全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-08-13
基金项目：重庆市自然基金（CSTC，2007BB5080），军队医药卫生科研基金课题（06G073）
作者简介：鲁卫平（1971-），男，博士在读，研究方向：病原微生物快速检测；E-mail：rannylu@126.com
通讯作者：涂植光，教授，博导
目前，侵袭性真菌感染已经成为免疫受损宿主
致病率和死亡率增高的主要原因 [1，2]。 因此，建立一
种快速、敏感、准确的真菌感染检测与鉴定方法显
得十分重要。近年来分子生物学技术在真菌学研究
中得到了广泛而深入地应用，特别是基因芯片技术
的应用，大大提高了检测通量和检测速度。 传统的
基因芯片信号报告系统通常采用荧光素，但是荧光
染料和检测设备非常昂贵，荧光信号易淬灭，而且
操作要求非常严格以防止干扰信号产生。作为荧光
素的替代品，纳米微粒标记具有低价 、稳定和独特
的理化性质等优点，在生物传感上具有很好的应用
前景 [3]。
本试验采用结合于链霉亲和素分子上的直径
为 1.4 nm 的纳米金为报告分子， 构建纳米金新型
基因芯片检测系统，并结合核糖体基因分型技术构
建通用 PCR 法的样品制备技术，快速、准确地检测
纳米金基因芯片结合通用 PCR同时检测多个病原性真菌
鲁卫平 1，2 涂植光 1
（1重庆医科大学检验医学系，重庆 400016；2第三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042）
摘 要： 基于致病性真菌 rDNA基因分型技术，构建采用通用引物的一次 PCR 法，并结合纳米金新型基因芯片检
测系统实现一次对多个临床常见致病性酵母菌的检测分析。用生物素标记的通用引物扩增各真菌 DNA片段并与基因芯
片杂交，然后将链酶亲和素标记的纳米金结合到杂交体上，杂交信号通过银染反应被放大形成裸眼可见的显色信息。结
果表明，通用引物可扩增临床常见的真菌 DNA，选用的各探针特异性强、可靠性好，芯片的最低检测值达 50 fmol/ L。临床
样品检测结果与常规鉴定方法结果一致。该技术检测时间短、操作简单、不需要特殊设备，能部分满足临床检测的通量要
求，具有很好的临床应用前景。
关键词： 纳米金 基因芯片 聚合酶链反应 真菌
Detection Pathogenic Fungi by Nanogold-baesd DNA Microarray
Combining with Universal PCR
Lu Weiping1，2 Tu Zhiguang1
（1Faculty of Laboratory Medicine，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016；2Molecular Biology Center
of Daping Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400042）
Abstract： A sort of preparation technique that involved in one-time PCR with universal primers and combined
with the new detection system of nanogold-baesd gene chip was developed to detect and identify pathogenic yeast. The
pathogenic yeast DNA gene fragments were amplified by PCR with universal primers labeled with biotin，and the
amplifiers were hybridized with probes on DNA microarray. Then the streptavidin-gold was integrated into the hybrid
complex. Hybridization signal was amplified by the interaction between nanogold and silver stain reagent to form spot
which could be detected with naked eyes. The detection results of clinical sample were consistent with that of obtained
by traditional microbiological culture and biochemical techniques. It proved that this method is a simple，fast，sensitive
technology and no special equipment should be needed. It can meet the flux demand of clinical detection and has good
prospect of clinical application.
