全 文 ：胚胎干细胞建系方法
梁琳 王振飞 李煜
(内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特 010021)
摘 要: 胚胎干细胞具有的独特特征 分化全能性是生物学各研究领域多年来的热点之一。胚胎干细胞
独特的生物学特征在生殖细胞与体细胞及动物个体之间建立了广泛的联系。胚胎干细胞应用前景有着巨大的潜
力。为此, 对其培养建系的完善性研究显得格外重要。在此, 对胚胎干细胞建系方法方面做一简要综述, 尤其对建
系过程中内细胞团的分离方法及干细胞集落的获取方法进行探讨。
关键词: 胚胎干细胞 饲养层 内细胞团分离 细胞增殖 集落 ICM
Method of Establishing Embryonic Stem ( ES) Cell line
Liang Lin Wang Zhenfei Li Yu
( K ey L aboratory of Mammal R ep roduc ti v e Biology and Biot echnolog y , M ini str y of Educat ion ,
I nner M ong ol ia Univ ersi ty , H uhhot , China 010021 )
Abstract: Embryonic Stem ( ES) Cell w hich posses the omnipo tence and the ability to pro liferate indefinitely in
vitr o, The special feat her is the Ho tspo t o f bio log ical resear ch field. Embryonic Stem ( ES) Cells connect somatic cell
and germ cell w ith indiv idual anima l . t hat they have gr eat applications per spectiv e in physic. Culture and establish
the ES cell lines is becoming impo rtant as the w idely used of ES cells . T his ar ticle g ives a summary in the method o f
establishing the ES cell lines, especially in the iso lation of the ICM and the ES clones.
Key words: ES cell Feeder L IF Cell pro liferation ICM isolat ion
胚胎干细胞( ES cells)是从早期胚胎内细胞团
( ICM )或桑椹胚分离出来的高度未分化的全能性细
胞。体外培养的胚胎干细胞经诱导可分化为不同类
型的组织细胞, 在研究组织分化、组织修复、外源基
因导入等许多领域被广泛地应用。胚胎干细胞建
系,要求原代细胞具有良好的多向分化潜能, 同时要
求在传代过程中始终保持这种特性而不发生分化。
ES细胞的分离、培养和建系方法多种多样, 近年来
这方面的研究取得了一些新的成就,本文就此进行
讨论。
1 建立 ES细胞培养体系的方法
1. 1 有饲养层培养体系
胚胎干细胞是动物个体发生过程中具有全能性
的原始细胞, 维持 ES 细胞的不分化状态由细胞内
一些结构蛋白和多肽因子进行内源性调控。体外培
养的 ES 细胞, 接种在饲养层细胞上培养时可以长
时间保持 ES细胞的原初特性。用作饲养层的细胞
多数是具有贴附能力的细胞(如成纤维细胞、子宫内
皮细胞、3T 3细胞、肿瘤细胞等)。接种 ES 细胞之
