全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
饲养层及细胞因子对鸡 PGCs体外培养的影响
张秋婷 1, 2 　苗向阳 1 　安铁洙 2
(1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 ,北京 100193; 2 东北林业大学生命科学学院 , 哈尔滨 150040)
　　摘 　要 : 　原始生殖细胞 ( PGCs)具备发育全能性 ,而且数量较多 ,与数量较少的内细胞团 ( ICM )相比更有利于进行分离
克隆。不同动物的 PGCs的生长条件不同 ,因此建立适宜的培养体系是 PGCs培养的关键。对饲养层细胞及细胞因子对鸡
PGCs体外培养的影响作了简单的介绍。
关键词 : 　原始生殖细胞 　饲养层 　细胞因子 　细胞培养 　鸡
Effect of Feeder Layers and Exogenous Cell Factors on in V itro
Culture of Chicken Primordia l Germ Cells
Zhang Q iuting1, 2 　M iao Xiangyang1 　An Tiezhu2
(1 Institu te of Anim al Sciences, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100193;
2 N ortheast Forestry University, the Academ y of L ife Sciences, Harbin 150040)
　　Abs trac t: 　Primordial germ cells ( PGCs) have developmental totipotency, and quantities of PGCs are more than inner cell mass
( ICM ) , so PGCs are more advantageous to carrying out separation and clone1 Because cell growth conditions that animals need are in2
dividually, the key to culture PGCs is to establish app rop riate cultivation system1 This review introduced the effect of feeder layers and
exogenous cell factors on in vitro culture of chicken p rimordial germ cells1
Key wo rds: 　Primordial germ cells ( PGCs) 　Feeder layers　Cell factors　Cell culture　Chicken
收稿日期 : 2008212215
基金项目 :国家高技术研究发展计划 (“863”计划 )资助项目 (2008AA10Z140) ,中国农业科学院优秀科技创新团队资助项目
作者简介 :张秋婷 (19822) ,女 ,黑龙江 ,在读硕士 ,主要从事转基因鸡的研究 ; E2mail: gloriette@ qq1com
通讯作者 :苗向阳 , Tel: 010262895663, E2mail: mxy32@ sohu1com
　　原始生殖细胞 (p rimordial germ cells, PGCs)是
哺乳动物各级生殖细胞和成熟配子共同的祖细胞 ,
是传统胚胎干细胞 ( ESCs)分离克隆的材料来源之
一 ,传代后可形成胚胎生殖细胞 ( EGCs)。在体内 ,
PGCs发育分化为生殖细胞 ,提供物种延续的物质基
础 ;在体外 , PGCs经分离培养可建立多能干细胞
系 ———胚胎生殖细胞。
PGCs是一种多潜能细胞 ,具有无限增殖 ,自我
