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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):137-141
黄 鳝（Monopterus albus）， 隶 属 硬 骨 鱼 纲
（Osteichthyes） 辐 鳍 亚 纲（Actinopterygii） 合 鳃 目
（Synbranchiformes） 合 鳃 科（Symbranchidae） 黄 鳝
属（Monopterus）。其整个发育史的表现是首先发育
为雌性个体，待发育成熟，排卵后性逆转为雄性个
体，具有典型先雌后雄的性腺发育过程［1］，是研究
鱼类性别调控机制的良好模式动物。黄鳝因其性腺
发育的特殊性，一直以来都是科研工作者的研究热
收稿日期 ：2015-06-10
基金项目 ：广西师范大学实验室管理创新与技术革新项目（2014GJ02），上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心基金资
助项目（ZF1206）
作者简介 ：蒋骄云，男，实验师，研究方向 ：鱼类性别调控分子机制 ；E-mail ：jiangjiaoyun007@163.com
通讯作者 ：曲宪成，男，副教授，研究方向 ：水生动物生理学 ；E-mail ：xcqu@shou.edu.cn
地高辛标记的黄鳝 F64 基因 cRNA 探针的制备及其
应用
蒋骄云1  田文斐3  冯龙4  曲宪成2
（1. 广西师范大学生命科学学院，桂林 541004 ；2. 上海海洋大学水产与生命科学学院，上海 201306 ；3. 桂林理工大学博文管理学院，
桂林 541006 ；4. 泗阳县水产技术指导站，泗阳 223700）
摘 要 ： 以黄鳝 F64 基因序列为模板设计引物，扩增用于 cRNA 探针合成的模板，构建 F64/pGM-T 重组质粒并线性化，利
用 RNA 聚合酶体外转录合成正、反义 cRNA 探针，并对其进行地高辛标记，利用原位杂交方法检测 F64 基因在黄鳝性腺发育过程
中的表达变化情况。结果显示，正义探针未检测到阳性信号，反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达，于 V 期性腺开
始表达。研究结果表明，体外转录法可以有效合成 cRNA 探针，制备的 cRNA 探针可以准确检测 F64 基因的时空表达。
关键词 ： 黄鳝 F64 基因 ；性腺发育 ；cRNA 探针 ；原位杂交
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.022
Preparation and Application of cRNA Probe Labeled with Digoxingenin
for Gene F64 of Rice Field Eel
JIANG Jiao-yun1 TIAN Wen-fei3 FENG Long4 QU Xian-cheng2
（1. College of Life Sciences，Guangxi Normal University，Guilin 541004 ；2. College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean
University，Shanghai 201306 ；3. Bowen College of Management，Guilin University of Technology，Guilin 541006 ；4. Siyang Fisheries
Technical Service Center，Siyang 223700）
Abstract: The specific gene primers were designed based on the sequences of gene F64 of rice field eel，then the templates for
synthesizing the cRNA probe were amplified，then recombinant F64/pGM-T plasmids were constructed and linearized by restriction enzymes，
further the sense and anti-sense cRNA probes were synthesized by in vitro transcription with RNA polymerase，and finally labeled with
Digoxigenin. The expression changes of gene F64 during the gonadal development of rice field eel were detected by in situ hybridization.
According to our results，the expression was only detected by the anti-sense F64 cRNA probe，and the earliest signal was observed in stage
V of ovarian，but no more in early stage of ovarian formation. Our study indicated that the cRNA probes can be synthesized using in vitro
transcription，and the cRNA probes prepared in this study can be used for accurately detecting the spatial and temporal expression of gene F64.