前必须对饲养层细胞进行有丝分裂阻断, 使其保持
活力但不会增殖。由于细胞外基质中存在大量锚定
的 LIF 因子,从而可抑制 ES 细胞分化, 维持 ES 细
胞的增殖和多能性 [ 1]。饲养层的存在更好地模拟了
体内的生存环境, 有利于 ES 细胞保持旺盛的增殖
能力和维持低分化状态。
射线及丝裂霉素 C 均可抑制饲养层增殖。制
备饲养层细胞时, 培养皿也可预先用明胶 ( gelatin
0. 1%)处理,以增加细胞的贴壁能力和对 ES 细胞
的粘附性。在培养过程中,饲养层产生分化抑制因
子和增殖促进因子的能力逐渐降低, 故一周后不可
再使用。
小鼠胚胎原代成纤维细胞( PMEF)饲养层可用
收稿日期: 2005-11-28
作者简介:梁琳( 1981- ) , 女,蒙古族,内蒙古大学在读硕士,主要从事细胞培养方面的研究, Email: ndsky30311007@ 163. com
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
于大多数动物 ES 细胞的培养, 但不同种类动物胚
胎所需的最佳饲养层不尽相同。T homson 于 1998
年报道了利用小鼠 ST O细胞做饲养层,培养人受精
卵发育的内胚团细胞, 建立了人的 ES 细胞系 [ 2]。
Shamblot t于 5~ 6 周流产胎儿的生殖嵴细胞建立
了人 EG 细胞系[ 3] 。从小鼠 STO 饲养层细胞培养
液中提取的分化抑制因子( DIA)能部分抑制 EC 细
胞分化,但较 PMEF 培养的内细胞团中分离的 ES
细胞存活率及嵌合力低[ 4] ] 。
其他饲养层作用类似: 胎牛肝成纤维细胞
( BFLF)作为饲养层可用于培养分离到绵羊和山羊
类 ES细胞[ 5] , 原代鸡胚成纤维细胞饲养层可使小
鼠 ES细胞克隆传 10代以上 [ 6]。ES细胞在肿瘤细
胞饲养层上生长也较旺盛 [ 7~ 8]。
1. 2 无饲养层培养体系
饲养层细胞分泌的因子难以支持某些 ES 细胞
的增殖。ES 细胞也可在无饲养层细胞的环境中建
立和维持[ 9] ,培养液中添加 LIF 因子或使用能分泌
LIF 的细胞制备条件培养液均可。例如用大鼠肝细
胞( BRL)培养液制备大鼠肝细胞条件培养基( BRL-
CM )或 2 ~ 3 周龄大鼠心肌细胞培养基 ( RH –
CM )。含 70% RH-CM 的 ES 细胞培养基可以在
10~ 20 代内维持其未分化状态和正常二倍体核
型[ 10]。从小鼠 STO 饲养层细胞培养液中提取的分
化抑制因子( DIA )能部分抑制 EC 细胞分化, 但较
PMEF 培养的内细胞团中分离的 ES 细胞存活率及
嵌合力低[ 4] 。用于制备条件培养基的还有 HBC(人
膀胱癌细胞株 5637)和 PSA-1、T3 细胞(均为小鼠
EC细胞)等。也有学者认为 LIF 不能完全取代饲
养层的作用[ 11]。
在体外分离克隆 ES 细胞时, 除利用饲养层和
添加外源 LIF 外,杜宪兴等将外源 LIF 的 cDNA 引
入 ES细胞,建立了过度分泌 LIF 的 ESL ( + )细胞
株。可以在无外源 LIF 的常规培养液中传 13代以
上,可完全脱离外源性 LIF。
在一定浓度范围内, L IF 与 ES 细胞克隆效率
之间存在量效关系。浓度达到 1 000~ 5 000IU/ ml
时,从增殖的 ICM 分离 ES 细胞的效率可达 95%以
上。但对于家畜则争论较大:如 sSaito 认为 LIF 有
助于牛类 ES 细胞的分离 [ 12] , 而 Hocherau Bekev-i
ers等发现 LIF 对牛 ES 细胞的分离克隆无积极作
用; Booth认为无血清培养基中维持猪 ES 细胞克隆
必须有高浓度的 LIF( 10ng/ ml) , 而Shim认为猪 ES
细胞分离培养时, ST O 饲养层或 PGC 本身产生的
