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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 12期
微卫星标记在穿山甲个体识别中的应用
高赛飞1, 2
于冬梅 2
王莹 1
彭建军 2
( 1暨南大学生命科学技术学院,广州 510632; 2华南濒危动物研究所物种鉴定中心,广州 510260)


摘
要:
在对非法走私和捕杀穿山甲的犯罪案件研究中, 所涉及的穿山甲个体数量是量刑的重要依据, 然而对于一些
穿山甲鳞片、肉块及其深加工产品,从形态学上却无法进行个体识别。微卫星标记已证实是一种用于动物个体识别的可靠的
遗传标记。本研究从已发表的 34对穿山甲微卫星引物中筛选出 6对多态性较高的引物, 用于穿山甲鳞片的个体识别。结果
表明: 6个位点的观测值杂合度 (H o )为 0
653 - 0
234; 期望值杂合度 (H e )为 0
926 - 0
861; M JA03的 P IC最高 ( 0
918 ),
M JA13的 P IC最低 ( 0
852), 平均 P IC 为 0
884。单个座位的个体识别能力在 0
826 - 0
956之间, 累积个体识别能力为
99
9999% ,表明采用的 6个位点适用于国内穿山甲走私案中的个体识别。
关键词:
穿山甲
微卫星标记
个体识别
Application ofM icrosatelliteMarking to Individual
Identification for Pangolins (Manis spp. )
Gao Sa ifei
1, 2
Yu Dongm ei2
W ang Y ing1
Peng J ianjun2
(
1
College of L ife Sciences and T echnology, J inan University, Guangzhou 510632;
2
Identification Center for W ildlife Sp ecies,
South China Institute of Endangered A nimals, Guangzhou 510260 )


Abstrac:t
In the crim ina l cases o f poaching and sm ugg ling pango lins(M an is spp. ), the number o f ind iv idua ls invo lved is cr itica l
g ist for determ in ing the pena lty. M o rpho log ica lm ethodo log ies do not o ften w ork because the sm a ll cut parts of pango lin do not possess
the holistic distinc tive character istics of the ind iv idua.l M icro sate llite DNAs have been proved a reliablem arker fo r the ind iv idua liza tion
o f anim a ls. The DNA w as am plified by PCR w ith 6 polym oph ic m icrosate llite as the pr im erw ere se lected from 34 pub lished m icrosate l

lite loc.i The resu lts showed that a ll the 6 m icro sate llite loc i had gene tic po lym orphism s in pango lins and the po lym o rph ism info rma tion
content ( P IC ) in lo ciM JA03 w as the biggest ( 0
918) , wh ile theM JA13 w as the lowest ( 0
852). Pow er o f d iscrim ination ( DP ) va lue
o f the 6 STR loc i ranged from 0
826 to 0
956
The Cum ulate DP ( CDP ) w as 99
9999% . These results ind icate that the 6 m icro
sate l

