全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
RVVC患者阴道分泌物中 SPA的表达及意义
明燕虹 袁瑞
(重庆医科大学附属第一医院妇产科,重庆 400016 )
摘 要: 旨在探讨肺表面活性物质相关蛋白 A ( SPA)在复发性外阴阴道假丝酵母菌病 ( RVVC)患者阴道分泌物中的表
达及意义。收集 RVVC患者、外阴阴道假丝酵母菌患者 ( VVC)及健康体检者 (对照组 )阴道分泌物各 20例,用酶联免疫吸附
测定法 ( EL ISA )测定各组中 SPA蛋白的含量, 用逆转录聚合酶链式反应 ( RTPCR )方法检测各组中 SPA的基因表达情况。
用 ELISA方法检测各组中 SPA蛋白的含量发现, VVC组的 SPA明显高于对照组 (P < 0. 05), RVVC组的 SPA高于对照组及
VVC组 (P < 0. 05)。RTPCR检测结果发现, VVC组的 SPA mRNA的表达水平高于对照组 (P < 0. 05), RVVC组的 SPAmR
NA的表达水平明显高于对照组及 VVC组 (P < 0. 05)。SPA可能是 RVVC患者抗假丝酵母菌的重要物质,其性质或数量的改
变可能在 RVVC的发病机制中发挥重要作用。
关键词: 外阴阴道念珠菌病 肺表面活性物质相关蛋白 A 基因表达
Expression and Signification of Pulmonary Surfactantassociated
ProteinA in the Vaginal Fluid of Vulvovaginal Candidiasis
M ing Yanhong Yuan Ru i
(D epartment of O bstetrics and Gynecology, the Affiliated F irstH o sp ital
of Chongq ing M ed ical University, Chongq ing 400016)
Abstrac:t It was to study the expression and s ignification of pu lmonary surfactantasso ciated prote inA in the vag ina l flu id of re
current vulvovag ina l candid ias is( RVVC ). H um an vag ina l fluid from 20 RVVC pa tients, 20 VVC patients and 20 healthy w om en ( the
contro l g roup) w ere co llected, respective ly. Enzym elinked imm unosorbent assay( EL ISA ) was app lied to detect the leve ls of SPA. The
expression of SPA gene w as detected by reverse transcription po lym erase cha in reac tion( RTPCR ). Resu lts ind icated that the levels
and of SPA of VVC g roup were h igher than that of the contro l g roup(P < 0. 05). The leve ls o f SPA o f recurrent vu lvovag inal cand id ia
sis( RVVC) g roup we re h ighe r than those of VVC g roup and contro l group, and the expression o f SPA mRNA in VVC w as higher than
tha t in the contro l group. The expression of SPA mRNA in RVVC w as s ignificantly h igher than those o fVVC g roup and contro l g roup.
Therefore, SPA m ight be an essentia l component in RVVC resistance. The qua lita tive and quantitative alterations of norm a l SPA m ay
p lay a ro le in the pathogenesis of RVVC.
