全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
棉花高频体细胞胚胎发生及再生体系建立
顾冉冉 薛金教 袁英歌 彭明 崔百明
(石河子大学生命科学学院石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子 83200 )
摘 要: 棉花的体细胞胚胎发生率低, 限制了转基因棉花的发展。为了扩大可再生棉花的基因型, 发展新疆优质棉花
的特点, 以新疆的主要栽培品种新陆早 33为材料, 以下胚轴为外植体, 使用葡萄糖,麦芽糖作为主要碳源, 用 Phytage l固化,对
不同激素的浓度组合和培养条件进行探索,对棉花胚性愈伤的诱导到体细胞胚胎的发生阶段进行优化, 体细胞胚胎成熟以后
进行萌发培养可以获得正常的植株。通过试验证明, 有利于棉花的愈伤组织生长的激素浓度为 KT 01 mg /L,
2, 4D 0 1 m g /L,下胚轴的中部诱导愈伤形态最好。体细胞胚胎发生阶段以 KT, IBA组合, 以低盐培养基进行子叶胚的成苗,
建立了再生体系。
关键词: 棉花 体细胞胚胎 再生植株 组织培养
H igh Efficiency of Somatic Embryogenesis and P lant Regeneration
from Cotton(Gossypium hirsutum L. )
Gu Ranran Xue Jinjiao Yuan Y ingge PengM ing Cui Bami ing
(K ey Laboratory of A griculture and B io technology, Co llege of Life Sciences, Shihez i University, Shihezi 832000)
Abstrac:t Low effic iency o f som atic embryogenesis of Cotton, wh ich lim its the developm ent o f genetically mod ified co tton. In o r
der to expand renew ab le co tton geno types and develop the characteristics of h ighquality cotton in X injiang, the m a in cultiv ar of X in
jiang X inluzao 33 fo rm ater ia ls, the fo llow ing axes as exp lants, using g lucose, m altose as the ma in carbon source, w ith Phy tagel cure,
the concentration o f d iffe rent ho rmones to exp lore the composition and culture cond itions fo r em bryogen ic ca llus induc tion of co tton to
the occurrence o f som atic embryos to optim ize stag es, som atic em bryos m atured fo r ge rm ina tion o f cu ltured p lants ge t norma .l By stud
y ing the ev idence in favor of cotton callus grow th horm one concen tration KT 0 1 m g /L, 2, 4D 0 1 mg /L, the centra l part of hypoco tyls
ca llus induction the best shape. In the som a tic em bryogenesis stages, KT, IBA po rtfo lio togetherw ith lowsa lt med ium for coty ledon em
bryo into a seedling, established a regene ration system.
Key words: Gossyp ium h irsutum L. Som atic em bryogenesis Regeneration T issue cu ltu re
收稿日期: 20100329
基金项目:转基因重大专项 ( 2008ZX08005) ,兵团博士基金 ( 2007 JC08)
作者简介:顾冉冉,女,硕士生,从事植物基因工程研究; Em a i:l grr615@ 163. com
通讯作者:崔百明, 博士, Em ai:l bm cu i_2006@ yahoo. com. cn
新疆是我国最大的优质棉生产基地, 棉花是新
疆农业生产的主导产业, 在新疆国民经济中占有重
