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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 4期
siRNA介导的MKK4表达抑制研究
黄志清
陈小玲
陈代文
(四川农业大学动物营养研究所,雅安 625014 )


摘
要:
采用脂质体转染方法,将 3对 ( siRNA ID# 64447、siRNA ID# 64539和 siRNA ID# 186583)人工合成的 MKK4基因
特异的小分子干扰 RNA ( siRNA )分别导入小鼠成肌细胞 C2C12中。实时荧光定量 PCR结果表明, 转染了 siRNA ID# 64447的
细胞, 其 MKK4 mRNA的表达水平下调得最多,约为 85%。试验获得了能够高效下调 MKK4 基因表达的 siRNA。
关键词:
MKK4基因
siRNA
C2C12
实际荧光定量 PCR
Study on the siRNA
mediated Silencing ofMKK4 Expression
Huang Zhiqing
Chen X iaoling
Chen Daiw en
( Institute of A nimalN utr ition, Sichuan Agricultural University, Ya an 625014)


Abstrac:t
Mousem yoblast C2C12 ce lls were transfected w ith the synthesized MKK4
specific sm a ll interfer ing RNA ( siRNA ) du

p lexes, siRNA ID# 64447, siRNA ID# 64539, and siRNA ID# 186583, respectiv ely, using L ipo fectam ine 2000
Rea l
tim e quantita

tive PCR resu lts showed that themRNA expression ofMKK4 in C2C12 ce lls transfected w ith siRNA ID# 64447 w as dec reased approx i

m ate ly 85% , compared w ith ce lls transfected w ith the negative contro l siRNA
The siRNA wh ich can e ffectively down
regulateMKK4
gene expression w as obta ined in th is study

Key words:
MKK4 gene
siRNA
C2C12
Rea l
tim e quantitative PCR
收稿日期: 2008
12
22
基金项目:国家重点基础研究发展计划
973
项目 ( 2004CB117506)
作者简介:黄志清 ( 1976
) ,男,讲师,博士, E
m a i:l zqhuang@ f jnu
edu
cn
通讯作者:陈代文 ( 1962
) ,男,教授,博士,博士生导师, E
m ai:l chendw z@ s icau
edu
cn


肌生成抑制素 ( myostatin),又称生长分化因子
8
(GDF
8),作为转化生长因子
( TGF

)超家族的一
员,它是骨骼肌生长发育的负调控因子 [ 1]。最近, my

ostatin被证实能够激活 c
Jun氨基末端激酶 ( c
JunN

term inal k inase, JNK )
[ 2]。MKK4和 MKK7是激活
JNK目前已知的两种直接上游激酶 [ 3]。研究发现,
TGF

激活 JNK时仅由 MKK4所介导 [ 4~ 6] , 那么和
TGF

信号转导非常类似的 myostatin激活 JNK时是
否也需要 MKK4介导。
RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)是指一些小
的双链 RNA( doub le stranded RNA, dsRNA)通过特异
性降解与其同源的 mRNA而高效地阻断体内特定基
因表达的现象。研究发现, 21 bp长并且 3
端有两个
碱基突出的小干扰 RNA ( small interfering RNA, siR

NA)可以有效且特异性地引起哺乳动物的基因沉
默 [ 7]。本研究考察 3对 MKK4 siRNA对细胞内MKK4
基因表达的影响,获得能够高效下调 MKK4基因表达
的 siRNA,为进一步研究 MKK4在 myostatin激活 JNK
中的作用奠定基础。
1
材料与方法
1
1
材料
1
1
1
酶及主要试剂
Taq DNA聚合酶、dNTPs为
Applied B iosystems公司产品, M
MLV反转录酶购自
Promega公司, TR Izo l、L ipofectam ine 2000购自 In

v itrogen公司, iQTM SYBR Green Superm ix购自 B io

Rad公司, DMEM和胎牛血清 ( FBS)购自 American
Type Cu lture Co llect ion( ATCC )公司。
1
1
2
细胞系
小鼠成肌细胞系 C2C12购自 ATCC
公司。
1
1
3
siRNA
MKK4 siRNA ( siRNA ID# 64447, siRNA
ID# 64539、siRNA ID# 186583)和 Negative Control siR

NA购自 Ambion公司。 siRNA ID# 64447的正义链和
2009年第 4期 黄志清等: s iRNA介导的 MKK4表达抑制研究
反义链序列分别为 5