Key words: Vulvovag ina l candid ias is Pu lm onary surfactantassociated prote inA Gene expression
收稿日期: 20091109
作者简介:明燕虹,女,在读硕士研究生; Em ai:l m ingyh@ 163. com
通讯作者:袁瑞,女,博士,主任医师,硕士生导师,研究方向:妇科内窥镜技术; Em ai:l m ingyh@ 163. com
复发性外阴阴道假丝酵母菌病 ( recurrent vu lvo
vag inal candidosis, RVVC )是常见的外阴、阴道炎症。
国外研究资料显示, 大约有 5%左右的成年妇女患
有该病,因其久治不愈,反复发作, 对妇女的身心影
响很大 [ 1]。有研究表明 RVVC的发生可能与阴道
局部免疫功能异常有关。肺表面活性物质相关蛋白
A ( pulmonary surfactantassoc iated pro te inA, SPA)是
C型凝集素家族成员,能够反映天然的免疫机制 [ 2]。
本研究通过对 RVVC患者阴道分泌物中 SPA的水
平进行测定,并以初发或偶发患者及健康带菌者作
对照,以期探讨 SPA在 RVVC发病机制中的意义,
为指导临床治疗提供理论依据。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
1 材料和方法
1. 1 观察对象
患者来自 2009年 3月 - 2009年 6月重庆医科
大学妇科门诊。包括 VVC患者 20例, 年龄 20岁 -
40岁; RVVC 20例,年龄 23岁 - 42岁; 健康带菌者
20例,年龄 25岁 - 41岁。入选标准: ( 1)VVC:具有
典型的临床症状,为初次或偶发患者, 7 d内未进行
任何药物治疗,且未合并其他阴道局部病变,分泌物
涂片可见假菌丝, 培养鉴定为白假丝酵母菌; ( 2 )
RVVC: 具有典型的临床症状, 近 1年内发作 4次
或 4次以上, 7 d内未进行任何药物治疗, 且未合
并其他阴道局部病变, 分泌物涂片可见假菌丝及
芽生孢子, 培养鉴定为白假丝酵母菌; ( 3)健康带
菌者:均为在重庆医科大学附属第一医院行妇科
健康体检者, 外阴阴道检查正常,直接镜检阴性或
仅见孢子, 真菌培养鉴定有白假丝酵母菌生长者。
3组观察对象经检查均排除其它生殖器感染性疾
病及妊娠、糖尿病和长期服抗生素等易感因素, 且
6个月内未服用甾体类激素, 1周内无性生活及阴
道冲洗。
1. 2 标本采集方法
取材时间多为月经来潮前 4- 6 d, 取材前取得
患者同意。取材时严格仔细操作, 尽可能避免血液
污染。外阴消毒后将无菌生理盐水浸湿的棉拭子 3
根置于阴道后穹隆处 10 s, 尽可能多地取出阴道分
泌物。然后将第 1根上的分泌物放在冻存管中,在
液氮罐中迅速冷却后保存在 - 80 的低温冰箱中用
来提取 RNA后, 进行逆转录聚合酶链式反应 ( re
verse transcription– po lym erase chain react ion, RT
PCR )。将第 2根棉拭子上的标本迅速在 1 mL磷酸
盐缓冲液中漂洗,装在离心管中, 放在 4 左右冰袋
中快速转移到实验室, 在低温离心机上以 3 000 r/
m in的转速离心 5 m in, 取上清液 500 L, 放在 -
80 冰箱中保存用于进行酶联免疫吸附测定 ( en
zymelinked immunosorbent assay, ELISA )。待收齐
所有标本后进行试验,这样可以避免标本反复冻融。
第 3根用于分泌物图片及培养鉴定。
1. 3 ELISA方法检测 SPA蛋白含量
ELISA试剂盒购自中美合资武汉中美科技有限
公司,具体操作方法按照说明书进行。酶标仪为美
国 MD公司生产的 SpectraM axMZ* 型。将 96孔板
以标准品的 A值做纵坐标, 以蛋白含量做横坐标,
绘制标准曲线,并得回归方程,据此方程计算出待测
SPA的蛋白含量。
1. 4 RTPCR方法检测 SPA基因表达
1. 4. 1 引物设计与合成 根据 GenBank SPA基因
序列,引物由上海生物工程技术服务有限公司设计
及合成。
SPA上游引物: 5GGGCAGTCCATCACTTT3, SP
A下游引物: 5GTCCCGTCTGAGTAGCG3, 185 bp;
actin上游引物: 5CGGGAAATCGTGCGTG
AC3, 下游引物: 5TGGAAGGTGGACAGCGAGG
3, 434 bp。
1. 4. 2 标本总 RNA提取 总 RNA 提取试剂
RNA iso Plus购自宝生物工程 (大连 )有限公司,按照