Key words: gene F64 of rice field eel ；gonadal development ；cRNA probe ；in situ hybridization
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3138
点之一。为了探知黄鳝性别调控机制，国内外学者
开展了大量的研究。在内分泌调控方面，周秋白等［2］
分析了产卵和未产卵黄鳝雌二醇（E2）的变化特征，
结果表明 E2 水平对黄鳝性腺发育起重要作用，浓度
的降低是黄鳝启动性逆转的前提。郭威等［3］的研
究结果显示黄鳝血清 E2 在黄鳝间期性腺发育到雄性
过程中显著下降，而 T（睾酮）则显著上升，表明
激素在黄鳝性腺发育中扮演重要角色。在分子调控
机制方面，芳香化酶是生物体内 C19 雄激素转化为
C18 雌激素的关键条件因子［4］，与大多数硬骨鱼类
一样，黄鳝中芳香化酶基因（CYP19）具有两种不
同的拷贝，分别为 cyp19a1a 和 cyp19a1b，进一步分
析表明这两个基因在黄鳝性逆转过程中呈现多态性
表达，可能在黄鳝性逆转过程中起到一定作用［5-7］。
JUK1 为促丝裂原活化蛋白激酶家族成员，Xiao 等［8］
研究表明该基因对黄鳝性逆转起重要作用。WT1 基
因（wilms’tumor suppressor gene） 和 哺 乳 动 物 性
腺发育相关，胡青等［9］克隆了黄鳝 WT1 基因并分
析其在性腺发育过程中的表达，结果显示该基因在
黄鳝雌性、间性和雄性性腺中的表达量在各时期都
有先升高后降低的表达趋势。何智等［10］探究了黄
鳝卵巢初次发育成熟及相关基因的表达分析，发现
amh 基因可能与卵巢青春期启动相关。
本实验室之前的研究成功构建了黄鳝性逆转过
程中抑制差减文库［11］并对文库中的部分基因进行
了克隆和表达分析［12，13］，但均未取得突破性进展，
黄鳝性逆转相关机制尚未完全明确。进化史上鱼类
处于较为原始的地位，其遗传力小于高等动物，因
此探究黄鳝性别调控基因应从其自身的基因组中寻
找。F64 基因作为抑制差减文库筛选到的性别调控
候选基因之一，同源性分析显示，无同源性基因视
为新报道基因［14］。此外，未见其他相关报道。因此，
对该基因的表达情况分析具有重要意义，将为进一
步探究其功能提供重要依据。本研究以已成功克隆
的性别调控相关基因 F64［14］部分序列为模板，构建
F64/pGM-T 重组质粒并线性化，用 RNA 聚合酶体外
转录合成正、反义地高辛标记的 cRNA 探针，通过
原位杂交方法检测 F64 基因在黄鳝性腺发育过程中
的表达情况，旨为明确该基因在黄鳝性逆转过程中
的功能奠定基础，同时为类似研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 实验用黄鳝购置于农贸市场，用
颈椎切断法处死黄鳝，采集性腺（50-100 mg），液
氮速冻后，-80℃保存备用。
1.1.2 主要试剂 Trizol Regent 购自 Invitrogen 公司 ；
RT-PCR Kit、RNase inhibitor、Oligo（dT）18、Taq 酶、
Apa I 内切酶、Sac I 内切酶、T7 RNA 聚合酶、SP6
RNA 聚合酶和 DNase I 购自 TaKaRa 工程有限公司
（ 日 本 ）；pGM-T 载 体、DH5α 感 受 态、TIANprep
Midi Plasmid Kit 和 TIANquick Midi Purification Kit
购自天根生化科技（北京）有限公司 ；DIG RNA
labeling mix（10×）购自 Roche 公司（瑞士）；其他
试剂为国产分析纯 ；所需引物均由上海生工生物工
程有限公司合成。
1.1.3 F64 引 物 上 游 引 物 ：5-AGGACAGGTTTA-
CGGGTGAG-3 ；下游引物 ：5-CCAGTATTCCCTCA-
TAGACC-3。
1.2 方法
1.2.1 性腺组织总 RNA 的提取 取 -80℃保存的性
腺样本，于 1.5 mL 离心管，加入 1 mL Trizol 试剂，
匀浆至无明显组织颗粒，室温静置 5 min ；加入 200
μL 氯仿，充分混匀，4℃ 12 000 r/min 离心 15 min ；
取上清 500 μL 于新离心管，加入 600 μL 异丙醇，
静置 10 min，4℃ 12 000 r/min 离心 10 min ；弃上清，
75% 乙醇洗涤 ；自然干燥，加适量 DEPC-H2O，室
温自然溶解沉淀，检测 RNA 含量及完整度，-80℃
保存备用。
1.2.2 逆转录及 PCR 扩增 以上一步提取的 RNA，
按照 RT-PCR 试剂盒说明书，合成 cDNA 第一链 ；
根据已经获得的 F64 基因序列设计一对引物，用于
cRNA 探针模板的合成。PCR 反应体系为 ：cDNA 第
一 链 1 μL、 上 下 游 引 物 各 1 μL、10×PCR buffer 2
