全 文 ：生物技术通报
· 技术与方法 · 丑了口
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了讯



 年增刊
应用生物技术保存地方猪种种质资源研究
张德福 ‘,
戴建军’,
吴彩凤 ‘,
杨山亭’,
王磊 ’,
, 殷方芝 , ,


‘上海农业科学院畜牧兽医研究所

上海农业遗传育种重点实验室
动物遗传工程研究室 , 上海

 

 ’南京农业大学动物科技学院 , 南京



摘 要
我国地方猪种资源十分丰富 , 拥有许多突出特性的品种 , 受到国内外养猪业者的重视 。 由于种种原
因 , 有些猪种濒临绝种 。 生物技术的发展给地方猪种种质资源长期保存带来了希望 。 结合课题组近年来来的相关
工作 , 概述了我国地方猪种资源概况及保种的迫切性 , 冷冻保种研究现状及地方猪种种质资源长期保存的主要技
术 , 包括猪种配子和胚胎冷冻技术 、基因组
 库、猪体细胞克隆技术及其在长期保存种的作用 。
关键词
地方猪种 长期保存

























































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K e y w o rd s : 肠ealpig bre ed Lo ng一 t e rm e o n s e rv a t i o n
中国是一个猪种资源十分丰富的国家 , 自20 世
纪 50 年代至 80 年代初 , 经多次普查 , 对原有的 10
多个地方猪种经整理归纳 , 目前有 76 个地方猪
种川 , 其中已列人《中国猪种品种志》的有 48 个〔’〕。
这些品种曾以独特的特性受到国内外养猪业者的重
视 , 如太湖猪的高繁殖力 , 民猪的抗寒性 , 香猪的肉
质等(许振英 , 1 9 89
)[
’] 。 然而 , 由于有些地方猪种
原产地位于偏远地区 , 其饲养范围越来越小 , 加之由
于保种不当和盲目引进外来品种与之杂交 , 造成原
有品种数量锐减和质量下降 , 有些品种甚至绝种或
已濒临绝种 , 如河北省深县猪和河北省定县猪等已
绝种 ;福州黑猪 、莆田黑猪 、广东大花白猪 、 蓝塘猪等
ro 余个猪种已濒临绝种 。
如何保护这些优良的地方猪种资源 , 不仅是发展
我国当前经济 , 造福未来的需要 , 而且其成功的经验
对于世界猪种遗传资源的保存具有重大的指导意义 。
对我国猪种种质资源的可持续性利用意义重大 。 结
基金项目:本研究由上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字「20 3 〕第 14 一 1 号 , 沪农科攻字【20 5 〕第 3一 号 ) ;上海市科技兴农推广项
目(沪农科推字20 7一 号 );上海市科学技术发展基金(编号:01 490 90 5 , 04 D zD 5 6l l) 提供资助 。
作者简介:张德福 (1963一 ) ,男 , 研究员 , 研究方向为胚胎生物技术
生物技术通报 B 勿te ch n口勿舒 2008 年增刊
合我课题组近年来来的相关工作总结如下 。
1 冷冻保种研究现状
猪种遗传资源保存主要有3 种方法 :活体原位
保存、配子或胚胎的超低温冷冻、 D N A 保存。 此外 ,
随着体细胞核移植技术的成功和完善 , 体细胞保存
也将成为很有希望的一种方式 。
活体保存是目前最常用的方法 , 可以在利用中
动态地保存资源 , 其弊端在于一般需要设立专门的
保种群体 , 维持成本很高 , 在我国这样一个拥有大量