试剂说明书操作来提取总 RNA。所提取总 RNA完
整性经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳,可见明显 18S和 28S
条带。用紫外分光光度计定量并分析其纯度, A 260 /
A280比值为 1. 8- 2. 0者可用于逆转录反应, - 80
保存备用。
1. 4. 3 RTPCR方法 RTPCR试剂盒购自 TaK a
Ra公司,按照说明书进行试验操作。冰浴中在反应
管内依次加入 5 RTBu ffer 2 L, RT Enzym eM ix逆
转录酶 0. 5 L, O ligo ( dT) Primer( 50 M ) 0. 5 L,
Random 6 mers( 100 M ) 2 L, RN ase Free dH2O 4
L,总 RNA 1 L,总反应体积 10 L,混匀, RT反应
条件: 37 15 m in, 85 5 s, 1个循环,将反应所得
cDNA存于 - 20 冰箱备用。 PCR反应体系: 5
RTBuffer 5 L、上游引物 ( 25 pmol /L ) 0. 5 L、下游
引物 ( 25 pmol /L ) 0. 5 L、内参上游引物 0. 5 L、内
参下游引物 0. 5 L、Taq酶 0. 25 L、cDNA模板 5
L、灭菌蒸馏水 7. 75 L,总反应体积 25 L, 混匀,
PCR反应条件为 94 2 m in; 94 30 s, 58 30 s,
72 30 s, 35个循环; 72 10 m in。取 PCR扩增产
物 5 L,在 2%琼脂糖凝胶电泳, 扫描仪观察电泳条
带, 拍照, 软件分析图像。
1. 4. 4 结果判定 在凝胶图像成像仪上扫描,记录
各特异性 DNA扩增带光密度值 ( op tica l delnsity,
OD) ,以 SPA的 DNA扩增片段光密度与相应的内
参 act in扩增片段光密度的比值作为 mRNA的表
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2010年第 2期 明燕虹等 : RVVC患者阴道分泌物中 SPA的表达及意义
达水平的定量指标。
1. 5 统计学分析
采用 SPSS 17. 0统计软件包进行统计学处理。
计量资料采用均值 标准差表示, 总体进行方差分
析,组间比较用 LSD法。P < 0. 05为差异有统计学
意义。
2 结果
入选研究对象 60例, 其中 VVC患者 20例,年
龄 ( 31. 55 6. 72)岁; RVVC患者 20例, 年龄 ( 32. 60
6. 19)岁;健康带菌者 20例, 年龄 ( 32. 85 7. 07)
岁。3组间年龄比较差异无统计学意义 ( F = 0. 214,
P = 0. 808)。
2. 1 SPA蛋白表达水平测定结果
各组观察值服从正态分布,并经过 Levene检验
(P = 0. 135 ), 认为方差齐性, 符合方差分析条件。
通过方差分析,认为各组观察值的差别有统计学意
义, (F= 383. 699, P < 0. 001) ,可以认为 RVVC组,
VVC组及对照组间 SPA的浓度水平不同。LSD检
验显示, VVC组的 SPA浓度水平明显高于对照组
(P < 0. 001), RVVC组的 SPA浓度水平高于对照
组 (P < 0. 001)及 VVC组 (P < 0. 001)。各组中 SP
A蛋白浓度见表 1。
表 1 SPA蛋白在各组中的表达水平
分组 例数 SPA蛋白浓度 ( ng /mL)
RVVC组 20 198. 31 9. 61
VVC组 20 165. 40 7. 30
对照组 20 129. 88 6. 12
2. 2 阴道局部 SPA mRNA表达水平的变化
SPA和内参 actin PCR产物琼脂糖凝胶电
泳,其大小与预先设计引物大小一致 (图 1)。各组
的 ODSPA /ODactin值见表 2。各组观察值符合正态
分布, 将各组观察值取对数后, 经检验认为方差齐
性。通过方差分析, 认为各组观察值的差别有统计
学意义 (F = 61. 723, P = 0. 000 ), 可以认为 RVVC
组, VVC组及对照组间 SPA mRNA的表达水平不
同。LSD检验结果显示, VVC组的阴道局部 SPAm
RNA的表达水平明显高于对照组 (P < 0. 001) , RV
VC组的阴道局部 SPA mRNA的表达水平高于对照
组 (P < 0. 001)及 VVC组 (P< 0. 001)。
a. RVVC组, b. VVC组, c. 对照组; 434bp处为内参 act in
的条带, 185 bp处为目的基因 SPA的条带