因子就足以维持其存活和增殖, 外源性 LIF 并非
必须。
Makino H 等认为鼠类 ES细胞也可以在固定
的 LIF 因子上进行培养, 其方法是合成明胶和 LIF
因子的混合物,将其铺在聚苯乙烯平皿上,晾干洗涤
至 LIF 不再释放 [ 13]。
2 胚胎采集
分离具有发育全能性的 ES 细胞, 要求选择合
适阶段的胚胎。采卵时一般取囊胚或后期桑椹胚。
胚胎体外培养时间过长也影响建系成功率。目前,
各种动物一般采用囊胚期胚胎来分离 ES细胞。在
小鼠试验中观察, 桑椹胚贴壁时间早、贴壁率高于囊
胚;但贴壁后易退化且传代情况不佳。这可能是由
于对体外培养系统适应能力不如囊胚 [ 14]。
3 ICM的获取
从着床前的胚泡中分离内细胞团, 是从早期胚
胎建立 ES细胞系的先决条件。常用的免疫外科手
术法、组织培养法和机械剥离法等,均可分离获得全
能性 ICM。
3. 1 直接分离法
此方法是将囊胚放在饲养层上让其自然孵出透
明带,贴附于饲养层。待 ICM 细胞扩大增殖时挑出
分离,移到铺有新饲养层的培养皿。若内胚层样细
胞形成则使得 ES 细胞增殖力降低且极易分化, 故
操作时选择消化时机非常重要。也可使用链酶蛋白
酶处理或机械切割将透明带除去, 获得裸胚直接培
养。
3. 2 免疫分离法
为了避免滋胚层细胞对 ICM 的竞争性抑制和
诱导分化作用,可以根据补体溶解抗原-抗体复合物
的免疫学原理, 去除滋养层细胞, 保留 ICM 细胞进
行培养。
操作时收集发育到囊胚晚期的胚泡, 先用0. 5%
链酶蛋白酶去除透明带,洗涤 3次后转移至补体灭
活的兔抗鼠脾细胞抗血清中(分离小鼠的 ES 细
胞) , 10~ 30分钟后,移到用培养液稀释的豚鼠血清
392006年第 1期 梁琳等: 胚胎干细胞建系方法
中。处理 10~ 30分钟左右,胚泡的滋养外胚层细胞
被破坏即成泡状, 此时转移洗涤, 微滴不宜过小, 否
则抗体和补体不易结合上去。吸取 ICM 细胞移到
铺有饲养层的平皿。经过培养, 约一周可以传代。
分别使用抗体补体的二步法较繁琐,可以用一步法
简化操作, 即直接去除裸露胚泡的滋胚层。将裸露
胚泡置于含有未灭活抗血清的和培养液 1 4 比例
的微滴中约 10分钟, 待滋胚层溶解后, 即囊胚腔萎
缩变小时,迅速移入不含抗血清的培养液中洗涤洗
液中[ 15] 。
3. 3 热休克法
在小鼠中有热休克法的报道。将收集的 2-细
胞至桑椹胚期的胚胎体外 37 培养 2h后置于 41
持续培养 1 ~ 2h。然后用于 ES 细胞的分离培养。
目的是阻滞胚胎的分化, 增加 ICM 的细胞数 [ 16]。
3. 4 延迟着床法
在胚胎早期,通过切除卵巢, 并辅以激素处理,
影响子宫内环境和胚胎正常发育而使胚胎着床延
迟[ 17]。此法可以增加内细胞团的细胞数,易于获得
干细胞。
不同方法处理的胚胎对 ES 分离培养也有影
响。Evans认为分离 ES 细胞必须在十分精确的时
间内进行,而延迟着床的囊胚正处于这一最佳时期。
可能是由于胚胎延迟着床增加了未分化细胞的增殖
时间,提高了建立 ES 细胞系的效率。其成功率达
47. 7%。但建立的细胞系是否易分化不明 [ 18]。桑
椹胚在体外培养中形成的囊胚也可用于 ES 细胞的
分离,与直接培养囊胚无显著差异。Eistet ter 认为
离散小鼠早期胚胎桑椹胚成的卵裂球( 16~ 22个细
胞) , 用来分离 ES 细胞, 较直接培养囊胚或桑椹胚
效果好。可能由于桑椹胚处于较早期发育阶段分化
程度较低,同时去除了滋胚层的分化诱导作用 [ 19]。
3. 5 ES细胞组织块培养
谌兵来等认为小鼠子宫内膜液中丰富表达的
LIF 与胚胎着床侵入子宫内膜无关, 而是维持内细
胞团不分化。在小鼠妊娠 4~ 6 天, L IF 为高表达
期,着床初期小鼠子宫内膜环境可能是一个天然的
