全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
拟南芥冷诱导 CBF /DREB类结合因子的
克隆及其生物信息学分析
刘俊 1, 2 　蔡平钟 1 　张志雄 1 　马林 2 　向跃武 1 　张志勇 1 　王闵霞 1
(1 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 ,成都 610066; 2 西南科技大学生命科学与工程学院 ,绵阳 621000)
　　摘 　要 : 　CBF /DREB结合因子广泛存在于植物中 ,主要参与诸如干旱、高盐以及冷胁迫等相关基因的表达调控。以拟
南芥 DNA为模板 , PCR扩增出 3个冷诱导的 CBF /DREB结合因子 ,即 CBF1、CBF2及 CBF3,利用生物信息学手段对三者的
cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性 /亲水性、功能域、进化树、二级结构及 DNA保守域的三级结构
等进行了较为全面的分析。结果显示 , CBF1、CBF2和 CBF3的氨基酸序列同源性很高 ,达到 9114% ,且都属于亲水性蛋白 ,三
者在理化性质以及蛋白质二级结构乃至三级结构上也极为相似。另外 , CBF1和 CBF2都不具跨膜结构 , CBF3含有 1个跨膜
螺旋。
关键词 : 　CBF /DREB　结合因子 　克隆 　生物信息学
Clon ing and Bioinformatics Analysis of Cold2induced CBF /DREB
Binding Factor from A rabidopsis tha liana
L iu Jun1, 2 　Cai Pingzhong1 　Zhang Zhixiong1 　Ma L in2 　Xiang Yuewu1 　Zhang Zhiyong1 　W ang M inxia1
(1 Institu te of B iotechnology and N uclear Technology, S ichuan Academ y of Agicultural Sciences, Chengdu 610066;
2 College of L ife Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, M ianyang 621000)
　　Abs trac t: 　CBF /DREB type binding factors which have existed extensively in p lants, mainly participate in gene regulations such
as drought, high2salt and cold stress1By PCR amp lication of three cold2induced CBF /DREB binding factors, including CBF1, CBF2 and
CBF3 from the total DNA of A rabidopsis thaliana, three genes were obtained1The methods of bioinformatics were app lied to analyze the
cDNA sequence, sim ilarity of anm ino acid sequences, moity, physico2chem ical p roperty, hydrophobicity and hydrophilia, functional
domain, phylogenetic tree and the secondary structure and the tertiary structure of the three gene1 The results showed that CBF1, CBF2
and CBF3 that were sim ilar in physico2chem ical p roperty and the secondary structure were soluble, and had 9114% identity in am ino
acids1 Transmembrane analysis showed that CBF3 has a transbilayer helix besides CBF1 and CBF21
Key wo rds: 　CBF /DREB　B inding factor　Cloning　B ioinformatics
收稿日期 : 2008212205
基金项目 :四川省农业科学院重点研究项目“主要农作物优质、抗逆基因克隆与利用研究”(200622010) ,“利用生物信息学克隆水稻生长激素
及其结合蛋白基因的研究”项目
作者简介 :刘俊 (19842) ,女 ,在读硕士研究生 ,研究方向 :植物基因工程与作物遗传育种 ; E2mail: orchidltnr@1631com
