全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
融合基因 Mdchly的构建及原核表达
卢雪梅 金小宝 朱家勇 梅寒芳 马艳 王艳 李小波 褚夫江
(广东药学院基础学院 广东省生物活性药物研究重点实验室,广州 510006)
摘 要: 构建家蝇天蚕素人溶菌酶 ( Mdchly)融合基因, 实现 M dch ly基因在大肠杆菌中的表达。通过 RTPCR分别扩
增出家蝇天蚕素和人溶菌酶的成熟肽基因序列, 再利用 GeneSOE ing技术构建融合基因, 将融合基因克隆至 pET32a表达载
体, 转化 E. coli BL21( DE3),经 IPTG诱导得到高效表达,融合蛋白分子量约为 38 kD。W este rn blotting杂交证实了表达蛋白
的抗原活性。成功构建了融合其因并进行了原核表达,为进一步的生物活性研究打下基础。
关键词: 家蝇天蚕素 人溶菌酶 GeneSOE ing 原核表达
Construction and Prokaryotic Expression of Fusion GeneMdchly
Lu Xuemei Jin X iaobao Zhu Jiayong M e iH anfang M a Yan W angYan L iX iaobo Chu Fu jiang
( School of Basic Courses, Guangdong University of Pharmaceutical, Guangdong K ey Laboratory of B ioactive D rugs, Guangzhou 510006)
Abstrac:t The DNA fragm ent encod ing the m ature peptide ofM usca dom estica cecrop in and hum an lysozym e w ere ob tained by
RTPCR. TheM dch ly genew as constructed in aMdclinkerh ly form at w ith the standard 15am ino acid linker ( G ly4 Ser) 3 by Gene
SOE ing, and the fina l full length produc t w as c loned into the pET32a vecto r fo r pro te in expression in E scher ichia coli stra in BL21
( DE3) . The expression fusion pro te in MdchlyT rx w ere about 38 kD andW estern blo tting analysis confirm ed tha t the 38 kD pro tein
w as the fusion pro te in, because it was spec ifica lly recogn ized by m ouse antiH is monoclona l antibody. The fusion geneM dch ly w as
successfully constructed and expressed, the results of wh ich cou ld prov ide founda tion for furthe r study of its biolog ica l activ ity.
Key words: Musca dom estica cecrop in H um an lysozym e G eneSOE ing Proka ryotic expression
收稿日期: 20091020
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30671832)
作者简介:卢雪梅,女,硕士研究生,主要从事抗菌肽结构功能与应用研究; Em ai:l luxuem ei605@ 163. com
通讯作者:朱家勇,男,教授,博士生导师, Em ai:l zhujy@ gdpu. edu. cn
自青霉素被发现以来,各种天然、半合成及合成
的化合物被大量、成功地应用于抵抗各种微生物感
染,然而,随着环境的改变和微生物的适应性进化,
大多数致病性微生物对传统抗生素产生耐药性己成
为影响公众健康的严重问题 [ 1]。战胜细菌耐药性
的途径,一是防止由于滥用抗生素而造成耐药菌的
快速和广泛出现;二是根据细菌产生耐药性的作用
