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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
Scribble在原肠期鸡胚表达的研究
徐涛1 林艳青1 王晓钰1 吴婷1 韩哲1 张希敏1 杨雪松2 王丽京1
(1广东药学院血管生物学研究所，广州 510006;2暨南大学医学院组胚系 再生医学教育部重点实验室，广州 510632)
摘 要: 旨在研究极性脚手架蛋白 Scibble(Scrib)在原肠期的表达及意义，明确 Scrib在早期鸡胚发育中的作用。以含
有全长人 Scrib的质粒 pEGFP-N2-Scrib作为模板克隆出 N端一段 770 bp左右的片段，从而构建一个新的质粒 pSPT18-Scrib;以
pSPT18-Scrib为模板进行体外转录制备 cRNA探针;并采用原位杂交的方法用此探针检测鸡原肠胚各个时期 Scrib 的表达情
况。结果显示，Scrib在鸡胚四期开始逐渐在原条顶端及两侧的外胚层表达，并随着发育过程向外胚层两侧蔓延扩散，并且在
发展到十期时呈现包括神经管和体节在内的广泛的弥散性表达。Scrib的表达规律提示在胚胎发育早期 Scrib 对外胚层细胞
迁移和分化以及而后的器官发生起到重要的作用，为进一步研究 Scrib在鸡胚早期发育中的作用提供参考。
关键词: Scribble cRNA 探针 原肠期 原位杂交
Exploring Scrib Gene Expression Pattern in Chick Gastrulation
Xu Tao1 Lin Yanqing1 Wang Xiaoyu1 Wu Ting1 Han Zhe1 Zhang Ximin1 Yang Xuesong2 Wang Lijing1
(1 Institute of Vascular Biological Sciences，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006;
2Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632)
Abstract: To study the polarity scaffold protein，Scribble(Scrib) ，which play an important role in chick gastrula development，we
systematically inspected expression pattern Scrib gene in early chick embryo，mainly focused on gastrulation period，using in situ hybrid-
ization． A 770 bp fragment from existing plasmid pEGFP-N2-Scrib was cloned to construct another plasmid pSPT18-Scrib． We transcript
human Scrib RNA in vitro from pSPT18-Scrib to prepare cRNA probe． We detected Scrib expression in each gastrula periods in whole
mount situ hybridization． The results showed that Scrib expressed from primitive streak stage 4(HH4)． Firstly，we found its expression
in anterior primitive streak，and then extended from primitive streak to margin region in ectoderm，and its expression appears with the
dispersed distribution in HH7 Stage． Scrib expression expressed in early chick embryo gastrulation，which suggest that Scrib might be in-
volved in fundamental biological process such as cell migration，cell differentiation and organogenesis．
Key words: Scrib cRNA probe Gastrulation In situ hybridization
收稿日期:2011-03-09
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871304，30971493，31071054)，国家重点基础研究发展计划(“973项目”)(2010CB529702)
作者简介:徐涛，男，硕士研究生，研究方向:胚胎发生发展机制;E-mail:xutao402@ 163. com