μL、dNTP 1.6 μL、ddH2O 13.3 μL、Taq 0.1 μL。PCR
反 应 程 序 为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，
72℃ 30 s，30 个循环 ；72℃ 3 min ；4℃保存。
1.2.3 F64/pGM-T 重组质粒的制备 将 PCR 产物纯
化后与 pGM-T 载体 16℃连接过夜，连接体系为 ：
DNA 2 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、T4
2016,32(3) 139蒋骄云等：地高辛标记的黄鳝 F64基因 cRNA探针的制备及其应用
DNA Ligase（3 U/μL）1 μL、pGM-T 1 μL、灭菌水 5
μL ；转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，在含有 7 μL
IPTG 和 40 μL X-Gal 的 LB 固体培养基平板培养过夜；
于超净工作台上，挑取白色菌落接种于盛有约 1 mL
LB 液体培养基（含氨苄青霉素，浓度为 100 μg/mL）
的 2 mL 离心管中，37℃，220 r/min 摇床过夜培养 ；
菌液 PCR 验证为目的片段后，送上海生工测序 ；将
阳性克隆菌液 10 μL 加入到 50 mL LB 液体培养基过
夜培养。
1.2.4 质 粒 提 取 及 线 性 化 根 据 TIANprep Midi
Plasmid Kit 试剂盒说明书进行质粒的提取 ；分别用
Apa I 和 Sac I 限制性内切酶将质粒线性化，体系为 ：
DNA（质粒）2.5 μg、内切酶 2.5 μL、buffer 5 μL、加
灭菌水至 50 μL，37℃中反应 2 h ；按照 TIANquick
Midi Purification Kit 试剂盒将线性化的质粒纯化。
1.2.5 cRNA 探针的合成 向 0.2 mL 离心管中加入
正、反义 cRNA 探针合成所需试剂，T7 RNA 聚合
酶 反 应 体 系 为 ：模 板 500 ng、10×T7 buffer 2 μL、
DTT 2 μL、DIG RNA labeling mix（10 mmol/L）1 μL、
RNase Inhibitor 0.5 μL、T7 RNA 聚 合 酶 1 μL、 加
DEPC-H2O 至 20 μL ；SP6 RNA 聚合酶反应体系为 ：
模板 500 ng、10×SP6 buffer 2 μL、DTT 2 μL、0.1%
BSA 2 μL、DIG RNA labeling mix（10 mmol/L）1 μL、
Rnase Inhibitor 0.5 μL、SP6 RNA 聚 合 酶 1 μL、 加
DEPC-H2O 至 20 μL ；将上述离心管混匀后，于 37℃
中哺育 2 h ；取 1 μL 进行电泳检测 ；具体步骤按照
T7 和 SP6 RNA 聚合酶试剂盒的说明进行。对合成成
功的 RNA 探针进行纯化 ：于所合成的探针离心管中
加入 10 U（2 μL）的 DNase I（RNase-free），37℃哺
育 30 min 消化 DNA 模板 ；向上一步离心管中加 1/10
体积 4 mol/L LiCl 和 1/4 体积无水乙醇（在 -20℃预
冷），混合均匀，-20℃下静置 2 h ；4℃条件下 12 000
r/min 离心 15 min ；吸净上清，用 70% 乙醇（V/V，
DEPC-H2O 配置，-20℃预冷）清洗一次，12 000 r/min
离心 5 min ；小心吸净上清，倒置于干净环境中至沉
淀干燥 ；在 RNA 沉淀中加入 30-50 μL DEPC-H2O 让
沉淀自行溶解，加入 1 μL RNA inhibitor（20 U）；电
泳检测 RNA 的完整性，分光光度计检测浓度，分
装 -20℃保存备用。
1.2.6 F64 原位杂交分析 黄鳝各期性腺样本进行
组织切片的制备并进行杂交前预处理 ；将地高辛标
记的 cRNA 探针和组织切片 55℃杂交过夜 ；杂交后
进行漂洗，滴加 Anti-DIG-AP 于切片上，处理 2 h，
最后每片切片覆盖 100 μL 显色液，黑暗环境下显色
2 h，封片，镜检分析，具体步骤参照之前研究［12］。
2 结果
2.1 总RNA提取及cRNA探针模板RT-PCR扩增
总 RNA 提取电泳结果（图 1）显示，28S RNA
和 18S RNA 条带清晰，亮度比接近 2∶1，无其他
DNA 污染条带及明显降解条带，说明整个提取过程
合理，RNA 完整性较好。经 RT-PCR 扩增，电泳结
果（图 2）显示 600 bp 左右的单一条带，符合预期。
28S
18S
2000
bp
750
500
100
M F64
图 1 黄鳝性腺总 RNA 1.2% 琼脂糖凝胶电泳图
M ：DL2000 DNA Marker ；F64 ：cRNA 探针模板