优良地方品种的发展中国家 , 全部采用此原始保种
方法显然是不现实的。
随着生物技术的发展 , 超低温冷冻方法保种有
可能部分替代活畜保种 , 冷冻保种与活畜保种相比 ,
其优越性至少在下列几个方面是显而易见的:(l)
可以大量回收供体的配子和胚胎 , 便于迅速挽救那
些即将灭绝 、数量有限的品种 。 ( 2) 配子和胚胎冷
冻保存的年限 , 目前认为可达 20 年以上〔‘〕, 相当于
极大延长了世代间隔 。 因而基本上不需考虑诸如漂
变 、交配体制 、 留种 、 近交系数等活畜保种面临的问
题 。 ( 3) 冷冻保种主要考虑冷源 (液氮)的维持 , 不
受地域及生态环境等条件的限制 。 ( 4) 冷冻保种保
险系数大 , 它克服或减轻了活畜保种中疾病 、自然灾
害及战争等因素造成的保种困难;在胚胎的透明带
内始终未发现病原体 , 完整的透明带对细菌和病毒
是一有效的屏障。 胚胎冷冻为建立胚胎库奠定了基
础 。 ( 5 ) 保种费用大大减少 , 使得全面保种成为可
能 。 同时冷冻配子 、胚胎可以远距离运输 , 节省人
力 ·物力和财力[5] 。
以冷冻配子 (精子 、卵子 )和胚胎保存家畜遗传
资源 , 早在70 年代就有一些国家做了有益的尝试 。
19 71 年英国建立了家畜原种精液库 , 保存了 30 个
牛品种和 38 个绵羊品种的冻精;1978 年至今美国
杰克逊实验室已冷冻保存了 2 00 多个品系 , 10 0 多
万枚小鼠胚胎〔‘]; 19 80 年原西德建立了牛的胚胎
库[’〕;前苏联至少冷冻保存了 26 个品种 19 2 头公牛
的 12 .3 万份精液和 3 个品种 252 只公羊的 45 .6
万份精液 。 近年来 , 随着低温生物学技术的日趋成
熟 , 冷冻保种越来越受到各方面的重视 , 并已被列人
保种工作的议事日程 。 在我国 , 家畜遗传资源的保
护已被列为 “ 九五 ”计划的重要内容 。 鲁西黄牛等
少数品种精子和胚胎库的建立成为这一领域的良好
开端〔8) 。 虽然猪冷冻配子(精子 、卵子)和胚胎保存
由于技术难度大 、冻后存活力偏低等原因在我国开
展较少 , 但其研究价值及开发应用的前景仍是毋容
置疑的。
地方猪种资源基因组 DN A 库的建立 , 对地方猪
种资源的保存能够起到积极的作用 。 可通过收集全
国各地地方猪种组织 、 血样 , 提取基因组 D N A , 建立
了地方猪种遗传资源基因库。 在此基础上 , 可建立
D N A 基因组文库 , 作为一种新型的遗传资源保存方
法 , 虽然 目前基本上处于研究阶段 , 但随着分子生物
学和基因工程技术的完善 , 可以直接在 DN A 分子水
平上有 目的地保存一些特定的性状 , 即基因组合 , 通
过对独特性能的基因或基因定位 , 进行 D N A 序列分
析 , 利用基因克隆 , 长期保存 DN A 文库 。 这是一种
最安全 、最可靠 、 维持费用最低的遗传资源保存方
法 。
2 猪配子和胚胎冷冻技术的发展现状
家畜精液的超低温冷冻保存技术的雏形 , 是
194 9 年 Po lge 等发现甘油对精子的保护作用之后奠
定的 , 此后的几十年来 , 牛的冷冻精液已经在世界各
地普遍推广 , 与牛 、羊等家畜相比 , 猪的冷冻精液应
用还相当有限 , 部分原因是因为猪冻精活低 、受胎率
低 、产仔数较鲜精少 ;部分原因是因为猪精液量大 ,
传统的麦管(0.25/0 .sm l) 实际应用中操作不便;而
颗粒法冷冻 , 易造成污染且不易标记 。 国内外畜牧
研究人员一直在探索猪大容量包装如 sml 塑料袋、