通讯作者 :张志雄 (19562) ,男 ,研究员 ,研究方向 :作物遗传育种 ; E2mail: caipzhong@1261com1　　温带及寒带植物在低温环境下通过冷诱导机制诱导耐冷基因的表达 ,从而提高植物的耐寒性 ,增强植物体适应环境的能力 [ 1 ]。低温信号通过细胞膜上的受体激活胞内信号传递 ,激活一系列转录因子的表达。与冷诱导信号传导有关的转录因子包括 ER(ethylene2responsive element binding factor) /AP2 (AP2ETALA2)家族、bZIP ( basic2leucinezipper)家族和锌指 结构 ( Zinc finger)家族等 [ 2 ] ,而属于 AP2 家族的CBF /DREB (C2repeat binding factor/dehydrate respon2sive element binding factor)途径已被证实是赋予植物低温抗性的主效途径 [ 3 ]。CBF /DREB 转录因子家族分为干旱及高盐诱导的 DREB2小家族和冷诱导的CBF /DREB1 小 家 族 [ 4 ] , 后 者 由 CBF1 /DREB1B、CBF2 /DREB1C、CBF3 /DREB1A、CBF4 /DREB1D等组
2009年第 6期 刘俊等 :拟南芥冷诱导 CBF /DREB类结合因子的克隆及其生物信息学分析
成 ,其中 CBF4 /DREB1D是渗透胁迫诱导的 ,该信号
通路不依赖于 ABA [ 5 ] ,当植物受低温驯化后 , ICE
( inducer of CBF exp ression) 转录因子被激活 ,与位于
CB F基因上游启动子中的 ICE盒相结合 ,诱导 CB F
基因表达 [ 6 ] ,而后 CB F基因表达产物与下游一系列
COR (cold2regulated) 基因启动子中的 CRT/DRE元
件结合 ,诱导一系列抗寒基因表达 ,从而提高植物耐
冷性 [ 7 ]。
本试验利用 PCR技术成功克隆了拟南芥冷诱
导 CBF /DREB类结合因子 (CBF1、CBF2和 CBF3) ,
并对其进行了相关的生物信息学分析 ,为进一步揭
示该类基因的生物学功能提供了理论依据和实践
基础。
1　材料与方法
111　材料
11111　实验材料及试剂 　拟南芥 (A rabidopsis thali2
ana Columbia)种子、大肠杆菌 DH5α菌株等由本实验
室保存。Ex Taq酶、克隆载体 pMD182T、限制性内切
酶等均购自 TaKaRa公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒
以及质粒提取试剂盒购自 Omega公司。
11112　引物 　采用引物设计软件 Primer 510,根据
NCB I上公布的拟南芥 CB F 基因序列 (登录号 :
AF076155)分别设计 3 对引物 : 1F: 5′2CCCATGGT2
CAATGAACTCATTTTCAGC23′; 1R: 5′2CGAGCTCTT
AGTAACTCCAAAGCGACAC23′; 2F: 5′2CCCATGGACT2
TACTCTACTCTCATAAACCTT23′; 2R: 5′2CTCTAGAT2
TAATAGCTCCATAAGGACAC23′; 3F: 5′2CCCATGGAG2
CAAACCATACCAACAAAAA23′; 3R: 5′2CGGCTAGCG2
TACTAAAAATGGAAATAATAATCTGAG23′。
引物 1F、2F和 3F的 5′端加酶切位点 N co I,
1R、2R以及 3R的 5′端分别加酶切位点 S ac I、X ba I
和 N he I,画线部分标出。送 Invitrogen公司合成。
112　方法
11211　CBF /DREB 结合因子的 PCR 扩增 　用
CTAB法 [ 8 ]提取的拟南芥种苗总 DNA为模板 ,分别
以 1F和 1R、2F和 2R、3F和 3R为引物进行 PCR扩
增 ,反应程序 : CBF1: 94℃ 2 m in, 94℃ 30 s, 46℃ 30
s, 72℃ 1 m in, 34个循环 , 72℃ 10 m in; CBF2: 94℃
4 m in, 94℃ 30 s, 44℃ 30 s, 72℃ 1 m in; 34个循环
72℃ 10 m in; CBF3: 94℃ 4 m in, 94℃ 30 s, 45℃ 30
s, 72℃ 1 m in, 34个循环 , 72℃ 10 m in。用 1%琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR产物。
11212　目的基因的连接、转化以及酶切鉴定　将目的
片段分别割胶回收 ,并与克隆载体 pMD182T于 16℃水
浴中连接过夜 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,进行
蓝白斑筛选 ,挑取白色单菌落活化培养 ,提取质粒 ,用
双酶切法鉴定阳性重组子 ,并将其分别命名为
pMD18T2CBF1、pMD18T2CBF2以及 pMD18T2CBF2。将
通过初步鉴定的质粒送上海 Invitrogen公司测序。
11213　CBF基因的生物信息学分析 　利用 NCB I