通讯作者:王丽京，女，教授，硕士生导师，E-mail:wanglijing62@ yahoo. com. cn;杨雪松，男，教授，博士生导师，E-mail:yang_xuesong@ 126. com
Scribble(Scrib)最初是 David Bilder等［1］在研究
果蝇的上皮组织的顶端基底膜蛋白定位机制中发现
的，结果显示 Scrib的缺失突变导致细胞形态发生改
变和上皮组织的单层结构遭到破坏。Scrib 是一种
极性脚手架蛋白，属于 LAP 蛋白家族的一员，在果
蝇中 LAP家族极性蛋白有 3 个成员，分别是 Scrib-
ble、Dlg(Drosophila melanogaster Discs large)和 Lgl
(Lethal giant larvae)。Scrib 结构上含有 16 个富含
亮氨酸(LRRs)结构域和 4 个 PDZ 结构域［2］，它主
要表达在脊椎动物上皮细胞的紧密连接和无脊椎动
物的分隔连接中［3］。在功能上 LRRs结构域和调节
Ras家族信号有关，而 PDZ 结构域和膜蛋白、细胞骨
架蛋白的相互作用有关［4，5］。Scrib已经被证实作为
一种重要的极性基因在发育过程中起到很重要的作
用，这种功能在脊椎动物和无脊椎动物中得到普遍
证实。在卵子发生中，Scrib 和 Dlg 在卵泡上皮细胞
前后端的功能分化决定卵母细胞的分化命运。
Scrib，Lgl，Dlg 在卵细胞中缺失导致胚胎躯干过度延
2011 年第 7 期 徐涛等:Scribble在原肠期鸡胚表达的研究
长提示 Scrib 等在胚胎管腔形成中发挥很重要作
用［6］。同时也发现 Scrib 缺失会导致细胞过度增
殖，引起肿瘤形成并促进肿瘤的转移。
鸡胚作为一种良好的试验研究模型，不仅具
有易于获得和培养周期短的优点，更重要的是它
能够很容易地在体外进行培养，便于对其进行基
因操作和进行药物干预;而且可以进行时实观察。
以鸡胚作为研究模型来观察原肠胚发育中基因调
控尤为方便，体外培养 20 h 即可达到原肠期。在这
个时期初期，原条出现是一个重要的标志，同时也标
志着中胚层开始形成，各种器官原基开始分化发育。
有研究［7，8］表明原肠期出现的大量细胞运动与极性
蛋白的调节有关。Scrib 作为一种极性基因是否在
这个过程中发挥关键性作用，首先要弄清楚鸡胚原
肠胚各个时期 Scrib的表达谱，表达程度及表达规律
是如何，只有清楚地了解这些，才能进一步用基因操
作手段干预并进一步探索 Scrib的重要作用。
1 材料与方法
1. 1 材料
含有全长人 Scrib 基因的质粒 pEGFP-N2-Scrib
由上海中科院生物化学与细胞生物学研究所牛晓峰
赠送;Taq酶 Pyrebest，感受态细胞 DH5α 购于大连
宝生物公司;限制性内切酶购于 New England Biola-
bs;地高辛标记 RNA试剂盒(SP6 /T7)、碱性磷酸酶
标记的地高辛抗体及 NBT /BCIP 显色试剂购于
Roche公司;质粒提取和质粒纯化试剂盒购于北京
天根生化科技有限公司;引物合成及质粒测序由 In-
vitrogen公司完成。
1. 2 方法
1. 2. 1 合成引物 选取人 Scrib 编码区的 540 －
1 310区域片段作为构建片段，设计引物:上游引物
为 5-ATGAGGATCCATCTGGGAGGCAACGA-TCTG-
3，下 游 引 物 为 5-TATAGAATTCGAGAGGCTC-
CCCTGCTGCCC-3，进行 PCR 得到片段长度为 770
bp;用 EcoRⅠ和 BamH Ⅰ分别双酶切回收的 PCR
片段和 pSPT18 载体，并分别电泳回收;用 T4 DNA
连接酶快速连接。将此连接产物转化大肠杆菌
DH5α 株感受态细胞，挑取阳性克隆进行扩增培
养，小量提取质粒，再根据目的片段本身的酶切位
点和 pSPT18 的多克隆酶切位点，选用 EcoRⅠ和
BamHⅠ进行双酶切鉴定，鉴定结果正确之后再进
行测序验证。
1. 2. 2 地高辛标记 Scrib反义 RNA探针的合成
将鉴定结果正确的阳性株扩增后提取的质粒用限
制性内切酶 BamHⅠ进行酶切，使其完全线性化。
回收酶切片段，作为合成反义 RNA 探针的模板。
按 Roche地高辛标记试剂盒说明书用 T7 转录酶进
行体外转录，合成地高辛标记的反义 RNA 探针;
并用 RNA纯化试剂盒纯化探针产物并电泳鉴定;
纯化的 Scrib 反义探针加入 1 mL 杂交液保存在
－ 20℃。
1. 2. 3 原位杂交 孵育已经受精的鸡蛋按照孵育时
间不同得到所需的原肠胚各时期的鸡胚。取出鸡胚
于 4%多聚甲醛中 4℃固定过夜;在切盘中切下各期
胚胎，用 PBS 洗 3 × 5 min，后用 PTW(0. 1% Tween-
20 /PBS)洗 3 × 5 min，再胚胎分别过 25%、50%、
75%、100%甲醇 /PTW 各 5 min，最后存于 100%甲
醇于 － 20℃储存备用。待试验需要时再按 75%、
50%、25%甲醇 /PTW 分别洗 5 min，PTW 洗 3 × 5
min，PTW/杂交液(1∶ 1)洗 7 min，杂交液洗 10 min，
更换一次杂交液 65℃孵育至少 2 h;80℃ 5 min灭火
探针，加入探针 65℃孵育过夜。吸出探针，65℃预
热后杂交液洗 3 × 5 min，2 × 30 min，65℃ 预热