大管(sm l) 精液冷冻技术 , 使之像牛 、羊等家畜一样
做到一支麦管精液输一头母猪 。 近年来我课题组在
猪大管(sm l) 精液冷冻技术上有所突破 , 为猪冷冻
精液的进一步推广应用提供了技术支持【’”】。 国外
已有通过建立精子库进行猪种资源保存的报道[4]。
卵母细胞由于对低温环境更为敏感 , 直到近 ro
年来才有冷冻成功的报道 。 人们对处于不同发育阶
段的卵母细胞进行冷冻 , 已有小鼠 、 人 、兔和肉牛的
后代出生 , 小 鼠卵母细胞的冷冻技术已基本成熟 。
国外已能从未成熟的卵母细胞得到冷冻 一解冻 一体外
成熟一体外受精一体外培养 一胚胎移植的犊牛【’〕;并且
证实 , 从冷冻卵母细胞得到的胚胎再行冷冻一解冻
后 , 与正常冻胚的存活力及发育能力没有差异 。
年增干IJ 张德福等 :应用生物技术保存地方猪种种质资源研究 119
众所周知 , 猪卵母细胞和胚胎由于脂滴含量较
高等原因 , 与其它家畜相比对低温的耐受性更差 , 这
给猪卵母细胞和胚胎的冷冻造成了很大的困难 。 目
前 , 主要集中在 GV 、 M n 期猪卵母细胞研究方面 , 并
取得了一定的进展 , 前期我们课题组通过相关研究
从细胞骨架及其超微结构水平上 , 阐明了猪卵母细
胞冷冻损伤的机制【” ·”] 。 但是要通过建立卵母细
胞库 , 达到保存地方猪种遗传资源的目标尚有很多
技术障碍承待攻克 。 此外卵巢组织 (包含原始卵
泡)的冷冻保存是雌性配子保存研究中的一条新思
路 , 卵巢组织冷冻的目的是保存卵巢皮质部分的卵
母细胞储备—原始卵泡 , 冷冻保存的卵巢组织可以被用作自体、异种移植或原始卵泡的体外成熟 ,
e
o rt v 五n dt 等(1995)[’‘]获得了冷冻卵巢组织原始卵
泡体外成熟小鼠后代。 人 、牛和绵羊卵巢组织的冷
冻保存也取得了较大的进展 , 因此对猪可予借鉴 。
猪的胚胎冷冻保存技术 , 相对其它动物一直进
展较为缓慢 , 直到 1989 年才获得成功( 一 35 ℃ )[ ” ] ,
至 1990 年常规液氮冷冻保存( 一 19 6 ℃ )也相继成
功【‘6 〕。 国内有关猪胚胎冷冻保存的报道较少 。 冯
书堂(19 91) 【’。〕首先报道了在 一 20 ℃下短期冷冻保
存猪胚胎移植产仔的消息 。 王祖昆 ( 19 98 )f川 、徐
晓波等(19% )[ ”]也进行了胚胎冷冻方法的研究 。
但总的说来冷冻保存效果不甚理想 。 虽然后来研究
者通过离心 、显微操作去除脂滴;采用孵化囊胚在一
定程度上提高了冷冻效率 , 但这些方法的可操作性
不强 , 另外孵化囊胚阶段的胚胎由于没有了透明带 ,
造成了病原体污染的机会(国际胚胎移植协会 IE TS
规定 , 用于国际间交流的动物胚胎必须保持完整的
透明带) 。
超低温冷冻保存技术尤其是玻璃化冷冻保存技
术的发展和 日趋成熟 , 给猪胚胎冷冻保存的实用带
来了可能 。 19 9 6 年 , V aj ta 发明了拉细开 口型细管
(OPS )玻璃化冷冻方法 。 他将常规使用的塑料细管
加热后拉细 (管内径由 1.7m m 拉细到 o.sm m ) , 拉
薄(管壁厚度由0 .巧m m 拉薄到 0.07 m m ) , 冷冻前
将含有胚胎的玻璃化冷冻液微滴(l 一 3 闪)利用虹
吸法吸人细管 , 不经封 口就直接浸人液氮中冷冻 。
使降温速度 (由2 0 0℃ / m in , 提高到 20 00 ℃ / m in ,
瞬间跨过损伤胚胎的敏感温度区域 。
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。等人【”〕在 1997 年首次报道了利用 o PS