更新以及分化成代表 3个胚层组织细胞的能力 ,可
对其进行遗传操作 ,亦可冷冻保存而不失其多能性。
因此 , PGCs的分离培养为转基因动物生产、嵌合体
制作提供了良好的技术平台 ,在干细胞诱导分化及
组织工程研究中都具有巨大的应用潜力。可以作为
研究生殖细胞发育和分化极好的体外模型。
1　饲养层细胞
饲养层细胞是指一些特定细胞经有丝分裂阻断
剂处理后得到的细胞单层。PGCs体外培养的关键
是维持 PGCs的未分化状态 ,饲养层细胞一方面可
促进 PGCs的附着 ,另一方面可分泌一些促生殖抑
分化的细胞因子。目前 ,不同实验室培养 PGCs所
采用的饲养层细胞各异 ,常用于制作鸡 PGCs饲养
层的细胞种类主要有以下几种。
111　STO细胞
STO细胞因其能分泌白血病抑制因子 (L IF)等
而常被用作饲养层细胞 ,以维持 ES细胞的未分化
状态并促进细胞增殖。 STO 细胞是已建成的细胞
系 ,可以进行长期体外培养、传代和冷冻保存 ,节省
了制作原代成纤维细胞的繁琐工作 ,因此成为众多
研究者制作饲养层的初选材料。但是 , STO细胞须
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
用丝裂霉素 C来处理 ,若丝裂霉素 C清洗不干净则
会对 PGCs细胞产生毒害作用 ,而且 STO细胞死亡
时释放的细胞碎片和废物会影响 PGCs的生长。另
外 ,随着冻存 2复苏和传代次数的增加 ,其分泌能力
也将下降 ,并且容易老化。因此 ,便有了用其他细胞
代替 STO细胞来做饲养层细胞的想法和研究。
112　小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)
细胞分化抑制因子 L IF以两种方式存在 ,一种
是可扩展的蛋白质形式 ,另一种是与胞外基质相连
的固定形式。MEF与 STO 细胞一样也可以分泌
L IF,并且主要产生固定在细胞表面的 L IF。王娟
等 [ 1 ]的研究表明 ,用 MEF作为饲养层能获得连续增
殖的胚胎生殖细胞 ,与 STO相比较 , MEF更有利于
维持 PGCs的二倍体状态 ,即能更好地维持 PGCs的
正常核型。但随着传代次数的增加 , MEF分泌 L IF
的能力也会下降 ,而且丝裂霉素 C处理的 MEF细胞
存活时间较短 ,死亡的 MEF可能释放一些 DNA片
段或酶进入培养基中干扰 PGCs的生长和二倍体的
维持。一般选择 3～6代的 MEF制作饲养层。
113　鸡胚胎成纤维细胞 (CEF)
与 STO和 MEF相比 ,同源 CEFs更有利于 PGCs
的生长。 PGCs的迁移以及分化抑制因子对 PGCs
的抑制作用无种系特异性 ,可能由于模拟的同源
CEFs体外培养环境与 PGCs在体内的生长环境更
为接近。CEF的分泌物与 MEF相比更有助于激活
靶细胞 ,并刺激其表面 c2kit受体的表达 [ 2 ]。 Petitte
等 [ 3 ]采用原代 CEF作饲养层培养鸡胚胎干细胞 ,并
传至 2代。秦洁等 [ 4 ]的研究中结合冻存处理 ,使用
传至第 3代的 CEF作饲养层 ,可将鸡胚胎 PGCs传
至 6代。不传代或传 1代的 CEF杂细胞较多 ,而传
代次数过多 ,可能影响饲养层的使用寿命 ;而且传代
次数过多的 CEF也比较容易发生核型异常 ,使饲养
层的分泌功能受到影响。
114　性腺基质细胞 ( SCs)
近年来的研究显示 , SCs不但高表达 FasL ,还能
分泌多种蛋白、免疫保护因子、生长因子和营养因
子 , 对 PGCs的生长和增殖具有一定的促进作
用 [ 5, 6 ]。因此 ,将 PGCs接种在预先培养好的 SCs表
面可以 促进 PGCs大量增殖的同时抑制其分化 ,使
PGCs细胞在与体内相似的生长环境中生存 [ 7 ]。鸡
原代 PGCs与 SCs共同培养时的平均克隆数显著的
多于 STO , MEF和 CEF。但性腺基质细胞并不适于
PGCs的继代培养。继代培养时使用 MEF饲养层 ,