Key words： Nano-gold DNA microarray Polymerase chain reaction Medical fungi
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
和鉴定临床常见致病性酵母菌。
1 材料与方法
1.1 真菌标准菌株
白色念珠菌 ATCC90028， 季也蒙念珠菌 ATCC
6260，葡萄牙念珠菌 ATCC 34449，由第三军医大学
大坪医院检验科细菌室提供；热带念珠菌（C2a），光
滑念珠菌（Y10），近平滑念珠菌 （C4a），克柔念珠菌
（C6a），乳酒念珠菌（C3d），新型隐球菌（D2b），购自
于中国医学微生物保藏管理中心（CMCC）。
临床分离菌株：30 株临床分离酵母菌菌株，包
括 10 株白色念珠菌 ，6 株热带念珠菌 ，5 株光滑念
珠菌 ，3 株近平滑念珠菌 ，3 株新型隐球菌 ，1 株克
柔念珠菌，1 株季也蒙念珠菌，1 株葡萄牙念珠菌。4
株曲霉菌，1 株毛霉菌；40 株临床分离细菌菌株，包
括大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、肺炎
克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、伤寒沙门氏菌、流感嗜
血杆菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄
球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎双球菌 、肠球
菌等。均由第三军医大学大坪医院检验科细菌室提
供。
1.2 主要试剂和仪器
纳米金标记及银染试剂（美国 Nanoprobes Inc.）；
杂交液 （0.45M NaCl，20 mM Tris-HCl pH8.0，0.1%
SDS） [4]；醛基化玻璃芯片片基、围栏（北京博奥生物
有限公司）；点样液、杂交盒（美国 Telechem Interna-
tional Inc.）；基因芯片点样仪（美国 Schleicher ＆ Sc-
huell Inc.）； 引物及探针 （大连宝生物生物有限公
司）。
1.3 通用引物的设计
利用 CloneManager 8.0 软件 ， 对待检真菌的
rRNA 基因的 5.8~28 s DNA 序列进行比对 ； 利用
Primer Premier5.0 软件在 5.8S rDNA 和 28S rDNA
的高保守序列区域设计通用扩增引物，可扩增真菌
5.8S rDNA 部分序列 、ITS2 全序列 、28S rDNA 的部
分序列。
1.4 特异性探针的设计及筛选
利用 AlleleID 6.0 软件针对靶细菌位于 5.8S 和
28S rDNA 之间的内转录间隔区 ITS2 序列设计种特
异性探针。用 CloneManager 8.0 进行探针间、探针与
扩增片段间的互补性分析。 备选探针提交 GenBank
进行特异性分析，并用膜杂交筛选出特异性探针。
1.5 基因芯片的制备
用去离子水将探针溶解，稀释至所需浓度。 取
4.0 μl 探针溶液入微孔板中，每孔中加入 4.0 μl 点
样液，充分混匀。取醛基修饰玻片，用点样仪取探针
溶液点于玻片相应位置（图 1）。
点好样的玻片移入湿盒中，室温孵育 1～2 h。然
后置于 20~30℃，湿度<40%的环境中孵育过夜。 取
出孵育后的玻片， 重新放置于湿盒中， 于 65～75℃
水浴箱中再水合 1 h。 用 0.2%SDS 液室温清洗 2
次， 每次 2 min， 再用去离子水清洗 2 次， 每次 2
min。 清洗好的芯片放入硼酸盐溶液中（1.0 g NaBH4
→288 ml PBS+96 ml 无水乙醇）室温孵育 5 min。 取
出芯片，用 0.2%SDS 液室温清洗 3 次，每次 2 min，
再用去离子水清洗 2 次，每次 2 min，空气中干燥。
1.6 芯片检测方法
1.6.1 靶核酸扩增 反应体系总体积为 25 μl，包
括 10×PCR Buffer 2.5 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，25 nM
MgCl2 2 μl，25 μM 引物各 0.2 μl，1.5 U Taq DNA 聚
合酶、DNA 模板 2 μl， 加水至 25 μl。 PCR 反应条
件：变性，94℃ 30 s；退火，55℃ 30 s；延伸，72℃ 1 min，
