kb不等。
由 HN09菌株 S60基因序列分析及系统进化树
分析结果表明分离株 HN09与其它参考菌株的亲缘
关系较远。目前针对真养产碱杆菌培养条件的研究
较多 [ 9, 10] ,但有关基因的研究较少, 本研究分离的
真养产碱杆菌与相关报道的基因差异较大 [ 11 ] ,其血
清分型及其主要特性还有待进一步研究。
参 考 文 献
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