机制, 不断地去研究、开发新的抗菌药物。天蚕素是
发现最早,研究最多的一类抗菌肽,对革兰氏阳性菌
( G
+
)和革兰氏阴性菌 ( G- )均有较强的抗菌活性,
且对 G-活性更强, 而对高等动物机体的正常细胞
几乎没有作用 [ 2 ]。人溶菌酶是存在于正常体液和
组织中的一类非特异性免疫因子, 具有较强的杀菌
活性尤其是对革兰氏阳性菌活性更强, 而且对人体
没有毒副作用 [ 3]。为了寻求新型的抗菌蛋白或融
合蛋白,近年来国内外先后报道了有关抗菌肽类基
因以及与其它相关基因融合的克隆和表达 [ 4] , 但将
来源家蝇的天蚕素与人溶菌酶进行融合表达目前未
见报道。如能将二者构建成融合蛋白,使其作用机
制得到互补,将为拓宽天蚕素和溶菌酶的抗菌谱,降
低细菌的耐受机率,使天蚕素及溶菌酶的应用价值
得到更大限度的挖掘打下基础, 特别是作为新药在
医药业,作为抗菌添加剂和防腐剂在食品工业、饲料
加工业以及农业保护方面将具有深远的意义。
本研究利用重叠延伸 PCR法 ( PCRbased gene
splic ing by overlap ex tension, Gene SOE ing ) 重组家
蝇天蚕素与人溶菌酶基因,并构建其原核表达质粒,
通过大肠杆菌表达, 并采用 SDSPAGE和 Western
2010年第 4期 卢雪梅等:融合基因 M dchly的构建及原核表达
blotting对表达产物进行了检测与鉴定,为进一步的
生物活性研究奠定了良好的基础。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 家蝇和人胎盘组织 家蝇广东株,由广东省
疾病控制中心提供。新鲜人胎盘组织, 由广州市南
方医科大学珠江医院妇产科提供。
1. 1. 2 菌株和质粒 宿主菌: E. coli DH 5, BL21
( DE3)本实验室保存。质粒: pMD20T购自 TaKa
R a公司, pET32a为 N ovagen公司产品。
1. 1. 3 主要试剂 Trizol Reagent为 Inv itrongen公
司产品; 限制性内切酶 N oc I、BamH I、H in d , T4
DNA连接酶, Taq DNA聚合酶购自 TaK aRa公司;
T IANpureM idi P lasm id K i,t TIANge lM id iPurificat ion
K it为北京 TIANGEN公司产品; DNA分子量标准、
蛋白质分子量标准购自 MB I生物公司; 丙烯酰胺、
N, N ! 亚甲基双丙烯酰胺、SDS购自 S igma公司;
TEMED为自北京鼎国生物公司产品; 6 ∀H is Tag小
鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠 IgG HRP标记的抗体为
美国 Pharmacia公司产品; DAB显色试剂盒为武汉
博士德公司产品。其他化学试剂为进口或国产分
析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 家蝇天蚕素 ( M dc)和人溶菌酶 ( H ly )成
熟肽序列的克隆 参照 T rizo l Reagent使用说明
分别提取家蝇三龄幼虫和人胎盘组织总 RNA, 根
据 G enB ank公布的天蚕素 ( GenBank登录号:
EF175878) 和人 Lysozyme ( G enBank 登录 号:
J03801) cDNA序列, 用 Pr imer Prem ier 5. 0生物
软件设计引物, 利用 RTPCR技术扩增得到家蝇
天蚕素和人溶菌酶成熟肽基因的编码区序列, 分
别将目的片段克隆入 pMD 20T载体, 转化大肠
杆菌 DH 5,经过蓝白斑筛选、菌液 PCR鉴定、酶
切鉴定及 DNA测序分析后, 得到 pMD 20T / M dc
和 pMD 20T / H ly阳性克隆。
1. 2. 2 融合蛋白基因重组及其表达载体的构建
利用GeneSOE ing技术构建融合基因, 具体方法
如下: 分别以 pMD 20T /M dc和 pMD 20T /H ly重组
质粒为模板,设计两对特异性引物。
引物 C1和 C2用于扩增带 L inker的天蚕素的
成熟肽序列。C1: 5#CATGCCATGGCGATGGGCTG
GTTGAAAAAAATCGGCAAGAA3#, C2: 5#CCACTAC
CCCCCCCGCCGCTTCCACCGCCACCGTTACCCTTTA
AT3#,其中划线部分为 N co I酶切位点,斜体为疏水
性多肽接头 ( G ly4 Ser) 3的重叠 DNA序列部分。引物
