全 文 ：书　中国南方果树／ＳＯＵＴＨ　ＣＨＩＮＡ　ＦＲＵＩＴＳ　２０１５；４４（２）：１～４
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研究报告 ·柑桔类果树·
抗菌肽－人溶菌酶融合基因的构建及转入锦橙后的表达分析
解栋梁１，２，邹修平２，许兰珍２，何丹丹１，２，彭爱红２，何永睿２，陈善春２
（１西南大学园艺园林学院，重庆，４００７１５；２中国农业科学院柑桔研究所／西南大学柑桔研究所／
国家柑桔品种改良中心，重庆，４００７１２）
　收稿日期：２０１４－０９－１２；修回日期：２０１４－１２－０５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１２７２１５０）；中央高校基本科研业务费专项（ＸＤＪＫ２０１４Ａ０１８）；国家科技支撑计划课题
任务书（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０６）；重庆应用开发项目（ＣＳＴＣ２０１３ｙｙｋｆＡ８００２）；柑桔学重庆市市级重点实验室开放基
金计划项目（ＣＫＬＣ２０１１０５）资助。
作者简介：解栋梁，男，硕士研究生，研究方向为遗传育种。电话：１８８８３２４３６６８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｅｄｏｎｇｌｉａｎｇ２００８＠１２６．ｃｏｍ
通信作者：邹修平，博士。电话：（０２３）６８３４９０１９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｏｕｘｉｕｐｉｎｇ＠ｃｒｉｃ．ｃｎ
陈善春，研究员。电话：（０２３）６８３４９０２０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｃｃｈｅｎ＠ｃｒｉｃ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．１３９３８／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－１４３１．２０１４０４６９
摘　要　为了研究抗菌肽和人溶菌酶对柑桔溃疡病和黄龙病等的协同抗性，利用连接多肽２Ａ编
码序列连接抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ（ＣＢ）和人溶菌酶ｈｕｍａｎ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨＬｙ）基因，构建了融合基因ＣＢ：
ＨＬｙ及其超量表达载体ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：ＨＬｙ。利用农杆菌介导法，将该载体转化至锦橙上胚轴。通过
ＧＵＳ化学染色及ＰＣＲ鉴定，获得转基因植株３２株。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ证明了融合基因在转基因锦
橙中得到了高效表达。本研究为柑桔溃疡病的抗性研究提供了材料。
关键词　抗菌肽；人溶菌酶；融合基因；连接多肽２Ａ；遗传转化
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｃｉｔｒｕｓ
ＸＩＥ　Ｄｏｎｇｌｉａｎｇ１，２，ＺＨＯＵ　Ｘｉｕｐｉｎｇ２，ＸＵ　Ｌａｎｚｈｅｎ２， ＨＥ　Ｄａｎｄａｎ１，２，ＰＥＮＧ
Ａｉｈｏｎｇ２，ＨＥ　Ｙｏｎｇｒｕｉ　２，ＣＨＥＮ　Ｓｈａｎｃｈｕｎ２
（１Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　ｌａｎｄｓｃａｐｅ　ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４００７１５；２Ｃｉｔｒｕｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｃｉｔｕｒｅ　Ｖａｒｉｅｔｙ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４００７１２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｙｎｅｒｇｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｔｏ　ｃｉｔ－
ｒｕｓ　ｃａｎｋｅｒ　ａｎｄ　ＨＬＢ，ｗｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａ　ＣＢ：ＨＬｙｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐ３５Ｓ：：
ＣＢ：Ｈｌｙ　ｕｓｉｎｇ　ｏｎｅ　ｌｉｎｋｅｒ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　２Ａ．Ｔｈｉｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｗｅｅｔ　ｏｒａｎｇｅ　ｇｅｎｏｍｅ
（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　Ｏｓｂｅｃｋ）ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｉｒｔｙ－ｔｗｏ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ
ｗｅｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＧＵＳ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｆｕｓｉｏｎ
ｇｅｎｅ　ｈａｄ　ｈｉｇｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃｉｔｒｕｓ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｆｏｒ　ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｃｉｔｒｕｓ　ｃａｎｋｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ；ｈｕｍａｎ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ；ｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ；ｌｉｎｋｅｒ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　２Ａ；
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　　抗菌肽是生物体内具有广谱杀菌能力的
小分子多肽，其抗病机理主要是阳离子抗菌
肽与带负电荷的细菌胞膜在静电作用下吸引
并相互作用，导致胞膜通透性增大，内容物大
量外 流，细 胞 渗 透 压 改 变 最 终 死 亡［１］。
ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ（ＣＢ）是一类热稳定和广谱抗菌的
可溶性多肽，最早是从天蚕体内分离得到
的［２－３］。人溶菌酶（ｈｕｍａｎ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＨＬｙ）是
中 国 南 方 果 树／ＳＯＵＴＨ　ＣＨＩＮＡ　ＦＲＵＩＴＳ 第４４卷
一种碱性球蛋白，具有较高的溶菌活性和热
稳定性，具有广谱的溶菌和抗病毒能力［４］，它
能切断肽聚糖中的 Ｎ－乙酰葡萄糖胺和乙酰
胞壁酸之间的β－１，４糖苷键，在内部渗透压
作用下引起细胞裂解［５］。为了能够利用抗菌
肽和人溶菌酶协同作用于病菌的细胞膜和细
胞壁，以抑制柑桔溃疡病菌、黄龙病（ＨＬＢ）
菌等，有必要将两者的基因转入柑桔。采用
融合基因技术可将两个及以上基因的编码区
置于同一套调控序列之下，可有效降低基因
沉默的概率。目前构建融合基因的方法主要
有两种，一种是将功能基因直接首尾相连，置
于同一套调控序列之下；另一种是根据连接
多肽在植物体内可剪切的特点，利用连接多
肽编码序列将功能基因连接起来，然后置于
同一个表达框内［６－８］。与前一种方法相比，利
用连接多肽构建的融合基因，在植物体内表
达后，生成的是两种独立的功能产物，而不是
两种基因的融合蛋白。植物基因工程育种
中，构建融合基因应用较多的连接多肽是
２Ａ。２Ａ来自于口蹄疫病毒，编码２０个氨基
酸。在真核生物体内表达时，不需要任何蛋
白酶的参与，２Ａ在第１９个氨基酸和第２０个
氨基酸之间发生自我剪切，因此，利用２Ａ编
码序列构建的融合基因能有效维持融合基因
中不同基因的生物学功能［８－１０］。
笔者利用２Ａ编码序列连接携带有信号
肽的抗菌肽基因ＣＢ和ＨＬｙ，构建可剪切融
合基因ＣＢ：ＨＬｙ，并将该基因置于超量表达
启动子 ＣａＭＶ３５Ｓ之下，构建 ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：
ＨＬｙ植物表达载体，通过遗传转化，获得转
基因锦橙植株，并利用 Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ分析
了融合基因ＣＢ：ＨＬｙ在转基因锦橙中的表
达情况，以期为柑桔基因工程抗病育种提供
参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料
植物表达载体ｐＬＧＮＬ、ＤＨ５α大肠杆菌
感受态细胞、ＥＨＡ１０５根癌农杆菌感受态细
胞及锦橙无菌上胚轴均由本实验室提供。
１．２ 载体设计、构建与鉴定
设计ＣＢ：ＨＬｙ融合基因序列，送上海英
俊公司合成。用连接多肽２Ａ编码序列连接
抗菌肽基因ＣＢ和人溶菌酶基因ＨＬｙ，合成
可剪切融合基因ＣＢ：ＨＬｙ，然后以本实验室
保存的质粒ｐＬＧＮＬ为骨架，对质粒ｐＬＧＮＬ
和ＰＧＥＭ－ＣＢＨＬｙ分别用ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ
双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切
胶回收目的片段，连接形成３５Ｓ调控的抗菌
肽－人溶菌酶融合基因植物表达载体，命名为
ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：ＨＬｙ（见图１）。以 ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：
ＨＬｙ转化大肠杆菌ＤＨ５α，提取大肠杆菌质
粒，用 ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲⅠ双酶切，鉴定片段
是否正确插入。
P2X35S GUS：NPTⅡ NOS PCaMV35S AAT CB 2A PRLa HLy NOS
　注：ＣＢ为ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ抗菌肽基因；ＨＬｙ为人溶菌酶基因；２Ａ为连接多肽２Ａ的编码序列；ＡＡＴ、ＰＲＬａ为胞外信号肽
的编码序列；ＮＯＳ为终止子；ＰＣａＭＶ３５Ｓ为组成型启动子；ＧＵＳ：ＮＰＴⅡ为β－葡萄糖苷酸酶与新霉素磷酸转移酶编码序列的