法冷冻体内生产的猪胚胎(桑堪胚至扩展囊胚 ) 。
他先将胚胎放人含 75 % EG + 75 % D M SO 的冷冻液
中 , 在 39 ℃的恒温板中平衡 3m in 后移人含 18 % E G
+ 18% D M SO + 0.6m oF L 蔗糖的玻璃化液305后投
液氮 , 结果获得了 91 % (48/ 53 )的胚胎冻后存活率
和 67 % (26 /39 )的孵化囊胚率。 利用相同方法冷冻
的 4 一 8 细胞阶段的猪胚胎 , 也获得了 58 % (7/12 )
的存活率和 3 % (4/l 2) 的孵化囊胚率 。 这是冷冻
处于紧凑桑棋胚前的猪胚胎首次成功的报道 , 结果
令人鼓舞。
此后又有许多 OPS玻璃化冷冻猪胚胎取得了
令人满意的结果 。 B e rt h e z o t 等(20 0 )[’‘]将 40 枚
OPS 玻璃化冷冻胚胎 (囊胚 )移植给 20 头受体猪
(20 枚/头) , 结果 11 头妊娠 , 产仔 38 头;Berthelot
等(20 2)[”〕又将 200 枚 。邢 玻璃化冷冻胚胎 (囊
胚)移植给 10 头受体猪 , 结果 8 头妊娠 ,产仔59 头 。
B e rt h e l o t 等(2003 )[20 ]综合了近几年猪胚胎的冷冻
保存结果 :将 1 237 枚 O PS 玻璃化冷冻猪胚胎移植
到 56 个受体猪 , 结果 28 头妊娠 , 产仔 12 8头 。 此外
K ouj i M isum i(20 3 )等[川微滴(M iero droplet)玻璃化
冷冻方法也起到了较好的效果 。 本实验室于 2005
年8 月在国内首次成功获得了玻璃化超低温冷冻保
存猪胚胎的后代仁’“〕, 为利用胚胎冷冻技术保存地方
猪种资源奠定了基础 , 较大样本 (共 43 头母猪) , 冷
冻胚胎移植妊娠率在 40 % 左右 。
3 猪体细胞克隆技术
w izmut等(1997)〔”」获得克隆羊之后 , 牛 、小鼠
和猪等动物的体细胞克隆也相继获得成功〔23 一”〕, 证
明动物体细胞和生殖细胞一样具有全能性 , 目前研
究者已开始利用体细胞克隆技术进行濒危动物的保
种研究 [’8 , ” ]; 相对而言 , 猪的体细胞克隆研究进展
较慢 , 其主要原因是猪的生殖细胞 、胚胎体外显微操
作难度较大;妊娠维持有别于其它家畜 , 需具备一定
量的胚胎数 。 所以直至 200 年才有所突破 , 获得体
细胞克隆后代。 此后多个研究小组都得到了体细胞
克隆猪 , 又有多例转基因克隆猪获得成功的报道 。
近几年中国大陆在猪体细胞克隆研究方面取得了突
破性的进展 , 2 0 5 年中国农业大学成功克隆出了中
国第一头克隆猪 , 此后东北农大 、上海农科院和广西
生物技术通报 B to te ch n oto盯 B “le 而 2008年增刊
农大也相继成功获得体细胞克隆猪 , 使我国挤身于
国际猪体细胞克隆研究先进国家行列 。 随着体细胞
克隆技术的进一步完善 , 将为我国优良地方猪种的
保种及优良猪种资源的高效利用提供一条新的途
径 。
参 考 文 献
1 赵书光主编. 中国养猪大成. 北京 :中国农业出版社 , 2 0 1 .
2 中国家畜家禽品种志编委会. 中国猪品种志.上海: 上海科学出
版社 , 1 9 8 6 .
3 许振英. 中国地方猪种种质特性. 浙江科学技术出版社. 1989 .
4 常万存 , 贾青 , 路兴中. 中国畜牧杂志 , 1 9 8 , 3 4( 1 ) : 49 一 50 .