要的地位。近年来许多研究证明, 以棉花胚性愈伤
组织为受体进行遗传转化,是高效、简易的转基因途
径之一 [ 1- 3]。开展棉花体细胞胚胎发生的研究工
作,对于拓宽棉花种质资源和培育棉花品种具有重
要意义 [ 4] ,前提是要建立新品种的高频率的体细胞
胚胎发生及再生体系。
1979年, P rice和 Sm ith[ 10]首次报道了从克劳茨
基棉花的细胞悬浮培养中获得了体细胞胚, 为棉花
再生植株的获得奠定了基础。随后, Dav idon is和
H am ilton
[ 11]采用陆地棉 Coker 310子叶愈伤组织,
在改良的 LS培养基上继代培养 2年后,获得了体细
胞胚并再生出植株,这是棉花植株再生的首次报道。
之后又已经有多种培养体系产生 [ 12- 21] , 这些研究在
世界范围内大大推动了棉花体细胞培养技术的发展
和再生植株的研究。
棉花再生过程大体可以分为 3个阶段:愈伤组
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织的诱导和增殖, 体细胞胚形成和植株再生。愈
伤组织的诱导和增殖常用的培养基为 MSB, 也有
用 MS、LS、BT和W hite等培养基,而体细胞胚萌发
和植株再生则常用 SH 培养基。培养基中一般添
加 Ge lrite和 Phytagel做固化剂, 以葡萄糖为碳源。
在愈伤组织诱导过程中附加的激素有: 2, 4D、ZT、
IAA、KT、NAA、6BA、2 ip、TDZ、GA 3、BR等, 其中
2, 4D、IBA、KT、IAA、ZT最常用。体细胞培养在棉
花组织培养中占重要的地位, 可以被应用在棉花
种质保存、突变体的筛选、原生质体培养以及遗传
转化等方面, 奠定了棉花体细胞育种的基础 [ 5]。
组织培养过程中, 植物体细胞胚胎发生的频率
往往较低, 特别是从胚性愈伤组织中诱导体细胞胚
时,畸形胚的比率较高。本研究主要是选择新疆陆
地棉早熟品种进行再生体系的建立, 探讨了快速诱
导体细胞胚胎发生的过程,减少畸形苗,获得再生植
株,为进一步的转基因棉花打下基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
棉花材料来源于陆地棉 ( Gossyp ium hirsu tum
L. )新疆陆地棉早熟品种 33。
12 棉花无菌苗的获得
种子经硫酸脱绒后, 在 70%乙醇溶液中消毒 1
m in,用无菌水冲洗 3- 4次, 然后 10% 过氧化氢溶
液消毒 20m in,再用无菌水冲洗 3- 4次, 然后种植
在 1 /2MS+ 0. 6%琼脂粉 (W /V )培养基上, 于 ( 28
1) ! 下暗培养 4 d左右,然后在光照下培养 2 d,获
取无菌苗。
13 棉花愈伤组织的诱导和继代培养
取无菌苗下胚轴为外植体, 切成 05 cm的小
段,平放于 MS1- M S4, 30 d左右将愈伤组织转移
到 MS培养基,不加激素进行增殖。所用培养基 pH
均为 5. 8, 并以 115! 高压灭菌 15 m in,所有氨基酸
在灭菌前加入, 激素在灭菌后加入。除无菌苗培养
外, 所有培养物均于 ( 28 1 ) ! , 光照强度 (冷光
源 ) 135 mol/ (m2 s), 每天光照 14 h的条件下进
行培养。愈伤诱导的培养基如表 1。
表 1 愈伤组织诱导培养基的组成
培养基 基本成分 pH 值
MS1
MS无机盐 + B5有机物 + 01mg /L 2, 4D+ 01mg /L
KT+ 091 g /L M gC l2 6H 2O+ 3% (W /V ) glucose +
025% (W /V ) Phytagel
5. 8
MS2
MS无机盐 + B5有机物 + 005 m g /L 2, 4D + 005
mg /L KT+ 091 g /L MgC l2 6H2O+ 3% (W /V ) glu
cose+ 025% (W /V ) Phytagel
5. 8
MS3
MS无机盐 + B5有机物 + 01 m g /L 2, 4D + 01
mg /L KT + 01 mg /L IAA+ 091 g /L M gC l2 6H 2O
+ 3% (W /V ) glucose + 025% (W /V ) Phytagel
5. 8
MS4
MS无机盐 + B5有机物 + 005 m g /L 2, 4D + 005
mg /L KT + 005mg /L IAA + 091 g /L M gC l2 6H 2O
+ 3% (W /V ) glucose + 025% (W /V ) Phytagel
5. 8
MSB. MS salts, B5 v itam ins; KT. k in et in; 2, 4D. 2, 4D ich lorophenoxy
acet ic acid; IAA. 3Indoleacetic acid
14 棉花胚性愈伤培养基
然后选择颜色淡黄松散细小颗粒状的愈伤转移
到 MS5MS8培养基上继续继代培养,每 3- 4周继
代 1次,直至胚的分化。诱导胚性愈伤组织的产生,