融合基因；Ｐ２Ｘ３５Ｓ为增强型启动子。
图１ 抗菌肽－人溶菌酶融合基因植物表达载体（ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：ＨＬｙ）Ｔ－ＤＮＡ结构示意
１．３ 遗传转化
参照 Ｈｅ等［１１］的农杆菌介导法进行锦
橙上胚轴遗传转化，经组织培养后转化的上
胚轴再生不定芽，经卡那霉素（Ｋｍ）抗性筛
选获得拟转基因不定芽，待不定芽长到１ｃｍ
左右时，进行 ＧＵＳ染色鉴定，将 ＧＵＳ阳性
芽嫁接到锦橙实生苗上，待幼苗长到５ｃｍ左
右时再嫁接到资阳香橙实生苗上，温室培养。
２
　第２期　 　解栋梁，等：抗菌肽－人溶菌酶融合基因的构建及转入锦橙后的表达分析
１．４　 ＧＵＳ染色鉴定
在锦橙上胚轴遗传转化中，经 Ｋｍ筛选
的不定芽长到１ｃｍ时，切取叶尖部分放入新
鲜配制的Ｘ－Ｇｌｕｃ染色液中，３７℃保温过夜。
若染色液变为蓝色，则此叶尖所在的不定芽
为阳性，从而筛选出ＧＵＳ阳性不定芽，同时
对ＧＵＳ阳性芽进行统计分析。
１．５ 转基因植株ＰＣＲ鉴定
ＧＵＳ阳性芽嫁接植株在温室中生长３
个月后，取叶片约１００ｍｇ，使用Ａｉｄｌａｂ公司
试剂盒（Ｎｏ．ＤＮ１５）方法提取基因组 ＤＮＡ，
用引物对 ＮＰＴⅡ－Ｆ（５’－ＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧ－
ＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧ－３’）／ＮＰＴⅡ－Ｒ（５’－ＧＣ－
ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣ －３’）进行
ＰＣＲ扩增（目的片段大小为６００ｂｐ），检测外
源基因的整合情况。反应体积２５μＬ。反应
条件：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，
７２℃１ｍｉｎ，３０次循环；７２℃１０ｍｉｎ。以非
转基因植株为对照。
１．６ 转基因植株Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ分析
取转基因植株叶片提取总 ＲＮＡ（Ａｉｄ－
ｌａｂ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＮ０９），反转录成ｃＤＮＡ（ＢＩＯ－
ＲＡＤ　ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，ｃａｔ．
Ｎｏ．１７０－８８９１），按照Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ试剂盒
（ＢＩＯ－ＲＡＤ　ｉＱＴＭ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ，
ｃａｔ．Ｎｏ．１７０－８８８２ＡＰ）说明书进行定量分析。
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ检测目的基因引物对及内参基因
引 物 对 序 列 如 下：ＣＢ－Ｆ （５’－ＣＡＧＧＡ－
ＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＡＡ－３’）／ＣＢ－Ｒ （５’－
ＴＧＧＧＧＴＡＴＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＧＣ－３’），ＨＬｙ－
Ｆ （５’－ＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧ－
３’）／ＨＬｙ－Ｒ（５’－ＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡ－
ＡＣＧＣ－３’），Ａｃｔｉｎ－Ｆ（５’－ＣＡＴＣＣＣＴＣＡＧ－
ＣＡＣＣＴＴＣＣ－３’）／Ａｃｔｉｎ－Ｒ（５’－ＣＣＡＡＣＣＴ－
ＴＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣ－３’）。以野生型植株作
为对照。
２ 结果与分析
２．１ 表达载体的鉴定
以 ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：ＨＬｙ 转 化 大 肠 杆 菌
ＤＨ５α，提取大肠杆菌质粒，用 ＨｉｎｄⅢ和
ＥｃｏＲⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，得到大
小１　３００ｂｐ的片段（见图２），与理论上酶切
所得的ＤＮＡ片段大小一致。说明，ｐ３５Ｓ：：
ＣＢ：Ｈｌｙ构建正确。
1 300 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ｍ：ＤＬ１５０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１～１０：ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：Ｈｌｙ阳性菌
图２ 抗菌肽 －人溶菌酶融合基因植物表达载体（ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：ＨＬｙ）阳性菌的鉴定
２．２ 表达载体的转化效率
试验结果看出，共染色再生芽１　０７４株，
获得ＧＵＳ阳性再生芽７７株，ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：Ｈｌｙ
的转化效率为７．１７％。
２．３ 转基因植株的ＰＣＲ鉴定