TBST /后杂交液(1∶ 1)20 min，TBST 3 × 5 min，TBST
2 × 30 min，封闭液封闭 2 h以上，4℃ anti-DIG(1∶
1 000封闭液)孵育过夜;TBST 洗 3 × 5 min，TBST
3 × 1 h，AP 2 × 10 min，显色根据显色效果及需要
显色时间不同。
2 结果
2. 1 PCR扩增目的片段及对构建好的质粒双酶切
鉴定
pSPT18 是一个含有 SP6 和 T7 启动子，能够体
外转录插入片段的载体。将构建好的质粒载体(图
1)pSPT18-Scrib进行 BamH I 和 EcoR I 双酶切，电
泳结果(图 2)显示条带大约在 750 bp 左右，与之前
选取的片段相比稍小，可能的原因是 Marker 标记不
够准确。为了进一步验证此片段是选取的 770 bp
的 Scrib片段，将其送去测序，发现序列一致，说明载
体构建成功可以进行下一步试验，进行体外转录合
成反义 Scrib探针。
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图 1 载体 pSPT18-Scrib的构建图 图 2 质粒 pSPT18-Scrib双酶切鉴定
PS． Primitive streak;HN． Hens Nod;HP． Head process;NT． Neural tube;SM． Somite;Bar = 500 μm
图 3 原位杂交方法检测 Scrib在早期鸡胚中的表达
2. 2 鸡原肠胚各个时期 Scrib原位杂交结果
Scrib mRNA与反义探针结合，探针与连上碱性
磷酸酶的地高辛抗体结合在碱性磷酸酶的催化下使
底物变成蓝紫色。图 3 分别显示的是 HH4、HH5、
HH6和 HH10 4个时期的原位杂交图，在 4 期可以看
到显色最早出现在原条顶端上，且显色较浅，5 期的
Scrib表达原条从前端向后端呈现增强趋势，并且开
始在原条两侧有了表达。到达 6 期晚期时，可以看到
整个胚胎都有一定程度的染色，在 10期更证实了 Scrib
表达呈广泛趋势。在鸡胚早期的前端发育与心脏、神
经管和体节等的发育有关，这从一定程度上反映可能
Scrib在这些过程中可能发挥比较重要的作用。
2. 3 鸡原肠胚各个时期原位杂交切片结果图
从图 4 可以整体上了解到 Scrib 在鸡原肠胚时
期的表达情况，但是更微观的水平上不能确定 Scrib
表达在何种细胞中。为了在细胞水平上更加清楚地
了解 Scrib在鸡胚中的表达分布情况，对整体鸡胚进
行了原位杂交切片。从图 3-A和 B中可以看到 4 期
Scrib刚开始表达主要分布在外胚层，而且表达有比
较浅的染色，表达比较局限在原条两侧的外胚层。
到达 10 期则可以看到在整个切片上都有不同程度
的染色，包括神经管和体节。在原肠胚后期中胚层
和外胚层分化发育成器官原基，例如神经管的上皮
来源于外胚层。
3 讨论
已有研究显示 Scrib 复合物的极性涉及在不同
的细胞、器官以及生物过程中调节细胞迁移［9，10］。
在果蝇胚胎中 Dlg和 Scrib一起突变会因为细胞迁移
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2011 年第 7 期 徐涛等:Scribble在原肠期鸡胚表达的研究
HN． Hens nod;PS． Primitive streak;NT． Somite;NT． Neural tube;BL． Blood island;EC． Ectoderm;EN． endoderm;SE． Mesoderm;Bar = 500 μm
图 4 Scrib在早期鸡胚三胚层中的表达
受影响而导致完全背部闭合的缺陷。在哺乳动物中也
得到了类似的结果，circletail 小鼠和 rumz 小鼠的基因
中均有 Scrib 突变，这两种小鼠都会有神经管闭合缺
陷、腹壁缺陷等表型。在斑马鱼胚胎发生中，Scrib对胚
胎发生的聚敛发散和 nVII神经元的迁移是必须的［11］。
同时在病理条件下也发现 Scrib 的缺失会在疾病
进程中发挥作用。干扰 Scrib在人乳腺上皮癌的表达，
发现它能引起细胞迁移能力降低，进一步发现由于缺
少 Scrib而导致上皮细胞板状伪足的缺陷及细胞骨架
的定位缺陷。同时有研究表明，Scrib缺失的MDCK(马
－达二氏犬肾)细胞有类似于间充质细胞迁移增加的
行为，但降低了这种细胞的黏附和定向性，展示了 Scrib
有诱导 EMT(上皮和间质转化)的现象。
但 Scrib在细胞迁移中的行为具体如何发生的
现在还不是很清楚。本研究选用鸡胚作为研究模型
能够较好地观察细胞的迁移行为。运用原位杂交的
手段清楚地了解到了 Scrib 在鸡胚 4 期开始逐渐在
原条顶端及两侧的外胚层表达，并随着发育过程向
外胚层两侧蔓延扩散，并且在发展到 10 期时呈现包
括神经管和体节在内的广泛的弥散性表达。Scrib
的表达规律提示在胚胎发育早期 Scrib 对外胚层细
胞迁移和分化以及而后的器官发生起到很重要的作
用。这对于进一步研究 Scrib 在鸡胚早期发育中的
作用提供参考。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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