ES细胞培养体系。小鼠子宫内膜组织中必定含有
大量的未分化抑制内细胞团分化的因子。这时取子
宫组织块用于分离培养 ES 细胞, 24~ 48 h 后便会
有 ES生长集落, 碱性磷酸酶染色成呈强阳性[ 20] 。
3. 6 饲养层倒置培养
该方法是将桑椹胚放入饲养层下方进行培养。
操作时用显微操作仪将桑椹胚植入饲养层下面, 或
者在饲养层上制备微穴, 将胚胎放入后再用饲养层
将其覆盖。二者均是利用压力等因素使滋胚层生长
受抑制,可避免滋胚层过度生长从而影响 ICM 增
殖。
4 内胚团的离散
分离 ICM 时可用吸管将其从滋养层细胞上转
移到胰蛋白酶微滴中, 大约 3~ 5 分钟 ICM 细胞彼
此解离。在 0. 25%胰酶/ 0. 04% EDTA 或 0. 125%
胰酶/ 0. 02% EDTA 酶消化液中添加 1%鸡血清,可
以减小对 ES细胞的损害而不降低消化能力。将内
细胞团离散成较小的细胞团(约 3~ 4个细胞)会提
高接种后克隆的形成比率。
细胞悬液转移到加有饲养层细胞的组织培养皿
中, 3~ 4 天可见分散的 ICM 细胞增殖形成克隆。
7~ 10天后将出现 ES细胞。从分离的 ICM 中获得
ES细胞系的成功率在 10% ~ 30%。
不同动物 ICM 增殖时间、离散时机对 ES集落
形成及建系率略有影响, 如 129/ ter、C57BL/ 6J、
BALA / C、KM 和 ICR小鼠品系 ICM 适宜的离散时
机分别为增殖 4 ~ 6d、3 ~ 3. 5d、4d、4~ 5d 和 4~
5d
[ 21]。
当 ICM 增殖到可以离散的程度时, 状态好的
ICM 因其外围粘性较大,、附着力强,故吸取时容易
丢失,这可通过加大大毛细吸管管末端直径解决。
为防止吸管丢失细胞, 可用微量加样器替代[ 21]。
5 ES细胞的鉴定
在体外培养形成细胞克隆后, 需进一步分析鉴
定。ES集落形态通常是排列很紧密的巢状,只要细
胞增殖而不分化, 集落的大小就会增加[ 22]。ES 细
胞的低分化状态也是决定其是否具有高生殖腺嵌合
能力的先决条件。作为从早期胚胎中分离而来的干
细胞系, ES 细胞具备一系列低分化指标, 常用的检
测指标有碱性磷酸酶、OCT-4、细胞特异性表面抗原
( SSEA- l)等。
测定胚胎干细胞的体内分化能力是通过制备嵌
合体来完成的。能够广泛的参与宿主个体的胚胎发
40 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
育过程,是胚胎干细胞能否用于遗传操作的最重要
的特性。
ES细胞系不仅是研究细胞分化的模型,也是研
究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验
体系,小鼠胚胎干细胞又是可以研究细胞致突变性
的细胞株, 具有广泛的应用前景。然而很多哺乳动
物只是建成了类 ES 细胞系, 距离我们的治疗性目
标仍有大量工作。建立各种动物 ES 细胞特异的高
效分化抑制体系及有效增殖的培养系统仍有待深入
探讨。
参 考 文 献
1 蒙超衡.广西科学, 2002, 9( 4) : 302~ 305, 311.
2 Th om son JA, lt sk ovit z-Eld or J, S hapi ro 55, et al . Scicnce, 1998,
282( 5391) : 1145.
3 尚克刚,胡新立,李子玉 等.北京大学学报(自然科学版) , 1994,
30( 4) : 500~ 508. .
4 安立龙, 杨奇, 窦忠英, 等. 中国兽医学报, 2002, 22 ( 2 ) : 187~
190.
5 M eineck T , Mein eck e B. Anim al Breed Genet ic, 1996, 113: 413~
416.