lites can be applied to the d ifferent ind iv idua l identifica tion for pango lins.
Key words:
Pango lin
M icrosate llite ma rking
Ind iv idual identification
收稿日期: 2010
05
24
基金项目:广东省科学院优秀青年科技人才基金项目 ( 200804) , 广东省野生动物保护和利用公共实验室基金项目 ( 2009001 )
作者简介:高赛飞,女,硕士研究生,研究方向:遗传学; E
m a i:l saifei168@ 163
com
通讯作者:彭建军,博士,教授,研究方向:保护生物学及分子生态学; E
m ai:l jjPeng74@ s ina
com
穿山甲 (Manis p entadactyla )又名鲮鲤,隶属于哺
乳纲 ( M ammalia)、鳞甲目 ( Pho lido ta )、穿山甲科
(M anidae)、穿山甲属 (Manis) ,在全世界共有 7- 8
种 [ 1] ,是现存哺乳动物一个很小的类群 [ 2 ] ,主要分布
在亚洲的东部、东南部和南部,以及非洲大部分地区。
穿山甲由于其珍贵的食用和药用价值而遭到乱捕滥
猎,加上栖息地的破坏,野生种群数量急剧下降。目
前,穿山甲属于国家
级重点保护野生动物, 1994年
其所有种全部被列入 C ITES附录
, 在国家濒危动物
红皮书列为易危级 (V ) [ 3] ,存在的灭绝危险比其它任
何同级分类阶元的都要大,根据国际上分类单元优先
保护的原则,应当优先予以保护 [ 4]。
由于穿山甲特殊的分类地位和食性进化,国外常
利用其研究有胎盘哺乳动物的系统进化 [ 5- 8]。国内
2010年第 12期 高赛飞等 :微卫星标记在穿山甲个体识别中的应用
对穿山甲的研究主要集中在穿山甲作为中药的角
度 [ 9- 11]及生态保护方面 [ 12- 14]。国内将分子生物学
技术应用于穿山甲,仅见杨小军和周开亚 [ 15]利用 12S
RNA序列测定法得到了中国穿山甲的分子鉴定标记,
Zhang和 Sh i[ 16]用 19种限制性内切酶对 13只中国穿山
甲进行了线粒体 DNA RFLP分析,了解中国穿山甲的
遗传现状,发现灰色和褐色中国穿山甲遗传差异明显。
在对非法走私和捕杀穿山甲的犯罪案件研究
中,所涉及的穿山甲个体数量是量刑的重要依据。
然而对于一些不具有显著个体特征的利用穿山甲犯
罪的组织,在形态学上却无从分辨。微卫星标记已
证实是一种用于动物个体识别的可靠的遗传标
记 [ 17]。本研究拟从已发表的 34对穿山甲微卫星引
物中筛选出 6对多态性较高的引物, 用于对查获的
走私穿山甲鳞片进行个体识别 [ 18 ]。
1
材料
1. 1
样品
在 2007年 6月至 2009年 9月广州白云机场查
获的穿山甲走私案件中,每个案件取 2- 5份鳞片样
品,共 50份, - 20
保存。
1. 2
微卫星引物
参考文献 [ 19], 在已经发表的 34对马来穿山
甲引物中,选 10对通用性强,多态性相对较好的引
物,由上海生工合成, 将扩增稳定的 6对 ( M JA03、
M JA09、M JA10、M JA13、M JA 21和 M JA22) ,用于穿山
甲鳞片的个体识别,引物信息见表 1。
表 1
六对穿山甲的微卫星引物信息
引物号 序列 ( 5
- 3
) 重复单位
M JA03
DQ886448
F: TAGGTGGCAGACGATTTGCT
R: CTGAGTGAGGCTGGCTTTCT

( CA) 40
M JA09
DQ886454
F: TCTGCATAAGGTTGAAGAGCAA
R: GACAAGGCAGTGTTGCTGAA

(GT) 21
M JA10
DQ886455
F: CTAGGGTTGGGTCCTTCCTC
R: CTCAGGTGCTTTGGACTTAGG

( CA) 18
M JA13
DQ886466
F: CTGGGGATGCCCTAATTTCT
R: CACAGCACAGTTGGGATTGT

( CA) 16
M JA21
DQ886466
F: GAACCTGGGTTGGGGTAACT
R: GCAGGGTTTCTCAACTTTGG

(GT) 16
M JA22
DQ886467
F: GGATGTGGGTATCCTTGTGG
R: CCTCTCAGTGGGTGGGAGTA

( CA)
15
2
方法
2
1
基因组 DNA提取
取穿山甲鳞片腹面的皮肤组织部分, 去离子水
泡, 冲洗 4 - 5次, 使用 EZgeneTM T issues gDNA K it
( B iom iga)提取基因组 DNA。
2
2
PCR扩增
PCR扩增体系为 25
L, 其中模板 DNA 约
1
25 ng, 引物各 1
L, 1
25 U Taq 酶, 0
2 mmol/L
dNTPs, 2 mmol /L M gC l2, 加灭菌水至 25
L。反应程
序: 95
预变性 10m in, 95
变性 15 s, 60- 50
退火
30 s, 72
连接 45 s的降落 PCR,每个退火温度 2个循
环,然后分别再 95
变性 15 s, 50
退火 30 s和 72
延
伸 45 s进行 30个扩增循环,再 72
延伸 30m in[ 19]。
2
3
基因分型
PCR扩增反应产物先用 1
5%琼脂糖凝胶电泳
检测, 再取 1
L 用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶
200 V电压电泳 4 h,银染法检测电泳结果,扫描并保
存图片。
2
4
统计分析
利用 Gelpro4
5软件分析图片, 得到样品进行
判别基因型, 群体内遗传多态性分析, 采用 POP