图 2 cRNA 探针模板 PCR 扩增电泳图
2.2 重组质粒的提取及线性化
将验证正确的阳性克隆扩大培养，用于质粒的
提取。结果（图 3）显示，质粒大部分为超螺旋状
态，处于 2 000 bp 左右，说明质粒提取效果较好 ；
限制性内切酶酶切后均为单一条带，片段长 3 400
bp 左右，线性化完全，结果符合预期。
2.3 体外转录合成F64 cRNA探针
以线性化的质粒为模板，在 T7 和 SP6 RNA 聚
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3140
分研究者都是简单的利用其他动物已知的基因去寻
找鱼类性别调控基因，均未取得突破性的进展，从
鱼类本身的基因组去筛选性别调控基因是最为有效
的方法之一［16］。原位杂交技术是目前检测基因表达
最为有效的手段之一，相比寡核苷酸探针和 DNA 探
针，cRNA 探针具有更强的特异性［17］。cRNA 探针
合成最常用的方法是体外转录法，它具有以下优点：
以线性化质粒 DNA 为模板可反复转录生成 RNA 探
针，合成量大 ；较低水平的转录，也可与超大量的
mRNA 形成互补稳定的杂交二聚体，探针活性高 ；
转录起始于目的 DNA 上游启动子，终止于限制性内
切酶酶切末端，定位精确 ；无需考虑外显子和内含
子问题，方法简单易行［18］。
我们致力于寻找黄鳝性逆转过程中起关键作用
的基因，本实验室之前成功构建了黄鳝性逆转抑制
差减文库［11，19］，筛选到了部分与黄鳝性别调控相
关基因。为进一步分析差异表达基因（F64）的功
能，本研究体外转录合成 cRNA 探针，并检测其表
达情况。结果显示所合成探针均为单一条带，且能
有效检测基因的表达，即该方法有效可行。原位杂
交结果显示 F64 基因于卵巢发育早期不表达，排卵
的后期表达，间期性腺表达量有增高的趋势，表明
该基因可能随着卵巢的败育和精巢的发育启动表达。
Liu 等［7］对黄鳝芳香化酶基因 P45011β 进行表达分
析，该基因于卵巢不表达，精卵巢启功表达，精巢
表达量显著提高 ；与之相反，P450arom 基因主要
于卵巢表达，精卵巢组织显著降低，精巢组织微量
表达。芳香化酶是生物体内催化性激素合成的关键
酶，其在硬骨鱼类的性别调控中起重要作用。而本
研究显示 F64 基因的表达模式和芳香化酶基因具有
类似情况，是否与黄鳝性腺发育激素调节相关，需
要进一步分析。综上所述，F64 基因具有与黄鳝精
巢组织发育正相关的表达模式，与黄鳝的性别调控
相关，其具体功能需进一步研究。本研究为进一步
探究 F64 的功能奠定基础，同时为其他鱼类研究提
供参考。
4 结论
本研究体外转录合成了地高辛标记 cRNA 探针，
原位杂交结果显示 F64 基因于卵巢发育早期不表达，
4000
bp
3000
2000
1000
M Z A S
M ：1kb DNA Marker ；Z ：重组质粒 ；A ：Apa I 单酶切 ；S ：Sac I 单酶切
图 3 重组质粒及线性化电泳图
合酶的作用下，用体外转录的方法，合成正义和反
义探针 ；探针纯化后均为单一条带，长度在 600 bp
左右，符合预期大小（图 4）。
M ：DL1000 DNA Marker ；A ：反义探针 ；S ：正义探针
图 4 体外转录合成 cRNA 电泳图
1000
bp
700
500
100
M A S
2.4 原位杂交分析
以正义探针为对照，反义探针杂交结果与前期
研究结果一致［14］，该基因性腺发育早期不表达，IV
期卵泡和早期卵泡均未检测到阳性信号（图 5-B）；
排卵的 V 期卵巢开始表达，V 期卵泡和 VI 期卵泡均
有 F64 基因表达 ；精卵巢表达量明显高于排卵期卵
巢，即随精巢组织发育表达量有增高趋势（图 5）。
3 讨论
在脊椎动物系统进化中，鱼类处于承前启后的
关键地位，其性别决定研究一直是繁殖生物学领域
的研究热点。然而由于鱼类的特殊生活方式，其性
别决定机制十分复杂，目前为止只在少数鱼类中，
如青鳉鱼（Oryzias latipes）发现了性别决定候选基因
DMY［15］，大多数鱼类还处于较模糊状态。黄鳝具有
先雌后雄的性逆转现象，其基因组较小，只有 600
Mb，是研究鱼类性别调控的良好模式动物。近些年
来研究者开展了大量黄鳝性逆转相关研究，但大部
2016,32(3) 141蒋骄云等：地高辛标记的黄鳝 F64基因 cRNA探针的制备及其应用
后期启动表达，与黄鳝性别调控相关。
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（责任编辑 马鑫）
IV
Sense Anti-sense
A
IV
B
V
C
V
D
VI
E
VI
F
SG
Odv
Odv
G
SG
H
IV，V，VI ：分别为对应各时相卵泡 ；SG ：精原细胞 ；Odv ：未成熟的卵泡 ；
A，C，E，G ：为各期性腺正义探针杂交结果 ；B，D，F，H ：为各期性腺
反义探针杂交结果
图 5 F64 基因原位杂交分析