5 杜立新 , 张沉. 黄牛杂志 , 1 9 9 3 , 1 9 ( 2 ) : l 一 4 ; 19 ( 3 ) : l 一 3 .
6 张德福 , 等. 上海实验动物科学 , 2 0 3 , 2 3 ( 2 ) : 1 19 ~ 1 2 .
7 B re m e
,
B re
n
i
n
g B
,
M
u
l l
e r
M
, e t al
. 编著.周鼎年 , 缪卓然校译 ·
用现代生物技术异地冷冻保存濒危牛的基因. 北京 :中国农业出
版社 , 1 9 9 2 .
8 常洪等. 家畜遗传资源学纲要. 北京:中国农业出版社. 19 95 :12
~ 34 .
9 孙青原. 国外畜牧科技 , 1 9 93 , 2 0 ( 6 ) : 8 一 10 .
ro 冯书堂 , 刘殿魁. 畜牧兽医学报 , 19 93 , 2 4 ( 1 ) : 41 一 4 .
fl 王祖昆 , 张守全. 广东畜牧兽医科技.1998 , 23 ( 4 ) : 13 一 14 .
12 徐晓波 , 小岛敏之. 江苏农业学报. 19% , 12 ( 4 ) : 41 一 46 .
13 陈大元. 中国科学院院刊 , 2 创刃 , ( 2) : 1 20 一 1 21 .
1 4 C o rt vri
n d t R , L i u J
,
S m i tz J
.
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.
1 5 H 即as hi s , e t al . V e t R ec . 1 9 8 9 , 1 2 5 ( 2 ) : 4 3 一 4 .
1 6 K as h iw a s a k i N , e t 习. Th eri oge nolo群 , 1 9 9 0 , 3 5 : 2 2 1 .
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.
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e
p 耐 FertilDev, 1 9 9 8 ,
1 0
(
4
)
:
3 6 9
一 3 7 8
.
2 9 张德福 , 刘东 , 等.生物技术学报 , 2 0 6 , 2 2 ( 5 ) : 8 45 一 8 49 .
3 0 张德福 , 刘东 , 吴华丽 , 郑筱峰 , 王 昭凯 , 王 少兵.猪精液大管
(snil )冷冻技术研究.中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第 13
届学术研讨会论文集 , 4 8 一 4 93 .
3 1 W I C 由一 h o n g , R U I R o n g , D A I J i a n 一u n , e t al . M o l e e u l ar R e p ro -
d
u e t i
o n
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l
o p m e n t
,
2
(X)
6
,
7 3
:
1 4 5 4
一 1 4 6 2
.
3 2 张德福 , 等.中国农业科学 , 2 (X) 6 , 3 9 ( 6 ) : 1 2 3 3 一 1 2 4 0 .
( 上接第 116 页)
17 晓ldy Re , R am m i n g D W , E m e rs h ad R L , e t al . H o rt i s e i e n e e ,
1 9 8 9
,
2 4
(
5
)
:
8 2 0
一 8 2 2
.
18 母锡金 , 于文玲 , 蔡达荣 , 等.植物学报 , 19 90 , 32 : 4 25 一 4 31 .
1 9 邓秀新 , 郭文武.孙绪华.园艺学报 , 1 9 9 6 , 2 3 ( 3 ) : 2 3 5 一 2 4 0 .
2 0 黄志文 , 何月清.华南农学院学报 , 19 8 1 , 2 ( 4 ) : 43 一 50 .
21 王元裕 , 周碧英 , 高士贤 , 等.园艺学报 , 1 98 1 , 8 ( 1 ) : 13 一 17 .
2 2 玩sley JW , B o n n e r J . P 刚 Amer Soc Hort Sei, 1 9 5 2 , 6 0 : 2 3 8 -
2 4 2 2 3 R
am
m i
n g D W
.
H
o rt s
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,
1 9 9 0
,
2 5
:
3 9 3
一 3 9 8
.
2 4 K an th a r aJ 曲 A S , M e e o n e h i e C A , D od d W A . A n n al s of B o t an y ,
1 9 9 2
,
7 0
(
2
)
:
1 5 3
一 1 5 6
.
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3
)
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