图 1 各组中 SPA mRNA的表达结果
表 2 SPA mRNA在各组中的表达水平
分组 例数 OD SP A /ODact in
RVVC组 20 1. 059 0. 140
VVC组 20 0. 832 0. 100
对照组 20 0. 683 0. 076
3 讨论
3. 1 SPA能够反映天然免疫机制
SPA为 C型凝集素家族成员,是一种具有多种
免疫调节功能的特异性蛋白质, 在宿主防御感染和
炎症方面发挥重要作用: 它能与病原表面的特异性
碳水化合物结合,发挥非抗体依赖的调理素作用;具
有和补体 C1q相似的分子结构,能与 C1q受体结合
发挥生物学作用; 可以增强吞噬细胞对某些微生物
的摄取; 调节免疫细胞细胞因子和 /或氧化剂的释
放, 刺激免疫球蛋白的产生以及影响淋巴细胞的分
化等 [ 3- 5]。
3. 2 阴道上皮细胞的抗假丝酵母菌作用
Melissa等 [ 6]认为阴道黏膜上皮细胞的抗假丝
酵母菌活性是一种天然宿主防御机制,且此种活性
已经在体外试验中被证实。阴道黏膜上皮为复层鳞
状上皮细胞,除了参与分娩、生殖、感觉功能外,还具
有屏障和免疫功能。大多数学者认为 [ 7 ] ,细胞因子
是阴道上皮细胞抗白假丝酵母菌感染的重要防御形
式, 许多试验已经证实白假丝酵母菌接触黏膜上皮
细胞后能刺激上皮细胞分泌细胞因子,所以上皮细
胞在局部粘膜白假丝酵母菌感染中细胞因子的变化
有着重要作用。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
3. 3 在阴道分泌物中检测出 SPA的可能性
本研究所用的各组标本均检测到了 SPA蛋白
及 mRNA的表达。MacNe ill等 [ 8]在阴道表层上皮和
中间层上皮中用免疫组化技术证实了 SPA的存
在,并用北方墨点分析法 ( No rthern blotting)在阴道
壁细胞的 RNA中检测出 SPA转录子,同时,他们应
用二维电泳技术和质谱技术证实, 阴道灌洗液中含
有 SPA; Orhan等 [ 9 ]也用免疫组化及免疫印迹法在
母马的外阴、阴道、卵巢、子宫等组织中检测到了
SPA的表达,其中在外阴、阴道中的表达最强, 卵巢
次之, 子宫最弱, 与本研究结果有一致性。结合本研
究的结果, 可以推测 SPA是由阴道上皮细胞分泌
的细胞因子,白假丝酵母菌感染人阴道上皮细胞时,
SPA的分泌量显著增加, SPA可能与阴道上皮细
胞的抗假丝酵母菌活性有密切关系。
3. 4 RVVC患者阴道分泌物中细胞因子 SPA的变
化情况
本研究结果显示, 细胞因子 SPA的表达在健
康对照组、VVC及 RVVC患者的阴道分泌物中呈现
逐渐增强的趋势, 即 SPA在 VVC组中的表达高于
健康带菌组, 在 RVVC组中的表达最强, 且高于
VVC组和健康带菌组。刘朝晖等 [ 3]在对人阴道上
皮细胞模型的研究中发现,染假丝酵母菌后,随着时
间推移,阴道上皮细胞 SPA的表达有明显上升的
趋势; 在对 VVC及正常对照组阴道灌洗液的研究中
发现, 正常组和 VVC组 SPA水平的差异有统计学
意义, 与本研究结果有一致性。据此可以推测, SP
A不仅在 VVC患者的阴道上皮先天性抗白假丝酵
母菌作用中发挥作用, 可能也是 RVVC患者抗白假
丝酵母菌的重要物质, 而且健康携带者阴道分泌物
细胞因子的低水平产生可能与阴道正常菌群 (包括
细菌和真菌等 )的持续存在有关; 阴道内 SPA可能
在女性内生殖器的先天性免疫和获得性免疫机制中
发挥重要的作用, SPA性质和数量的异常,可能在
内生殖器炎性疾病的发生发展中起到一定的作用。
3. 5 本研究的局限性
本研究为了探讨 SPA在 RVVC的发病机制中
的作用,以 RVVC、VVC以及健康对照组患者的阴道
分泌物为研究对象,采用 ELISA技术和 RTPCR技
术, 从蛋白水平及 mRNA水平检测了 SPA在 RV
VC、VVC及健康对照组患者阴道分泌物中的表达情
况。在 RVVC患者的阴道分泌物中, SPA无论是在
蛋白水平还是 mRNA水平表达都有所上升, SPA在
RVVC患者阴道分泌物中的高表达表明, SPA可能
是阴道上皮细胞抗假丝酵母菌的重要物质, 其性质
或数量的改变可能在 RVVC的发病机制中发挥重
要作用,并为进一步研究 SPA在女性生殖道先天
性和获得性免疫中的作用打下一定的基础。然而,
因为 RVVC的发病机制复杂, SPA仅是阴道局部炎
症错综复杂的免疫反应网络中的一员,还有必要进
一步研究多种细胞因子的表达情况、局部的作用机
制以及各种因子的相互影响和相互作用。
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