共 35 个循环，最后 72℃延伸 10 min。
1.6.2 芯片杂交 将 10 μl 扩增产物和 1 μl 阳性
对照混匀，95 变性 10 min， 立即冰浴 5 min。 加入
40 μl 杂交液，混匀后立即滴加于芯片探针区，盖上
盖玻片，置杂交盒中，55℃杂交 2 h。 之后用 1×SSC+
0.1% SDS 的漂洗液 ， 室温漂洗 5 min， 再用 0.1×
SSC+0.1% SDS 的漂洗液 ，室温漂洗 2 min，然后用
0.1×SSC 稍稍漂洗。
1.6.3 纳米金标记 将纳米金试剂用稀释液（PBS+
1%BSA）按 1∶100 稀释后，滴加于芯片探针区，盖上
1.真菌通用探针 ；2.白色念珠菌 ；3.热带念珠菌 ；4.光滑念
珠菌 ；5.近平滑念珠菌 ；6.克柔念珠菌 ；7.葡萄牙念珠菌 ；
8.季也蒙念珠菌 ；9.乳酒念珠菌 ；10.新型隐球菌 ；11.阴性
对照；12.阳性对照
图 1 基因芯片点样模式
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2009年第 3期



 

 5 - biotin-CAACGGATCTCTTGGTTC-3
5 -ATGCTTAAGTTCAGCGGG-3

  5 -TTGAAGATATACGTGGTGGACGTTACCGC-3
  5 -TGGTGGCCACTAGCAAAATAAGCGTTTT-3
  5 -CCTCCCTAGATCAACACCGAGTTGGTAAA-3
  5 -TCCATTAGTTTATACTCCGCCTTTCTTTCAAGC-3
  5 -AAAGTCTAGTTCGCTCGGCCAGCTT-3
  5 -TAAACGTGTTTGACAGCGCGGTTGATAT-3
  5 -CCAACAATACCAGAAATATCCCGCCACAC-3
  5 -AGAGTTTTGGTTAAAGCCGTATGCCTCAAG-3
!"# 5 -GAGATGGTTGTTATCAGCAAGCCGAAGAC-3
$%&’ 5 -GAAGAGTGCGGAAGATGGTCCAGTGTA-3
盖玻片，置湿盒中，室温反应 30 min。用 PBS 缓冲液
清洗 2 次，每次 2 min，双蒸水清洗后干燥。
1.6.4 银染显色 取出芯片，滴加 50 μl 银染试剂
于芯片上杂交反应区，室温反应 15～20 min 后用去
离子水冲洗玻片，空气晾干芯片后，直接裸眼判定
检测结果。
2 结果
2.1 试验中使用的引物和探针
采用自行设计的特异性真菌通用引物建立通
用的 PCR 扩增方法， 对 9 种标准菌株均扩增出一
条 DNA 带， 扩增片段大小在 259～436 bp 之间，用
该引物对临床常见的 14 种细菌以及人 DNA 扩增
结果均为阴性。 该 PCR 扩增方法的灵敏度可达 10
pg/ml 热带念珠菌 DNA（图 2）。
试验中所用探针分为 3 类，（1）位于 5.8S rRNA
基因的真菌通用探针，能够与所有的真菌杂交；（2）
各病原性真菌特异性检测探针，只与相对应的靶序
列杂交；（3）阳性对照探针，选用一段与微生物和人
类无同源性的植物基因（苦瓜 Chi5 基因）作为阳性
对照。为减少空间位阻，使杂交更易进行，探针合成
时 5 端连上长度为 15 的 poly（dT）作为间隔臂 [5]。
引物和探针序列见表 1。
2.2 基因芯片敏感性试验结果
使用氨基修饰热带念珠菌探针制作芯片，用博
奥公司的芯片围栏进行分隔。 分别与终浓度为 10、
5、1、500、100、50、10 及 5 fmol/L 的靶核酸进行杂
交，银染显色。随着靶序列浓度逐渐降低到 50 fmol/
L，杂交点显色越来越弱，浓度低于 50 fmol/L 后，无
可见显色结果（图 3）。
2.3 基因芯片特异性试验结果：
用 9 种酵母菌标准菌株扩增产物分别与芯片
杂交， 只有与靶序列对应的探针点有显色结果，其
他探针点均无显色，背景清晰，结果可靠（图 4）。
2.4 临床分离菌株检测
该方法对 30 例临床分离酵母菌菌株鉴定结果
与常规鉴定结果一致 ，14 种临床常见细菌检测结
果均为阴性。
3 讨论
通过核酸序列的分析即基因型的鉴定进行分
类被认为是当前进行种系发生关系及种间、种内分
1~10.1 μg/ml，100 ng/ml，10 ng/ml，1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，