GGACUUGAAAGACCUUGGAtt
3

和 5

UCCAAGGUCUUUCAAGUCCtc
3
, s iRNA ID# 64539
的正义链和反义链序列分别为 5

GGUCAACAUUAAAA

UACUGtt
3
和 5

CAGUAUUUUAAUGUUGA CCtc
3
, s iR

NA ID#186583的正义链和反义链序列分别为 5

GGGCA

AGGAAUUUAUUACA tt和 UGUAAUAAAUUCCUUGCCC
tt
3
。
1
1
4
引物
引物由 Invitrogen公司合成,序列见
表 1。
表 1
扩增 MKK4和 GAPDH cDNA基因片段的引物序列
基因 引物 序列 G enB ank登录号 产物大小 ( bp)
MKK4 正向 5

TGTCAACTTGT
GCCTTACGAAG
3
NM _009157 193
反向 5

GAGTCTGATGT
AGCAGCGGTATC
3

GAPDH正向 5

AGGGCATCTT
GGGCTACAC
3
NM _008084 211
反向 5

TGGTCCAGGGT
TTCTTACTCC
3

1
2
方法
1
2
1
细胞培养与转染
分别将 250 pmo l siRNA
和 6
l脂质体 L ipofectam ine 2000加入 250
l Opti

MEM I reduced serum m edium ( GIBCO )中, 放置 5
m in后将两者轻缓混匀, 室温放置 15 m in后移入细
胞培养用 6孔板 ( Corning )中, 再每孔接入 2 m l用
DMEM /10% FBS调整为 1
105 /m l的 C2C12细胞
悬液, 混匀后于 37
、5% CO 2细胞培养箱中孵育。
8 h后, 换新鲜的 DMEM /10% FBS, 继续培养至 48 h
后收集细胞,进行检测分析。
1
2
2
细胞总 RNA的提取
用 TR Izol试剂提取细
胞总 RNA, 用 DN ase I(N ew Eng land B ioLabs)去除可
能的基因组 DNA污染, 具体操作按产品说明书进
行。采用无水乙醇沉淀法回收 DNase I处理后的总
RNA,然后用 N anoDrop ND
1000( NanoDrop Techno l

og ies)仪器测定 RNA样品的纯度和浓度。
1
2
3
反转录
取 2
g DNase I处理后的总 RNA
和 1
l O ligo( dT) 15引物 ( 0
5
g /
l) ( P romega) ,
用 DEPC处理过的水补充至 17
,l然后于 70
加热
变性 10m in。快速置于冰中,再加入 1
25
l dNTPs
( 10mmo l / l)、0
75
l RNA酶抑制剂 ( RNaseOUTTM
recombinant ribonuclease inh ib itor, 40 U /
l) ( Invitro

gen)、5
l5
M
MLV反应缓冲液以及 1
lM
MLV
反转录酶 ( 200 U /
l), 然后于 42
反应 1 h。
1
2
4
普通 PCR
取 1
l上述反转录产物 ( cDNA )
为模板,在 25
l体系中进行 PCR反应。所用引物
见表 1。PCR扩增条件均为 95
预变性 3 m in, 然
后进行 95
10 s, 60
20 s, 72
30 s, 共 40个循
环, 最后再 72
延伸 7 m in。 PCR产物经纯化后送
往美国马里兰大学生物系统研究中心 DNA测序部
进行序列测定。
1
2
5
实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR使
用 iQ5 Real
T ime PCR Detection System ( B io
Rad)进
行扩增和数据分析。反应总体系为 25
,l其中:反转
录产物 ( cDNA) 1
,l上、下游引物 (见表 1)各 1
l(工
作浓度为 200 nmo l/ l), DEPC处理过的水 9
5
,l 2

iQ
TM
SYBR G reen Superm ix 12
5
l。反应条件为:
95
3 m in
95
10 s, 60
20 s, 72
30m in,共 40
个循环
95
1m in
60
1m in
最后自 60
开始,
每 10 s升高 0
5
直至到 95
结束。基因表达的相
对变化采用 2


Ct公式计算。
2
结果
2
1
细胞总 RNA的提取
从细胞中提取的总 RNA,其 A260 /A280值处于 1
95
~ 2
0之间,表明所提取的总 RNA样品纯度较高,可用
于下一步操作。
2
2
MKK4及 GAPDH cDNA基因片段的 PCR扩增
根据鼠 MKK4和 GAPDH cDNA基因序列推算,
设计的引物所扩增的片段大小应分别为 193 bp和
211 bp。RT
PCR产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测,分
别在 100~ 200 bp(图 1)和 200~ 300 bp的位置出现
一特异性条带 (图 2),与理论大小相符。进一步的测
序及比对结果表明所扩增的片段与 GenBank中的已
经序列同源性均为 100% (测序及比对数据略 )。
2
3
实时荧光定量 PCR的扩增效率及熔解曲线
将反转录产物进行梯度稀释,分别取 1
l为模
板进行实时荧光定量 PCR。结果显示,在普通 PCR
确定的扩增条件下, MKK4和 GAPDH的扩增效率分
别为 96
8% (图 3
A )和 87
3% (图 4
A )。PCR反
应结束后, 将 PCR反应液的温度逐渐升高, 实时监
测 SYBRG reen荧光信号强度变化进行熔解曲线分
87
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
M
DNA分子量标准; 1
MKK4 cDNA基因片段的
PCR扩增产物; 2.阴性对照
图 1
PCR扩增MKK4 cDNA基因片段的琼脂糖凝胶电泳
M
DNA分子量标准; 1
GAPDH cDNA基因片段的
PCR扩增产物; 2.阴性对照
图 2
PCR扩增 GAPDH cDNA基因片段的琼脂糖凝胶电泳
图 3
MKK4 cDNA基因片段实时荧光定量
PCR的扩增效率和熔解曲线分析
图 4
GAPDH cDNA基因片段实时荧光定量
PCR的扩增效率和熔解曲线分析
析。结果显示: 熔解曲线为单一峰型的曲线 (图 3