中的 ORF Finder软件进行开放阅读框的识别 , CDD
( conserved domain database)进行蛋白质保守结构域
分析 [ 9 ] ;用 ClustalX软件进行氨基酸序列的比对及
进化树的生成 ; ExPASy在线分析蛋白质结构及理化
特性 [ 10 ] ;在线预测蛋白质的二级结构 ( http: / / np sa2
pbilibcp1fr / ) [ 11 ] ; SW ISS2MODEL进行保守区域的三
维结构分析 [ 12 ]。
2　结果与分析
211　目的基因的克隆
以拟南芥总 DNA 为模板 ,分别用 1F /1R、2F /
2R和 3F /3R这 3对引物进行扩增 ,得到位于 750 bp
左右的 3条片段 ,如图 1所示 ,与预期结果相符。
M31 Marker 3; 1, 21引物为 1F和 1R的 CBF1 PCR扩增产物 ; 3, 41引
物为 2F 和 2R 的 CBF2 PCR 扩增产物 ; 5, 61引物为 3F 和 3R 的
CBF3 PCR扩增产物
图 1　CBF1、CBF2及 CBF3的 PCR电泳图
212　重组质粒的酶切鉴定
目的基因经回收、连接、转化、筛选后 ,提取质粒
并进行双酶切鉴定 ,分别得到约为 700 bp、750 bp及
760 bp左右的片段 ,如图 2所示 ,与预期结果相符 ,
表明重组子构建成功。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
M21 Marker DL2000; 11重组质粒 pMD18T2CBF1 N co I和 Sac I双酶切
产物 ; 21重组质粒 pMD18T2CBF2 N co I和 X ba I双酶切产物 ; 31重组
质粒 pMD18T2CBF3 N co I和 N he I双酶切产物
图 2　重组质粒的双酶切鉴定图
213　核苷酸及氨基酸相似性分析
测序结果显示 (图 3) : CBF1、CBF2及 CBF3分别
含 659 bp、728 bp和 776 bp,除 CBF1编码 213个氨基
酸 , CBF2和 CBF3均编码 216个氨基酸 ,它们与 Gen2
Bank上公布的核苷酸序列及所编码的氨基酸相似性
都达到了 99%。氨基酸序列比对发现这 3个基因的
同源性达到 9114% ,都包含由 60个左右的氨基酸组
成的保守的 AP2 DNA结合域 ,以及 PKKPAGRKKFR2
FTRHP和 FADSAWR特异氨基酸序列 (图 4)。
a1CBF1; b1CBF2; c1CBF3
图 3　CBF1、CBF2和 CBF3测序结果及其推导
的氨基酸序列
214　氨基酸组成及理化性质分析
通过对 CBF /DREB结合因子蛋白质的组成进行
分析 ,发现 CBF1蛋白编码 213个氨基酸 ,相对分子量
图 4　CBF1、CBF2和 CBF3的氨基酸序列比对
为 23 83016,分子式为 C1037 H1584 N288 O329 S15 ,等电点为
4191; CBF2蛋白编码 216个氨基酸 ,相对分子量为 24
26412,分子式为 C1056 H1623 N293 O333 S16 ,等电点为 5100;
CBF3编码 216个氨基酸 ,相对分子量是 2547314,分子
式为 C1117 H1683 N309 O347 S15 ,等电点是 5108。该类 CBF /
DREB结合因子酸性氨基酸的比例分别为 1013%、
1017%和 1017%;芳香族氨基酸的比例为 919%、917%
和 917%;碱性氨基酸的比例分别为 15%、1418%和
1517%。三者都含有半胱氨酸残基 ,且 N端都为甲硫
氨酸。
215　蛋白质疏水性 /亲水性分析
用 ExPaSyScale对 CBF1、CBF2和 CBF3分别进
行疏水性分析 (图 5) ,结果表明 : CBF1第 46位的脯
氨酸 ( Pro)亲水性最强 ,第 132的苯丙氨酸 ( Phe)和
133位的谷氨酰胺 ( Gln)疏水性最强 (图 5a) ; CBF2
第 46位的苏氨酸 ( Thr)亲水性最强 ,第 130位的谷
氨酸 ( Glu)疏水性最强 (图 5b) ; CBF3第 46位的苏
氨酸 ( Thr)亲水性最强 ,第 132位的丙氨酸 (A la)和
133位亮氨酸 (Leu)疏水性最强 (图 5c)。三者具有
类似的疏水区域 ,疏水性强的氨基酸残基基本出现
在中间部分 ,且 CBF1和 CBF3的相似性最高。总体
来看 , CBF1、CBF2和 CBF3的大部分氨基酸都属于
亲水性氨基酸 ,所以拟南芥该类 CBF /DREB结合因
子属于亲水性蛋白。
216　CBF /DREB类结合因子的蛋白质序列比对及
进化树分析
用 ClustalX软件将 CBF1、CBF2及 CBF3与其它
物种的 CBF /DREB结合因子的保守功能域氨基酸
序列进行同源性比对 (图 6) ,包括拟南芥 (A rabidop2
sis tha liana , NM _ 124578 )、油棕 ( E laeis gu ineensis,
DQ 497736、DQ 497735 ) 、槟榔 (A tta lea bassleriana ,
