全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-16
作者简介:鲁卫平(1971-),男,医学硕士,主治医师,主要从事病原微生物检验诊断方面的研究
通讯作者:周元国,研究员,博导,E-mail:ygzhou@cta.cq.cn
传统的基因芯片信号报告系统如同位素、荧光素等,不同程度地存在灵敏度低,操作复杂,需特殊检测
设备,易污染等缺陷,限制了基因芯片技术在临床诊断中的应用[1]。纳米金是指直径为纳米范围的金颗粒
或含金的化合物,具有良好的生物兼容性,对其进行修饰后就能标记到特定的核酸上,作为信号报告分子
使用,化学性质稳定,且与银反应后可形成比原来体积大 106倍的黑色颗粒,可以用肉眼观察或用普通装
置记录如照相、扫描记录[2~4]。采用直径为 1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金为报告分子[5],标记待
检核酸序列,然后与芯片上的探针分子杂交,通过银染放大杂交信号,直接裸眼判定检测结果或扫描仪扫
描后进行灰度值计算。
1 材料和方法
1.1 材料
细菌菌种、真菌菌种和病毒感染血清由大坪医院检验科提供。鉴定标准按“全国临床检验操作规程”。
植物基因(苦瓜 Chi5基因)质粒转化菌 DH52:由西南农业大学生物技术中心惠赠。标准菌株:金黄色葡萄
球菌 ATCC25923、大肠埃希氏菌 ATCC25922、铜绿假单胞菌 ATCC27853。质控血清由卫生部临检中心提供。
基于纳米金的显色基因芯片快速检测病原微生物
鲁卫平 1 顾大勇 1 王华 1 安琳 2 周元国 1
(1第三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心,重庆 400042;2总装重庆军代局门诊部,重庆 400042)
摘 要: 为构建一种新型的比色芯片,以实现对临床常见感染病原微生物的快速、准确地检测和鉴定。采用纳米金
标记巯基修饰的各待检病原微生物的特异性基因片段,与相应的以各待检靶序列的特异性寡核苷酸探针构建成的基因
芯片杂交,并通过结合银染反应将杂交信号被放大形成裸眼可见的显色信息来判读检测结果。该芯片技术检测时间短,
最低检测值达100fmol/L。操作方法简单,不需要特殊设备,能部分满足临床检测的通量要求,具有很好的临床应用前景。
关键词: 纳米金 基因芯片 病原体 微生物
RapidDetectionofPathogenicMicroorganism Usinga
ColorimetricDNAChipBasedonNanogold
LuWeiping1 GuDayong1 WangHua1 AnLin2 ZhouYuanguo1
(1MolecularBiologyCenterofDapingHospitalofThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042;2Out-patient
DepartmentofChongqingMilitaryRepresentativeBureauofGeneralArmamentDepartment,Chongqing400042)
Abstract: TodevelopanovelcolorimetricDNA chipbasedonnanogold,whichaimedtodetectandidentify
pathogenicmicroorganism rapidlyandexactly.Thespecificgenefragmentsmodifiedbythioloftargetpathogenic
microorganism werelabeledbynanogold,hybridizedwithspecificoligonucleotideprobesimmobilizedonDNA chip.
Hybridizationsignalwasamplifiedbytheinteractionbetweennanogoldandsilverstainreagenttoform spotwhichcould
bedetectedwithnakedeyes.Thisgenechiphashighsensibilityandspecificityandcanbeeasilyoperatedwithout
specialdevice.Thesensitivityofthisasayreached100fmol/L.Itcanmeetthefluxdemandofclinicaldetectionandhas
goodprospectofclinicalapplication.