选用 MS培养基, 添加 KNO3 19 g /L, 高浓度的 KT
和低浓度的 2, 4D进行胚性愈伤的诱导,所选用的
培养基如下表 2。
表 2 诱导胚性愈伤发生的MS5MS8培养基
培养基 基本成分 KT
(m g/L)
2, 4D
( mg /L )
G ln
( g/L)
A sn
( g /L )
MS5
MS6
MS7
MS8
MS无机盐 + B5
有 机物 + KNO3
19 g /L+ 091 g /L
MgC l2 6H2O +
3% (W /V ) Glu cose
+ 025% ( W /
V ) Phytagel
0 0 1 05
01 001 1 05
005 001 1 05
01 005 1 05
G ln. glu tam in e; Asn. asparagines
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2010年第 8期 顾冉冉等: 棉花高频体细胞胚胎发生及再生体系建立
15 棉花体细胞胚胎发生培养基
将胚性愈伤组织转入分化培养基上进行分化,以
MS(MS无机盐 KNO3加倍, 去掉 NH4NO3 )培养基为
基础,附加谷氨酰胺 10 g /L,天冬酰胺 05 g /L,及不
同的激素和碳源 (表 3)将在诱导胚性愈伤培养基上
连续继代 3次的胚性愈伤组织分别转入这 MS9-
M S12培养基,以 MS9培养基为对照。每种培养基 5
次重复,每重复继代 1瓶, 每瓶继代 ( 200 10)mg胚
性愈伤组织。继代培养至 1个月时考察各培养基单
位重量 ( g)胚性培养物中各类型体细胞胚的数量和胚
性愈伤的生长量。
表 3 诱导体细胞胚发生的M S9MS12培养基
培养
基 基本成分
KT
( mg /L)
IBA
(m g /L)
ABA
(m g /L)
M altose
( g/L)
Glu cose
( g /L)
M S9
M S10
M S11
M S12
MS 无 机 盐
(KNO3 加倍,去
掉 NH4NO3 ) +
B5 有机物 +
0. 91 g/L MgC l2
6H2O+ Gln 1 g /
L+ Asn 05 g /L
+ 0. 25% (W /
V )Phytagel
0 0 01 15 15
015 05 01 15 15
01 05 01 15 15
05 0 01 15 15
IBA. Indole3butyric acid; ABA. Abscis ic
16 体细胞胚胎的萌发及植株再生
经过 3- 4次继代以后,选择形态正常的子叶胚
进行萌发和植株的再生, 选择 1 /2M S培养基, 附加
活性炭,以琼脂和凝胶为固化剂进行不同处理,长到
3- 5片真叶的时候移栽,进行成苗。
2 结果与分析
2. 1 愈伤组织诱导
将无菌苗棉花剪成小段平铺在培养基上在愈伤
组织诱导培养基上培养 14 d左右,下胚轴的两端开
始膨大,有少量的愈伤形成 (图 1A )。在继续培养 1
个月以后,几乎所有的外植体周围都形成了愈伤组
织,而且愈伤的量比较多,大部分呈现一种松散的浅
黄色愈伤 (图 1B )。通过选用不同的培养基发现愈
伤的出愈率和形态也是有差异的 (表 4)。在愈伤诱
导的初期,添加 KT和 2, 4D各 01 mg /L,能够达到
100%的愈伤出愈率,而且颜色浅黄疏松,没有侧根的
形成。加入 IAA的培养基,愈伤出愈率相对降低,由
于部分下胚轴出现生根的现象,愈伤的形态有部分的
绿色质地紧密的愈伤,从而影响了愈伤的形态。
表 4 棉花在MS1MS4培养基上的愈伤组织诱导率和形态
培养
基
外植
体数
产生愈伤的
外植体数
愈伤组织
率 (% )
愈伤颜色
质地
MS1 121 242 100
浅黄 疏松 无侧根的
形成
MS2 127 232 9133 浅黄 疏松 无侧根的形成
MS3 109 165 75. 6
黄白 紧密 有侧根的
形成
MS4 105 148 704 绿色 紧密 有侧根的形成
每株无菌苗的下胚轴均切成几个小段,产生愈伤的外植体数是培
养一个月以后的愈伤的数量,按照下胚轴的两端计算
2. 2 愈伤的增殖和胚性愈伤的诱导
一般认为浅黄色疏松的愈伤组织, 容易再生,因
此在愈伤组织培养 4- 6周以后,选择这种形态的愈
伤脱离下胚轴进行增殖,在不加激素的 MSB培养基
上进行 2- 3周的增殖。然后将这些愈伤转移到不
同的胚性愈伤组织诱导培养基上培养, 进过 6- 8周
的时间相继的出现形态颜色较一致的浅黄色,疏松,
颗粒状的愈伤 (图 1C ), 经过 1- 2次继代得到白色
疏松的胚性愈伤 (图 1D ), 这种愈伤有利于体细胞
胚胎的发生, 在高浓度的 KT和低浓度的 2, 4D共
同的作用下有利于胚性愈伤组织的发生。此阶段的
愈伤组织增殖速度较快, 即使是在不加任何激素处
理的情况下也保持了一种比较快的生长速度。
2. 3 体细胞胚的发生
体细胞胚胎发生这个过程是棉花组织培养的关
键步骤,如果在不加激素的 MSB培养基上持续的继
代培养是可以实现体细胞的胚胎发生,但是体细胞