PGCs的平均克隆数显著多于 STO、CEF和 SCs[ 8 ] ,
可能因为各种饲养层细胞的分泌活性不同。由
PGCs到 CEG细胞的建系过程中细胞具备了自分泌
因子的某些活性 ,所以对外源细胞因子的反应性发
生改变 ,因此适合 PGCs原代培养和建系后传代培
养的饲养层细胞并不相同。
115　饲养层细胞的处理
饲养层细胞的操作是选择饲养层细胞种类之后
最重要的一个环节。秦洁等 [ 4 ]选择了传至 3代的鸡
胚胎成纤维细胞且进行冷冻保 2复苏的细胞作为饲
养层。因为经过冷冻 2复苏过程使得能够贴壁生长
的成纤维细胞都具有较高的活力 ,可以制备出高质
量的饲养层。冷冻 2复苏这一过程会给细胞带来或
多或少的损伤 ,由于多次的冻存 2复苏可能使细胞
STO的原有功能降低甚至丧失 ,所以在制备饲养层
时不宜使用冷冻 2复苏次数过多的细胞。
饲养层细胞质量的好坏还与丝裂霉素 2C的处
理有很大的关系 ,丝裂霉素 2C作用 2 h, PBS洗 8次
效果较好 [ 4 ]。此外 ,饲养层细胞的接种密度也可能
影响试验的最终结果。接种密度过大 ,易产生正常
细胞接触抑制现象 ,降低饲养层的活力 ,造成培养液
的快速消耗 ;接种密度过小 ,细胞不能形成饲养单
层。以 (3～5) ×105 个 /m l接种 ,效果较为理想 ,但
也不排除存在细胞类型差异的情况。
2　细胞因子
在胚胎及机体发育过程中 , PGCs的分裂增殖和
分化是同时进行的。因而抑制 PGCs的分化和促进
其增殖便成为一对矛盾 ,所以必须筛选适宜的培养
体系 ,通常采用在培养基中添加细胞因子的方法来
改善。自 1992年已经陆续发现一些维持 PGCs体
外存活、增殖以及保持发育全能性和不分化的必需
生长因子 ,主要有以下几种。
211　L IF
L IF是白介素 26 (L I26)的家族成员。L IF是一
种多效细胞因子 ,能抑制胚胎干细胞分化 ,维持发育
的全能性 ,且不依赖饲养层细胞 ,而直接作用于
PGCs[ 9 ]。该特性使 L IF成为一种在体外维持 PGCs
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2009年第 6期 张秋婷等 :饲养层及细胞因子对鸡 PGCs体外培养的影响
未分化状态的重要因子。L IF活化的 STAT3信号途
径是小鼠 ES细胞维持未分化状态的必要条件 ,能
够在血清存在的条件下促进小鼠 ES细胞的自我
更新。
L IF具有种属特异性。目前 ,依赖于 L IF /STAT3
的途径小鼠 ES细胞的自我更新已成定论。L IF /
STAT3信号途径的活化不支持人 ES细胞的生长 ,也
因有大量实验数据的支持而成为不争的事实。Horiu2
chi等 [ 10 ]用试验数据证明 ,鸡源性 L IF可以更好地维
持鸡 ES细胞的未分化状态。L IF可以在控制 PGCs
的分化方向和回复胚胎期多能状态以形成具有 ES性
质的细胞株方面起作用 [ 7 ]。但 PGCs的增殖与 L IF的
剂量并不呈绝对依赖关系。当 mL IF超过 20 ng/m l
时 ,细胞的增殖明显受到抑制 [ 11 ]。mL IF在一定剂量
下抑制细胞的分化的同时诱发了抑制细胞分列物质
的活性 ,或激活了细胞内潜在的一些负调控因子 ,导
致细胞增殖能力的降低。
212　SCF
SCF又称肥大细胞生长因子或 c2kit配体 ,通过
与 PGCs表面的 c2kit受体结合而发挥作用。SCF既
可以作用于早期多能干细胞、祖细胞 ,又可以作用于
成熟细胞 ;能诱导干细胞进入细胞周期 ,增强自我更
新能力 ,并增加干细胞对其他细胞因子的敏感性 ;与
其他因子协同作用时可以大大加强其作用。SCF可
抑制 PGCs凋亡并促进其增殖 ,增强有丝分裂原的
促增殖作用 [ 12 ]。因为 c2kit可诱导促毒性物质排除
细胞外的蛋白 ,从而减少细胞毒性素质对细胞的损
伤 ,利于细胞增殖。
在一定范围内 SCF的剂量与 PGCs细胞的生长