Keywords: Nanogold DNAchip Pathogen Microorganism
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
1.2 主要试剂
纳米金标记及银染试剂(美国 NanoprobesInc.);全部的引物、及探针(大连宝生物生物有限公司);醛基
化玻璃芯片片基(波兰 CELAssociatesInc.)。
1.3 主要实验仪器
HH.BLL500S电热恒温培养箱(上海跃进医疗仪器厂);HZS-H恒温水浴箱(哈尔滨东联电子技术开发
有限公司);MastercyclerGradientPCR仪(德国 Eppendorf);Atlas玻片杂交盒(美国 Clontech)。
1.4 引物、靶序列及芯片探针的设计
确定临床上常见的以下 12种病原体为本实验主要检测目标:金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假
单胞菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒沙门菌、白色念珠菌、乙肝
病毒和丙肝病毒,以及一个耐药基因:mecA基因。选用一段与微生物和人类无同源性的植物基因作为阳性
对照。选择经多篇文献报道并经过验证的种、型特异性基因片段为待检靶序列。参阅文献或利用 primer
premier5.0软件参照引物设计原则自行设计特异性片段扩增引物,根据各靶病原体特异性扩增片段序列,
利用 araydesigner2.0软件设计特异性寡核苷酸探针,用 omiga2.0软件进行引物、探针及扩增片段间的互
补性分析,并将序列提交 Genbank进行特异性分析。扩增引物 5′端修饰巯基,探针 5′端修饰氨基。
1.5 靶序列的扩增
扩增反应条件参照相关文献,体系组成参照试剂说明书。PCR扩增反应:引物 5′端巯基修饰,反应体系
为 50μl,反应条件为 95℃5min→(95℃30sec→55℃30sec→72℃1min)×35个循环→72℃10min。RT-PCR扩
增反应:引物 5′端巯基修饰,反应体系为 50μl,反应条件为 50℃30min→95℃2min(95℃30sec→55℃
30sec→72℃1min)×30个循环→72℃10min。
1.6 基因芯片的制备
按照图 1的排列方式制作芯片,载体为醛基修饰玻片,每个探针点 4个平行点,浓度为 1.5μmol/L,点
样量为 0.5μl/点。
1.7 芯片检测方法
1.7.1 靶核酸标记 分别取扩增产物 1μl,95℃
变性 5min,立即冰浴 5min。加入 5μl纳米金标
记试剂,充分混匀,4℃反应 6～8h。
1.7.2 芯片杂交 将标记产物加到 40μl杂交
液中,滴加于芯片探针区,盖上盖玻片,置湿盒
中,45℃杂交 2h。之后用 1×SSC+0.1%SDS的漂
洗液,20℃下漂洗 5min,再用 0.1×SSC+0.1%SDS
的漂洗液,20℃下漂洗 5min,然后室温下用 0.1
×SSC稍稍漂洗。
1.7.3 银染显色 取出芯片,滴加 60μl银染试剂于芯片上杂交反应区,盖上盖玻片使银染试剂均匀分布,
37℃反应 5～15min后用去离子水冲洗玻片,37℃空气晾干芯片后,直接裸眼判定检测结果或扫描仪扫描后
进行灰度值计算。
1.8 芯片灵敏度检测
使用氨基修饰金葡菌探针制作芯片,分别与终浓度为 10pmol/L、5pmol/L、1pmol/L、100fmol/L、50fmol/L、
10fmol/L的纳米金标记金葡菌靶核酸进行杂交,银染显色,以确定其最低检测量。
1.9 特异性检测
将含所有探针的芯片分别与不同的靶核酸杂交,银染显色,以确定每个探针的特异性。
1:金黄色葡萄球菌 2:mecA基因 3:大肠埃希氏菌 4:铜绿假单胞
菌 5:表皮葡萄球菌 6:肠球菌 7:白色念珠菌 8:伤寒沙门氏菌
9:肺炎链球菌 10:化脓性链球菌 11:脑膜炎双球菌 12:乙肝病毒
13:丙肝病毒 14:空白点样液 15:阴性对照 16:阳性对照
图 1 基因芯片点样模式
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2008年第3期
1.10临床样品检测
用芯片检测和鉴定临床样品中分离到的病原体,同时进行临床常规方法检测(细菌采用生化鉴定法,
病毒采用实时荧光定量 PCR法)。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
PCR扩增产物用 1%琼脂糖凝胶(含 EB)电泳,在紫外光照射下检测,各病原体的扩增产物片段与设计