1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml；11.DNA marker DL2000
图 2 PCR 扩增的灵敏度
表 1 PCR 通用引物和寡核苷酸探针
1.10 pmol/L；2.5 pmol/L；3.1 pmol/L；4.500 fmol/L；5.100
fmol/L；6.50 fmol/L；7.10 fmol/L；8.5 fmol/L
图 3 灵敏度检测结果
1.白色念珠菌；2.热带念珠菌；3.光滑念珠菌；4.近平滑念珠
菌 ；5.克柔念珠菌 ；6.葡萄牙念珠菌 ；7.季也蒙念珠菌 ；8.乳
酒念珠菌；9.新型隐球菌
图 4 临床常见酵母菌的典型杂交图谱
鲁卫平等：纳米金基因芯片结合通用 PCR同时检测多个病原性真菌 121
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
类、分型最可靠的方法之一。 rRNA 基因序列由于其
在进化过程中保守性强而且其序列中又不乏有可
变区和高变区，一直是生物学家研究的热点。 真菌
的 rRNA 基因是一种串联重复基因，即 18S rRNA-I
TS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA 转录单位，分隔 18S，
5.8S，28S rRNA 基因亚单位的序列称为内转录间隔
区（internal transcribed space，ITS），为非编码区。 由
于 ITS 区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力
较小 ，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表
现出了极为广泛的序列多态性。 同时 ITS 序列长度
适中，序列中有足够的信息，可广泛用于属内种间
或种内群体的系统学研究 [6]。
目前，在真菌核酸分子水平上应用较多的技术
是基于 PCR 的 RFLP 以及测序等技术 [7]。 但这些技
术对与临床检验来说， 不同程度存在程序复杂、技
术和设备要求高等问题。 基因芯片技术具有高速
度、高通量、高效率、并行地监测与之杂交的生物样
品的特点， 将其与真菌核糖体分型技术相结合，非
常适合用于病原性真菌的检测和鉴定 [8]。 本研究采
用直径为 1.4 nm 的纳米金标记的亲和素， 通过与
生物素的结合使杂交体标记上纳米金微粒。标记的
纳米金粒子可与纳米银粒子结合成复合物，形成比
原来体积大 106 倍的黑色颗粒，将检测信号进一步
放大，并且可以用肉眼观察或普通光学仪器记录 [9，10]。
本研究将真菌核糖体分型技术结合纳米金基
因芯片技术相结合，用于临床常见病原性真菌的检
测和鉴定。 以 5.8S rRNA 基因和 28S rRNA 基因的
保守序列设计真菌通用引物 ， 可扩增真菌 5.8S
rDNA 部分序列 、ITS2 全序列 、28S rDNA 的部分序
列。 结果表明，试验中设计的引物以及建立的真菌
rRNA 基因通用扩增方法， 具有较好的真菌通用性
和特异性 ，对 9 种酵母菌以及曲霉菌、毛霉菌进行
扩增 ，一步扩增出各种真菌的相应基因片断，而临
床常见致病性细菌的扩增结果均为阴性。芯片试验
结果显示， 所选用的探针均能检测出相应的靶序
列，只有与靶序列对应的探针点有阳性结果 ，其他
探针点均为阴性。芯片敏感性试验表明检测灵敏度
可达到 50 fmol/L，明显高于荧光素标记技术。 对 30
例临床分离酵母菌菌株鉴定结果与临床常规鉴定
结果一致，40 株临床常见细菌检测结果均为阴性。
因此，该方法灵敏度高，特异性强，操作简单，操作
程序大大简单于 PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-AFLP
以及测序技术，与传统的基因芯片技术相比，除敏
感性高外，其技术和设备要求、检测成本大大降低。
与纳米金与巯基结合进行标记的方法相比，标记程
序简化、效率提高，因此在检测灵敏度和稳定性上
都有提高。
该方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单，且
不需要特殊仪器设备，适合临床试验室开展。 通过
继续添加特异性探针，可对更多的病原性真菌进行
分型诊断。
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