H1和 H2用于扩增带 L inker的溶菌酶的成熟肽序
列。 H1: 5#GCGGCGGGGGGGGTAGTGGCGGTGGCG
GCAGCAAGGTCTTTGAAA3#, H2: 5#CCCAAGCTTAT
TACACTCCACAACCTTGAACATACTGACGGACAT3#,
其中划线部分为H ind 酶切位点,斜体为疏水性多
肽接头 ( Gly4 Ser) 3的重叠 DNA序列。由于 MdcLin
ker的 3#端和 LinkerH ly的 5#端形成了部分重叠链,
在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸从而将两段
基因拼接起来,合成全长的融合蛋白基因。
将合成的 M dchly融合蛋白基因和表达载体
pET32a分别用限制性内切酶N co I和H ind 进行
双酶切,然后用 T4连接酶连接过夜, 连接产物转化
E. coli BL21,转化菌种涂于含有氨苄青霉素的平板,
培养 16 - 18 h后, 挑取单菌落培养后进行菌液
PCR、酶切鉴定及 DNA测序验证。
1. 2. 3 融合基因的诱导表达及表达产物的 SDS
PAGE和 Western blotting鉴定 将纯化的 pET32a /
M dch ly质粒转化已制备好的 E. coli BL21( DE3)感
受态细胞, 经氨苄抗性筛选, 挑取 pET32a /M dchly
阳性单菌落到 5 mL LB液体培养基中 ( 1%的蛋白
胨, 0、5%的酵母抽提粉, 85 mmol /L的氯化钠 ),
37∃ 、220 r/m in振摇 8- 12 h,然后将此菌液按 1%
100比例接种到新鲜的 LB液体培养基中, 37∃ 、220
r/m in振摇至 OD600 = 0. 6时, 加入终浓度为 1. 0
mmo l/L的异丙基 D硫代半乳糖苷 ( IPTG )诱导 4
- 6 h。离心收集菌细胞加入 1 ∀ SDSPAGE Buffer
( 50 mM T risHC l pH 6. 8, 100 mM DTT, 2% SDS,
01%溴酚蓝, 10%甘油 ), 煮沸 5 m in, 离心, 取上清
加样。制作 6% 的浓缩胶, 15% 的分离胶, 电泳电
压: 浓缩胶 80 V, 分离胶 120 V。电泳结束后, 凝胶
进行考马斯亮蓝染色。
经 IPTG 诱导后的表达产物经 15% 的 SDS
PAGE电泳后通过半干电转仪转移至 PVDF ( Polyv i
ny lidene dif luo ride)膜上,以 6 ∀H is Tag小鼠单克隆
抗体作为一抗,山羊抗小鼠 IgG HRP标记抗体作为
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
二抗, 用 DAB显色系统显色,检测分析Western blot
t ing结果
2 结果
2. 1 目的基因 Mdc和 H ly成熟肽序列的克隆
分别提取家蝇三龄幼虫和人胎盘组织总 RNA,
RTPCR扩增产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳,检测得
到目的片段后 (图 1, 图 2 ), 将其回收与 pMD 20T
载体连接。转化后挑选阳性克隆单菌落在 LB
(Amp
+
)培养液中过夜培养,提取质粒进行 N co I/
BamH I、BamH I /H ind 双酶切和 PCR鉴定,片段
大小正确 (图 3, 图 4 )。基因序列分析结果与 Gen
Bank公布的序列完全一致。
M. DNA M arker DL2000; 1. Md c基因 PCR扩增产物
图 1 Mdc基因 RTPCR扩增结果
M. DNA M arker DL2000; 1. H ly基因 PCR扩增产物
图 2 H ly基因 RTPCR扩增结果
M. DNA M arker DL2000; 1. 重组质粒 pMD20T /M dcN oc
I/BamH双酶切产物; 2. pMD20T /M dc PCR扩增产物
图 3 重组质粒 pMD20T /M dc的酶切及 PCR鉴定
M. DL10000 DNA M ark er; 1. pMD20T /H ly BamH I和
H ind III双酶切产物; 2.重组质粒 pMD20T /H ly PCR扩
增产物
图 4 重组质粒 pMD20T /H ly酶切及 PCR鉴定
2. 2 融合蛋白基因 Mdchly的重组及其表达载体
的构建
以 pMD 20T /M dc和 pMD 20T / H ly重组质粒