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2009年第 6期 刘俊等 :拟南芥冷诱导 CBF /DREB类结合因子的克隆及其生物信息学分析
图 5　拟南芥 CBF /D REB类结合因子氨基酸序列的
疏水性 /亲水性分析
DQ497737 ) 水 稻 ( O ryza sa tiva, AY607691 )、针 棕
(Rhapidophyllum hystrix, DQ497742、DQ497743)、椰子
(Cocos nucifera, DQ497739)、黄椰子 (D ypsis lu tescens,
DQ497738)、蓝莓 (Vaccinium corym bosum , FJ222601 )
等 ,结果表明它们的特异氨基酸及 AP2 DNA结合区
的氨基酸序列具有很高的保守性 ,达到 90%以上。
由进化树图谱 (图 7)可以看出 3个 CBF /DREB结合
因子都处于同一个分支上 ,与 CBF4关系最近 ;油棕
(Elaeis guineensis, DQ497736)、针棕 ( Rhapidophyllum
hystrix, DQ497742)、椰子 (Cocos nucifera, DQ497739)
和黄椰子 (D ypsis lu tescens, DQ497738)也处于同一分
支上 ,其中油棕与黄椰子、针棕与椰子处于同一小分
支上 ,槟榔 (A tta lea bassleriana, DQ497737)与以上 4
个的关系就要远一些了 ;水稻的亲缘关系最远。
217　二级结构预测及分析
用 SOPMA程序对所克隆的 3个 CBF /DREB结
　　黑色 1同源性为 100% ;灰色 1同源性高于 90% ;白色 1同源性低
于 90%
图 6　拟南芥 CBF1、CBF2和 CBF3与其它 CBF /D REB
类结合因子保守功能域的分析
图 7　拟南芥冷诱导 CBF /D REB结合因子与其它物种
CBF /D REB类结合因子的进化树分析
合因子进行二级结构的预测。 CBF1 蛋白由
28117%的α2螺旋 , 1141%的 β2折叠 , 12121%的延
伸串和 58122%的不规则卷曲组成 ; CBF2蛋白由
34172%的α2螺旋 , 3124%的 β2折叠 , 12196%的延
伸串 , 49107%的不规则卷曲组成 ; CBF3 蛋白由
3318%的α2螺旋 , 2178%的β2折叠 , 11157%的延伸
串以及 51185%的不规则卷曲组成。由此可见 ,不
规则卷曲在蛋白质二级结构中占主要地位 ,其次是
α2螺旋 (图略 )。
218　DNA 结合域三级结构预测及分析
拟南芥 CBF /DREB类转录因子 DNA结合区的
氨基酸序列及空间构像具有一定特点 ,通过 SW ISS2
MODEL对 CBF1、CBF2和 CBF3进行三维结构同源
建模 ,结果表明 ,这 3个蛋白的 DNA结合域的三维
结构十分相似 , CBF2显得些许不同 ,主要因其 66位
由亮氨酸取代了缬氨酸 (图 8) ,该位置残基的变化
可能导致 DNA结合域与顺式作用元件结合的差异 ,
也可能是导致 CBF2在功能上与 CBF1和 CBF3具
有显著差别的原因所在。
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a1CBF1的 AP2结构域 ; b1CBF2的 AP2结构域 ; c1CBF3的 AP2的结
构域
图 8　SW ISS2MOD EL对拟南芥冷相关 CBF /D REB类
的 D NA结合域三维结构建模
3　讨论
拟南芥冷诱导的 CBF /DREB家族中 , CBF1、2、3
位于第 4号染色体上 817 kb区域内成簇排列 ,且均为
外显子结构 [ 13 ] ,并具有相当高的氨基酸同源性 ,这也
导致了三者在功能上的冗余性 ,一般认为 CBF1、2、3
的表达模式、作用途径等都是基本一致的 [ 14 ]。但
Novillo等 [ 15 ]研究表明 CBF2是作为 CBF1和 CBF3的
阻遏调节子来行使功能的 ,常温条件下 , CBF2的表达
水平显著高于 CBF1和 CBF3,在低温条件下 , CBF2的
积累效应却显著低于 CBF1和 CBF3,在 CBF2功能缺
失突变体中 ,无论是常温还是低温 , CBF1和 CBF3的
表达水平都比野生型要高很多。而且跨膜分析 表
明 , CBF1和 CBF2都不具跨膜结构域 ,但 CBF3却含
有 1个跨膜螺旋 [ 16 ]。
由上述分析看出不同物种的 CBF /DREB结合因
子都包含了保守性极高的特异氨基酸序列 PKKPA
GRKKFRFTRHP和 FADSAWR,以及由 60～70个氨基
酸组成的 AP2 DNA结合域 ,本试验通过 PCR扩增出
拟南芥冷诱导 CBF /DREB类结合因子基因 CBF1、2、
3,并运用生物信息学的方法对三者的核苷酸、氨基酸
和蛋白质等特性进行了较为全面的分析 ,为运用
RACE等传统方法对其它物种的抗逆性转录因子的
克隆以及研究提供了一个新的途径。
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