GENG计算等位基因频率、等位基因数 (A )、杂合度
观测值 (H o )和期望值 (H e ) [ 20] , 参照文献 [ 21]计算
多态信息含量 ( P IC )。用 cervus 2
0计算个体识别
能力 ( DP)和偶合机率 ( PM )。个体识别采用遗传距
离和邻近给合法 ( Ne ighbor
joining, N J )由 Popu la

tions( 1
2
28) 和 T reeview [ 22- 24 ]完成。
3
结果与分析
3
1
6个微卫星基因座位的遗传多态性分析
根据 6个微卫星座位上的等位基因频率统计结
果, 计算了各基因座的多态信息含量、杂合度 (表
2)。由表 2可见, 6个位点的观测值杂合度 (H o )为
0
653 - 0
234; 期望值杂合度 (H e )为 0
926 -
0
861; 6 个微卫星位点中, M JA03 的 PIC 最高
( 0
918) , M JA13的 PIC最低 ( 0
852) , 平均 PIC
为 0
884。
3
2
位点个体识别能力的评估
根据各微卫星位点基因型频率计算出各位点的
的偶合机率、个体识别能力和 6个位点的累计个体识
别能力,结果见表 2。6个微卫星位点的个体识别能
155
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
力在 0
826- 0
956之间, 其中 M JA03位点个体识别
能力最强为 0
956,而 M JA13位点的个体识别能力最
小,只有 0
826。由此可见, M JA03在穿山甲个体识别
中的作用最大, M JA13在穿山甲个体识别中的作用相
对最小,这也印证了遗传标记的多态性越高, 个体识
别能力越强,反之则个体识别能力差 [ 25, 26]。6个位点
的累计个体识别能力为 99
99%, 偶合机率 ( PM )

10- 7。
表 2
六个微卫星座位上的信息
座位 多态信息含量 ( PIC) 观察杂合度 (H o ) 期望杂合度 (H e ) 偶合机率 ( PM ) 个体识别力 ( DP)
M JA03 0
918 0
6531 0
9225 0
044 0
956
M JA09 0
865 0
4600 0
8760 0
102 0
898
M JA10 0
897 0
4375 0
9047 0
059 0
941
M JA13 0
852 0
4694 0
8661 0
174 0
826
M JA21 0
862 0
2340 0
8744 0
105 0
895
M JA22 0
912 0
2800 0
9268 0
065 0
935
平均数 0
884 0
4223 0
8951 0
092 0
908
累积


10- 7 0
999999
3
3
个体识别
根据聚类分析及法医上个体识别判断的标
准 [ 27] ,本试验所用的 50份穿山甲鳞片样品大约来
自 45个个体 (图 1)。
图 1
六对微卫星引物 DC遗传距离 NJ个体聚类图
4
讨论
全世界共有 7- 8种穿山甲,在广州白云机场查
获的穿山甲案件中, 常见的主要有 3种: 马来穿山
甲、中国穿山甲和非洲穿山甲。本试验所选取的 6
对马来穿山甲微卫星引物在中国穿山甲和非洲穿山
甲中都具有较好的通用性 [ 28 ] ,然而在本次试验中仍
然存在一定的个体缺失,这可能是因为 ( 1)选择的
试验样品是穿山甲鳞片腹面的部分皮肤组织, 在取
材时大多已经风干,因此可能遗传物质含量较少且
存在一定的降解,易造成试验误差; ( 2)查获的穿山
甲鳞片中存在若干个其它穿山甲物种。为了尽量减
少试验误差,对无法扩增的样品采用多管法反复进
行 DNA的提取及扩增,以增加试验结果的可信度。
本研究中 6对微卫星引物的个体识别能力在
86
40% - 96
12% 之间, 累积个体识别能力为
99
99%,有亲缘关系的个体的基因型完全一致的概
率小于 10- 7,根据所得到的等位基因片段采用法医
上个体识别判断的标准, 即两样品的基因型完全一
致、偶合机率 ( PM )
10- 9时可作为同一个体或同卵
双生 [ 29, 30 ]。所以应该适当增加微卫星位点,有利于
更准确的进行个体识别 [ 31 ]。同时, 由于穿山甲多为
单胎,自然条件下很少有双胎 [ 12- 14] , 此方法基本能
够达到法医学上对走私案中常见 3种穿山甲个体识
别的要求。
参 考 文 献
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