为模板, 分别用引物 C1、C2和 H 1、H 2扩增 MdcL in
ker和 LinkerH ly特异片段, 通过重叠延伸反应将
MdcL inker和 LinkerH ly进行拼接, 扩增后获得约
580 bp的片段, 即为合成的全长融合蛋白基因 (图
5)。经过 N co I和 H ind 双酶切后的目的基因片
段, 定向插入经 N co I和H in d 双酶切的含有 6 ∀
H is的 pET32a表达载体中, 从而构建重组质粒
pET32a /M dch ly。在含有氨苄青霉素的平板上挑取
转化重组质粒 pET32a /M dchly后的 E. coli BL21单
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2010年第 4期 卢雪梅等:融合基因 M dchly的构建及原核表达
菌落培养并抽取质粒进行 N co I /H ind 双酶切和
PCR鉴定 (图 6)。由图 6可知, PCR和双酶切的目
的 DNA片段大小正确, 验证的质粒经 DNA测序分
析,无碱基错配, 最终确定重组表达质粒 pET32a /
M dchly构建成功。
M. DNA M arker DL2000; 1- 3. 分别为 M dcLink er、L inker
H ly、Mdch ly PCR扩增产物
图 5 Mdch ly融合基因的 PCR扩增
M. DNA M ark er DL10000; 1. 重组质粒 pET32a/ M dch ly
N co I和H ind III双酶切产物; 2. 重组质粒 pET32a /M dch ly
PCR扩增产物
图 6 重组质粒 pET32a / M dchly酶切及 PCR鉴定
2. 3 融合蛋白基因的诱导表达及其表达产物的
鉴定
将构建成功的重组表达质粒转化 E. coli BL21
( DE3)感受态菌,诱导 4- 6h后取样经 15% SDS-
PAGE电泳检测在大小约 38 kD (因载体 pET32a具
有 Trx标签蛋白,分子量约为 18 kD, 而融合蛋白分
子量约为 20 kD,因此表达的蛋白应是大约 38 kD)
处出现蛋白条带,而未诱导的细菌裂解液中未出现
相应的条带 (图 7)。结果表明融合蛋白在 E. coli
BL21( DE3)中经诱导后表达量较高。由于融合蛋
白含有 pET32a编码的 6 ∀H is标签, 采用鼠源 H is
单克隆抗体为一抗进行W estern b lo tt ing, 结果显示,
诱导后的含重组质粒表达菌株在 38 kD处有一条特
异性条带,而未诱导的没有, 进一步证实了表达的蛋
白为带有 H is标签的融合蛋白 (图 8)。
M.蛋白质分子量标准; 1, 2.分别为经 IPTG诱导和未经
IPTG的空质粒 pET32 a在 E. col i BL2的表达产物; 3, 4. 分
别为经 IPTG 诱导和未经 IPTG诱导的重组质粒 pET32a
Mdch ly在 E. coli BL21表达产物
图 7 融合蛋白的诱导表达分析结果
M.蛋白质分子量标准; 1. 未经 IPTG 诱导的空质粒
pET32 aMdch ly在 E. coli BL2的表达产物; 2.经 IPTG诱导
的 pET32aMdch ly在 E. coli BL2的表达产物
图 8 融合蛋白的W estern b lotting分析结果
3 讨论
抗菌制剂的活性及选择性是由其与细菌相互作
用的方式决定的。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在
结构上各有其特点。细胞壁为细菌表面比较复杂的
结构,是一层较厚 ( 5 - 80 nm ) , 质量均匀的网状结
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
构,可承受细胞内强大的渗透压而不破坏。肽聚糖
是细胞壁的主要成分,由 N乙酰葡萄糖胺和 N乙酰
胞壁酸两种氨基糖经 1. 4糖苷键连接间隔排列形
成的多糖支架。革兰氏阳性菌细胞壁较厚,约 20-
80 mm。肽聚糖含量丰富,有 15- 50层, 每层厚度 1
nm,约占细胞壁干重的 50% - 80%。革兰氏阴性菌
细胞壁较薄,约 10- 15 nm, 除 1- 2层肽聚糖外,尚
有特殊组份外膜层位于细胞壁肽聚糖层的外侧,包
括脂多糖、脂质双层和脂蛋白 3部分。一般来说,溶
菌酶主要是通过破坏细胞壁中的 N乙酰胞壁酸和
N乙酰氨基葡糖之间的 1, 4糖苷键, 使得菌体由
于细胞壁出现缺口或被溶解,导致内容物外流,从而
达到抑制菌体生长或杀灭菌体的作用。而天蚕素的