胚的数量少,而且多数的胚胎停留在球形胚的阶段
(图 1E, F)。为了提高体细胞胚胎的发生频率和正
常成熟体细胞胚的数量, 通过在培养基中添加少量
的 ABA,高浓度的 IBA,低浓度的 KT,并且改变培养
基的碳源来调节培养基的渗透压来优化体细胞胚发
生的培养条件。结果显示 (表 5) ,由于在体细胞胚
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
发生的过程中,需要体细胞胚成熟的过程,并不能过
早的萌发,加入脱落酸后有利于胚的成熟,在高浓度
的 IBA,低浓度的 KT的作用下,相对于对照而言体
细胞胚的数量大大的提高了,得到的正常的子叶胚
数量也有明显的提高 (图 1G)。
表 5 不同培养基对体细胞胚发生及发育成熟的作用
培养基 球型胚的数量 /个
子叶胚的
数量 /个
胚性愈伤组织
的增殖量
M S9 62 7 + +
M S10 89 12 + + + +
M S11 85 10 + + +
M S12 80 15 + + +
体细胞胚的数量为培养 1个月后,在单位数量下胚型愈伤组织中
肉眼可见的数量,增长量根据称重用 + , + + , + + +依次增多
2. 4 体细胞胚的成熟及再生植株的产生
选择一定数量的子叶胚进行不同的处理, 观察
胚状体的成苗情况,主要是选择降低无机盐的浓度
为 1 /2M S培养基, 和改变固化剂和添加活性炭对萌
发情况的影响。结果图 2所示, 整体而言 1 /2M S
有利于胚的萌发, 但是在以琼脂粉为固化剂的培养
基上有一定程度的褐化, 有正常的根的形成 (图 2
A ),叶片呈现绿色,根的生长细长 (图 2B ) ,而以植
物凝胶为固化剂进行培养的条件下,并附加活性炭,
发现降低了子叶胚的褐化程度 (图 2C ), 植株的生
长状态在培养 1个月以后可以长出 6- 8片真叶 (图
1I), 有白色粗壮的根形成 (图 2D ), 可以进行移栽
获得正常的植株。
A.愈伤诱导培养基上 2周的形成的愈伤组织; B.培养 4周后的愈伤组织; C.愈伤增殖阶段的浅黄色疏松颗粒状愈伤; D.胚性愈伤
组织; E.体细胞胚; F.大量球形胚; G.子叶胚; H.长出 3- 5片真叶的小植株; I.小植株的生根培养
图 1 棉花体细胞胚胎发生和植株再生
A, B.无活性炭培养; C, D.有活性炭培养
图 2 培养基对再生苗的影响
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2010年第 8期 顾冉冉等: 棉花高频体细胞胚胎发生及再生体系建立
3 讨论
通过植物组织培养建立棉花的再生体系一直都
是一个耗时,且困难的过程,很多条件都影响再生体
系的建立。光照条件是影响棉花再生过程的重要因
素 [ 8, 9]。本研究在无菌苗最初培养的阶段,选择前 3
d暗培养之后的 3 d在 2 000 lx光照强度, 16 h光
照 /8 h黑暗光照周期条件下, 这样有利于得到生长
健壮的棉花下胚轴外植体, 之后在 2 000 lx光照强
度, 16 h光照 /8 h黑暗光照周期条件下诱导出了白
色、结构松散且能在分化培养基上经 2- 3次继代即
可分化形成胚性愈伤。
培养的过程中容易出现褐化, 诱导体细胞胚的
频率低且各种形态的畸形胚的数量也较多。张献龙
等的研究表明, 在分化培养基中补加 01% KC l或
者 002% CaC l2可以促进棉花愈伤组织分化成胚。
2, 4D是诱导棉花体细胞胚胎发生的重要激素 [ 6 ] ,
高浓度 KT 与低浓度 IBA也有利于诱导胚性愈伤组
织 [ 7]。能否获得高质量的愈伤组织特别是胚性愈
伤组织是棉花再生成功的关键,陆地棉品种新陆早
33号在愈伤的诱导过程中, 通过添加 KT和 2, 4D,
愈伤组织的诱导率为 100%。愈伤组织在初期诱导
及增殖阶段部分愈伤经过几次继代以后, 会出现褐
化,死亡,还有愈伤的状态趋于水渍化等, 这些都是
由于体系的激素缺乏和激素的不平衡导致。因此,
通过外源激素来调节植物的生长, 使其体内的激素
水平能够在长期的继代过程中要保持一个相对平衡
的状态。胚性愈伤的继代和培养过程中通过改变碳
源 15% (W /V ) g lucose和 15% (W /V ) maltose能够
有效地防止愈伤的褐化并能够促进体细胞胚的
发生。
本研究主要是针对体细胞胚的发生频率低进行
探索, 发现在体细胞胚的诱导阶段通过添加植物激
素 KT 10- 15mg /L, IBA 05 mg /L或者是高浓度
的 KT和低浓度的 2, 4D的比率都可以大量的诱导
得到体细胞胚。在从球形胚到子叶胚的过程中通过
添加 KT 05mg /L可以诱导产生正常的再生小植株
(图 1H ), 但是比率还是比较低, 还需进一步的探
索。小植株再生成苗的阶段通过 1 /2M S培养基附
加活性炭有利于小植株生根长成正常的再生植株,
建立新陆早 33号棉花的再生体系。
参 考 文 献
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