6 Yang Z, Pet it t e J N. Poult ry S cien ce Associat ion, 1994, 73( 7) ,
674~ 965.
7 Ishiw ata J, T okieda Y, lsw ata C, et al . H um Cell, 1997, 10 ( 4 ) :
237~ 246.
8 Led ernannB, Burki K. Exp cel l Res, 1991, 197( 2) : 254~ 258.
9 杜忠伟,丛笑倩,等.细胞生物学杂志, 1998, 20( 3) : 102~ 107.
10 童英,邹冀中,尚克刚,等. 北京大学学报 (自然科学版) , 2000,
36( 4) : 472~ 476.
11 T homson J A, Kaalishm an J, Golos T G, et al. p roc NatlAcad
Sci USA, 1995, 92( 17) : 7844~ 7848.
12 Saito D. Dev Bio, 1992, 20( 3) : 134~ 140.
13 Makino H , Hasu da H , Ito Y . J Biosci Bioeng, 2004, 98 ( 5 ) :
374~ 379.
14 董晓,冯书堂,郑行,等.畜牧兽医学报, 2002, 33( 5) : 433~ 438.
15 张肇英, 王达珍, 李煜, 等. 内蒙古大学学报 ( 自然科学版 ) ,
1990, 21( 3) : 438~ 445.
16 Stoklos inski A, Kru se H, Richter Landsberg C, et al. Exp Cell
Res, 1992, 200: 89~ 96.
17 沈干,汪铮,丛笑倩,等.国外医学生物医学工程分册, 2001, 24
( 3) , 97~ 133.
18 Wells DN, et al. Th eriogenology, 1991, 35(1) : 293.
19 Eistet ter H R, Dev Gow th and dif ferent , 1988, 31: 275~ 282.
20 谌兵来,胡随瑜, 谢小毛胡随瑜, 谢小毛,等. 湖南大学学报 ,
2003, 30( 5) : 1~ 6.
21 孟国良,汤富酬 ,滕路,等. 遗传, 2001, 23( 3) : 292~ 294 .
22 张良,唐仕波,郭芬芬, 等. 中山大学学报, 2003, 42 ( 5 ) : 87~
89.
国外动态
韩发现荞麦种子蛋白酶抑制剂具有抗人 T-急性
成淋巴细胞白血病细胞系的抑制活性
Applied Bio chemist ry and Biotechnolo gy 2004年 117卷 2期 65~ 74页报道: 已知马铃薯抑制剂 I 族成
员荞麦蛋白酶抑制剂 BWT-1可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,而与豌豆球蛋白族同源的
新的蛋白酶抑制剂荞麦蛋白酶抑制剂 BW I-2a,则只能抑制胰蛋白酶。
最近, 韩国 Cheju H al la学院 Cheju传统食品研究所的科学家 Sung-Soo Park等观察了 BWI-1和 BWI-
2a的抗人肿瘤 T-急性成淋巴细胞白血病( T-ALL)细胞, 诸如 JURKA T 和 CCRF-CEM 和人正常血淋巴细
胞的抑制活性。
结果发现, 根据可溶性 3-( 4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基溴化四唑(四唑/甲月替测定法)判断, 上述
两种抑制剂均可强烈抑制 T-A LL 细胞的生长。而且, JURKAT 细胞对荞麦抑制剂的易感性还略高于
CCRF-CEM 细胞。还发现, 利用 1, 2-环已二酮修改抑制剂中的精氨酸( Arg )残基,可使其丧失胰蛋白酸抑
制活性,从而显著消除了其对人 T-ALL 细胞系生长的阻遏活性。这提示,胰蛋白酶抑制活性是参与人 T-
ALL 细胞系生长的阻遏的。此外, Park等进一步发现, 上述两种抑制剂可通过 DNA 片段化, 而在上述细胞
系中引发细胞程序性死亡(细胞凋亡)。 汪开治
412006年第 1期 梁琳等: 胚胎干细胞建系方法