作用机制对 G+菌来说, 只有细胞质膜参与了与其
的相互作用,而对于 G-菌来说,则有外膜和细胞质
膜参与了与天蚕素的相互作用。天蚕素先与 G -菌
表面的脂多糖 ( LPs)作用, 打破细胞外膜的隔离特
性,在外膜上形成瞬间通道, 可通过各种分子, 包括
疏水基团、小蛋白和抗菌基团等,并可以促进肽链自
身的吸收。天蚕素的杀菌功能则是通过在细菌细胞
质膜上形成通道完成的, 带正电荷的多肽与带负电
荷的膜作用,在细菌细胞质膜的电位势的影响下,多
肽由无规则结构转变成螺旋,并集结成束,疏水端朝
向分子内部,亲水端向外,形成通道, 细胞内容物外
泄,从而导致细菌死亡 [ 5- 7]。另有研究表明,溶菌酶
与天蚕素具有协同作用, 推测可能是天蚕素破坏细
菌外膜后利于溶菌酶作用于细胞壁 [ 8]。目前在临
床上, 联合使用两种或多种抗生素对治疗严重的细
菌感染是非常有用的, 这种方法的理论基础是这些
药物在体内具有协同作用。例如, 使用对细菌细胞
膜有影响的抗生素可以增强作用于蛋白质或细胞壁
合成的抗生素的抗菌谱或抗菌活性。基于上述研究
基础, 本研究通过基因重组, 研制了 Mdch ly融合蛋
白。融合蛋白中的两个成分能否相互协同, 发挥更
好的生物学活性,与二者能否分别形成正确的空间
构象是密切相关的。目前多数研究者采用低疏水性
及低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头充分伸展以
分开两种组分,使它们能互不干扰地充分折叠成各
自的天然构象。一般认为 L inker的长度在 5- 25个
氨基酸残基为适,太短不能提供足够的空间,较长对
蛋白的折叠及稳定性有益, 但容易受到蛋白酶的攻
击。本研究采用目前应用较为广泛的 15肽序列
( G ly4 Ser) 3,其中甘氨酸是分子量最小,侧链最短的
氨基酸,可增加侧链的柔性; 丝氨酸是亲水性最强的
氨基酸, 可增加 L inker的亲水性 [ 9- 11]。 ( G ly4 Ser) 3
具有良好的柔顺性和折叠性, 并具有足够的长度有
助于 Mdch ly融合蛋白形成与天然蛋白类似的空间
构象,从而保存各自的生物活性, 以便最终获得融合
蛋白的双重活性。
将蛋白和 L inker在基因水平上拼接,一种拼接
方法是将 L inker设计在表达载体上, 两端各有限制
性酶切位点供目的基因插入。另一种拼接法是通过
PCR直接合成,将 L inker序列直接包含在重组目的
基因当中,称为 G ene SOE ing[ 12]。本研究采用 G ene
SOE ing法,将 L inker的编码序列分别设计在待扩增
的引物中,并使这两个基因的引物中 9或 15个碱基
以上的互补序列, 这样 PCR产物形成了重叠链, 从
而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸, 将待融
合的两个扩增产物重叠拼接起来。这个方法简便易
行, 而且在 L inker两端不必因设计内切酶位点而引
入不必要的氨基酸残基, 从而保证了融合蛋白的完
整性和真实性。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最
早, 应用最为广泛的经典表达系统,是生物技术研究
和生物药物产业化进程中的重要工具,具有培养周
期短, 低成本,易操作等特点, 但由于抗菌蛋白本身
具有杀菌作用,即所谓工程菌表达 &毒性 ∋蛋白时的
&自杀∋现象, 其直接表达较困难, 一般常采用融合
表达方式进行表达。表达后, 通过工具酶切除融合
标签,可得到具有天然活性的重组目的蛋白。本试
验选用的是 Novgane公司的 PET融合蛋白载体表达
系统。 pET32a表达载体与其它表达载体不同之处
是 SD序列下游为硫氧还原蛋白基因和 6个组氨酸
残基基因,当进行基因表达时,表达产物为硫氧还原
蛋白 6个 h is残基 目的基因产物的融合体。硫氧还
原蛋白有中和融合蛋白毒性、促进胞浆中二硫键形
成从而有助于可溶蛋白表达的作用, 另外在保护融
合蛋白免受蛋白酶降解也起到一定作用。
本研究利用基因工程方法重组了家蝇天蚕素与
溶菌酶基因,构建融合表达质粒,转化 E. coli BL21
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2010年第 4期 卢雪梅等:融合基因 M dchly的构建及原核表达
( DE3),经 IPTG诱导得到高效表达为检测其生物学
活性及以后的应用奠定必要的基础。
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