片段大小一致,而且具有很好的特异性。
2.2芯片检测结果
2.2.1灵敏度 随着靶序列浓度逐渐降低到 100fmol/L,杂交点显色越来越弱,浓度低于 50fmol/L后,无可
见显色结果。
2.2.2特异性 所选用的探针均能检测出相应的靶序列,每张芯片上均只有与靶序列对应的探针点有显
影结果,其他探针点均无显影,背景清晰,结果可靠。
2.2.3临床样品 10个样本的检测中 9个有阳性结果,检测结果与临床常规鉴定结果一致,一个样本为
阴性结果,其常规方法检测结果为肺炎克雷伯菌,在芯片中没有相应的检测项目。因此,出现阴性结果。部
分检测结果(图 2)。
图 2 部分临床样品检测结果
1:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 2:大肠埃希菌 3:铜绿假单胞菌 4:化脓性链球菌 5:乙肝病毒 6:丙肝病毒
3 讨论
病原体的快速检测和鉴定对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要意义。从分子水平上研究生物大分
子,是微生物检测发展的趋势,既能克服以微生物表型特征为基础检测方法的缺点和影响因素,从根本上
对微生物进行鉴别和特征分型,同时又能大大缩短检测时间,提高检测灵敏度和特异性。基因芯片技术有
快速、敏感、高效和高通量等优点,将其用于微生物的快速检测与鉴定,其优势是临床常规检测技术所无法
比拟的[6]。但由于目前通用的基因芯片技术多采用荧光检测法、辣根过氧化物酶比色法等,它们不同程度地
存在或灵敏度不高、需特殊检测设备,或操作复杂、易污染等缺陷,限制了该技术的应用[7,8]。近年来,纳米分
析化学已取得许多创新性的成果,纳米粒子极强的吸附能力和良好的定向能力,特别是纳米金粒子,具有
极佳的比表面积,能大大增加固定的分子数量,其良好的生物兼容性,可与巯基之间形成很强的 Au-s共
价键,这使得纳米金可与生物活性分子结合,且不会影响生物活性分子的结构和活性,形成的探针可用
于生物体系的检测中[9,10]。采用直径为 1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金,该纳米微粒在 pH6.0~
7.0、含 20mmol/LNaH2PO4、150mmol/LNaCl、1mmol/LEDTA的缓冲液中,只能和游离的巯基反应生成稳定
的共价结合物,使核酸标记上纳米金颗粒。标记的纳米金粒子还可与纳米银粒子结合成复合物,形成比原
来体积大 106倍的黑色颗粒,将检测信号进一步放大,并且可以用肉眼观察或普通光学仪器记录。
设计采用的寡核苷酸探针,序列链短、复杂度低、分子量小,不同探针间差别小,完全杂交的时间短,杂
交条件易于控制。实验结果显示,在严格杂交条件下各探针杂交条件一致,具有较好的特异性。芯片敏感性
试验表明,该芯片检测技术最低检测值达 100fmol/L,同常用的荧光检测法相比,其灵敏度要高出 50倍(以
荧光素 cy3为报告分子的方法,其灵敏度通常在 5pmol/L或更高),这主要是由于在显色过程中,纳米银粒
子对纳米金粒子的包裹聚集,使信号被放大了 106~108倍,这是其他标记分子所不具备的独特性质。用该芯
鲁卫平等:基于纳米金的显色基因芯片快速检测病原微生物 97
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
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地域、多民族等广泛深入的协同研究。
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片直接进行临床样品检测,结果显示阳性探针点及阳性对照点均有显色结果,结果肉眼清晰可见,阴性对
照、空白对照和其他探针点均无显影结果,背景清晰,与常规经典检测鉴定结果一致。整个检测过程可在一
个工作日内完成,而常规培养加生化鉴定法一般需 2～4个工作日,因此缩短了检测时间。
芯片技术具有操作简单方便,实验条件要求不高,无污染等优点,同时检测中加入了系统的监控,包括
空白对照、阴性对照、阳性对照,阳性对照采用了一段与任何微生物无任何同源性的植物基因,并加入到待
检样本中,对整个检测过程进行了监控,确保了检测的可靠性,因此该技术具有较好的应用前景。目前,正
在优化芯片的制备工艺,改进样品制备、信号检测方法等,从而进一步简化检测步骤,缩短检测时间,使之
更能满足临床普通实验室及现场检测的需要。
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