势态成正向关系。SCF用量有一定的阈值 ,若超过
这个阈值 ,会抑制 PGCs等增殖。因为当 SCF与
PGCs细胞膜上的受体 c2kit结合时 ,引起细胞的正
反馈机制发挥作用 ,促进细胞的增殖 ;但是当结合完
全时 , 继续加入 SCF不但无法促进细胞的增殖 ,反
而会引起细胞膜上一些负调控机制 ,抑制细胞的增
殖。当 SCF超过 20 ng/m l时 ,细胞的增殖即会受到
抑制 [ 11 ]。
213　bFGF
bFGF具有促进细胞有丝分裂、细胞增殖与分化
等多种生物活性 ,主要是与细胞膜上 bFGF受体结
合发生作用 [ 13 ]。将接种在 CV21STO 饲养层上的
PGCs培养 48 h后 ,额外添加 bFGF不能加强促增殖
作用 [ 14 ] ,对于接种在 STO饲养层上的 PGCs也得到
了相同的结果 [ 15 ]。说明 PGCs的增殖与 bFGF剂量
之间并不呈绝对的线性相关。体外培养中 , bFGF在
低浓度环境中发挥其作用 ,其原因与 SCF的作用机
理类似。
bFGF单独使用时作用较小 ,常与其他因子联合
使用。Stallock等 [ 16 ]发现 ,无论哪种饲养层 ,添加
bFGF都可以促进 PGCs的生长。 Pain等 [ 17 ]试验表
明 ,单独添加 L IF、SCF、bFGF时对鸡的 EG细胞增殖
的作用甚微 ,而混合添加时却能明显提高 EG细胞
的克隆率 ,说明 L IF、SCF、bFGF对 PGCs存在协同作
用。但是其作用并不是叠加的。每种因子都有自己
发挥正向作用的阈值 ,低浓度时 ,三者表现出协同作
用 ,若某种因子超过了自己的阈值 ,则表现出抑制
作用 [ 18 ]。
214　 IL211
IL211又称为脂肪形成抑制因子 ,由骨髓基质细
胞分泌产生。与 L IF、CNTF (纤毛状神经因子 )、
OSM (制瘤素 )、IL26同属于一个细胞因子家族。 IL2
11在一定浓度下与 IL23协同能显著增强细胞的集
落形成 ,而且加入 IL211后小鼠脾细胞形成集落的
时间明显缩短 [ 19 ] ,因此推断 IL211的作用或许是缩
短干细胞的静止时间。
单独使用 IL211时 PGCs的增值情况不如其他 3
种因子单独使用的效果 ,与其他因子联合使用时 ,活
细胞数明显增加 [ 11 ]。 IL211在发挥作用时具有多效
性和丰余性 ;一方面表现出多方面的调节功能 ,另一
方面 IL211与其他因子具有相似或重叠的功能 ,与
其他因子相互促进协同作用。
在 PGCs的分离培养过程中 ,除了要添加上述
生长因子外 ,根据需要可以添加一些其他细胞因子。
表皮生长因子 ( EGF)是一种广谱促分裂剂 ,能促进
细胞 DNA的合成和 mRNA的转录 ,并使细胞 S期提
前缩短细胞周期 ,对 PGCs细胞的增殖有促进作用。
胰岛素样生长因子 ( IGF21)可以增强胚胎中 DNA和
蛋白质的合成 ,促进细胞分裂 ,有效提高 PGCs的分
离。睫状神经营养因子 (CNTF)细胞因子在鸡原始
生殖细胞培养中对促进细胞增殖或抑制细胞分化也
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
存在着重要作用。
3　总结
鸡的 PGCs是研究禽类特有的胚胎发生、细胞
分化机制、发育的基因调控等良好的研究模型 ,最重
要的是可以以 PGCs为平台进行禽类转基因的研
究。正因如此 ,有关鸡 PGCs的研究受到了越来越
多的关注。由于 PGCs的体外培养需要处于精确而
复杂的微环境中 ,饲养层细胞及多种细胞因子同时
影响着 PGCs的生长 ,各种因子发挥作用是呈现相
互协同或是相互制约的。选择合适的饲养层细胞、
适当的细胞因子组合以及适量的剂量都有利于
PGCs生长增殖。因此对于 PGCs的培养和利用都
需要进行更加深入的研究 ,从而为禽类胚胎发育及
转基因模型的建立等提供良好平台。
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