ＰＣＲ结果显示，绝大部分 ＧＵＳ阳性芽
再生植株均扩增出了预期目的片段（大小为
６００ｂｐ的ＮＰＴⅡ基因特异片段），未转化对
照植株均没有扩增出该片段（见图３）。本试
验共获得ＰＣＲ阳性植株３２株。
２．４ 转基因植株Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ分析
结果显示，ＣＢ和ＨＬｙ基因在转ｐ３５Ｓ：：
３
中 国 南 方 果 树／ＳＯＵＴＨ　ＣＨＩＮＡ　ＦＲＵＩＴＳ 第４４卷
ＣＢ：ＨＬｙ植株中均成功表达，同植株中ＣＢ 表达水平显著高于ＨＬｙ表达水平（见图４）。
600 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15CK- CK+
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；ＣＫ－：非转基因对照；ＣＫ＋：质粒；１～１５：转基因植株。
图３ 转抗菌肽 －人溶菌酶融合基因锦橙的ＰＣＲ 检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12CK
100 000
80 000
60 000
40 000
20 000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12CK
25 000
20 000
15 000
10 000
5 000
0
相
对
表
达
量
CB HLy
相
对
表
达
量
ＣＫ：非转基因锦橙；１～１２：ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：ＨＬｙ转基因锦橙植株
图４ 转抗菌肽 －人溶菌酶融合基因锦橙植株中ＣＢ 和ＨＬｙ的相对表达量
３ 讨论
本研究利用连接多肽２Ａ的编码序列连
接两种抗菌基因ＣＢ和ＨＬｙ，构建融合基因
ＣＢ：ＨＬｙ 及其植物表达载体 ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：
ＨＬｙ。理论上，连接多肽２Ａ 会在１９和２０
个氨基酸之间自我剪切，因此，在锦橙中表达
的抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ的Ｎ端会多出１９个氨
基酸，ｈｕｍａｎ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ的Ｃ端会多出一个氨
基酸，可能会对抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ的杀菌活
性稍有影响，但多出的氨基酸有助于抗菌肽
延长半衰期。利用表达载体ｐ３５Ｓ：：ＣＢ：Ｈｌｙ
对锦橙进行遗传转化，通过 ＧＵＳ化学染色
及ＰＣＲ鉴定，获得转基因植株３２株；Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ分析证明了融合基因在转基因锦
橙中得到了高效表达。转基因植株对柑桔黄
龙病和溃疡病的抗性评价正在进行中。
参　考　文　献
［１］ 周继章．抗菌肽抗病的研究进展［Ｊ］．中国畜牧兽医，
２０１２，３９（７）：２０４－２０８
［２］ 张召兄，潘晓亮，任耀军．抗菌肽概述及抗菌分子机理
的研究进展［Ｊ］．草食家畜，２００６，２７（４）：７－１０
［３］ 冯 瑄，杨晓燕，边六交．抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ－人溶菌酶
融合蛋白表达载体的构建［Ｊ］．生物技术，２００４，１４
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［４］ 贾向志，李 元，马文煜．溶菌酶的研究进展［Ｊ］．生物
技术通讯，２００２，１３（５）：３７４－３７７
［５］ 武东亮，郭三堆．融合基因研究进展［Ｊ］．生物技术通
报，２００１，１７（２）：５－７
［６］ 汪小福，刘仁虎，陈笑芸，等．可剪切多拷贝抗菌肽融
合表达载体的构建［Ｊ］．遗传，２００７，２９（６）：７５８－７６４
［７］ 孙兆明，于士柱，安同岑，等．ＧＳＴ－ＮＬＳ（ＩＮＧ１）融合
蛋白表达载体构建及表达纯化的研究［Ｊ］．国际生物
医学工程杂志，２００６，２９（２）：６９－７２，８０
［８］ 李艳萍，郎志宏，李 敏，等．融合基因在转基因植物
中的应用［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００７，２７（５）：
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［９］ Ｆｒａｎｃｏｉｓ　Ｉ　Ｅ，Ｄｅ　Ｂｏｌｅ　Ｍ　Ｆ，Ｄｗｙｅｒ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎ－
ｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００２，１２８（４）：１３４６－１３５８
［１０］Ａｍｒａｎｉ　Ａ　Ｅ，Ｂａｒａｋａｔｅ　Ａ，Ａｓｋａｒｉ　Ｂ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｏｒｄｉ－
ｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，１３５（１）：１６－２４
［１１］何永睿，邹修平，彭爱红，等．根癌农杆菌介导的柑桔
遗传转化技术［Ｊ］．热带作物学报，２００４，２５（ｌ）：１１－１６
（责任编辑：李治飞；英文编辑：董朝菊）
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