B,图 4
B)。实时荧光定量 PCR产物经 2%琼脂糖
凝胶电泳检测,分别在预期大小的位置出现一特异
性条带,无引物二聚体产生 (图 5)。以上结果表明
所确定的扩增条件和所设计的引物适合利用实时荧
光定量 PCR做下一步的检测。
88
2009年第 4期 黄志清等: s iRNA介导的 MKK4表达抑制研究
M
DNA分子量标准; 1
GAPDH cDNA基因片段的实时荧光
定量 PCR扩增产物; 2
MKK4 cDNA基因
片段的实时荧光定量 PCR扩增产物
图 5
实时荧光定量 PCR扩增 GAPDH及MKK4 cDNA
基因片段的琼脂糖凝胶电泳
2
4
MKK4 siRNA对细胞内MKK4基因表达的影响
转染 MKK4基因特异 siRNA的 C2C12细胞在
DMEM /10% FBS培养液中培养 48 h后,收集细胞提
总 RNA。实时荧光定量 PCR结果表明:和对照组相
比, s iRNA ID# 64447、siRNA ID# 64539和 siRNA ID#
186583分别下调了细胞内 MKK4 基因的 mRNA表
达水平 85
19%、79
18%和 69
59% (图 6)。
3
讨论
RNA干扰是近几年发展起来的新技术, 是指一
些小的 dsRNA通过特异性降解与其同源的 mRNA
而高效地阻断体内特定基因表达的现象。对线虫等
低等生物,较长 (约 500 bp)的 dsRNA能够得到特异
性干扰作用。但用较长的 dsRNA作为哺乳动物基
因沉默的工具时, 发现其不仅能够激活 RN aseL导
致非特异性 RNA降解, 还能够激活蛋白激酶 PKR,
PKR则使蛋白质合成起始因子 eIF2a磷酸化,导致
所有蛋白质翻译起始的抑制和细胞凋亡 [ 8]。后来
人们发现小于 30 bp的 dsRNA就可以有效引起哺乳
动物的基因沉默 [ 7] ,并且不会产生非特异性抑制现
象,进一步研究发现抑制作用最强的是长度为 21 bp
并且 3
端有两个碱基突出的 siRNA。从此, RNA干
扰在哺乳动物中得到了广泛的应用 [ 9 ~ 12]。
RNA i的成功实现, 2个因素最为关键, 其一要
有一个能够有效下调目的基因表达的 siRNA分子,
图 6
MKK4 siRNA对细胞内MKK4基因表达的影响
其二要有一个很好的将 siRNA分子导入细胞内的
方法和条件。在体外 ( in vitro)可以用不同的方法将
siRNA导入细胞,通常化学合成的 siRNA可用电穿
孔 ( e lectroporation)、显微注射和转染的方法引入细
胞。采用脂质体 ( lipofectam ine )转染法将 siRNA导
入 C2C12细胞内,其最佳转染条件是利用阳性对照
GAPDH siRNA确定的 (结果未显示 )。
确定最佳转染条件之后, RNA i实验的成功还
需要能够有效下调目的基因表达的 siRNA分子。
RNA i技术要求 siRNA反义链与靶基因序列之间
严格的碱基配对, 单个碱基错配就会大大降低基
因沉默效应, 而且 siRNA还可以造成与其同源的
其他基因沉默, 所以 siRNA靶位点的选择至关重
要。本研究中所使用的 siRNA是由专门从事 RNA
相关产品研发的 Amb ion公司专业人员预先设计
并合成的,这为 RNA i的成功实现提供了 siRNA方
面的质量保证。然而, 针对某一特定基因, 并不是
任意选择一段序列都可以达到理想的抑制效果,
针对不同靶位点设计合成的 siRNA其抑制效果差
别很大, 这也就是所谓的 RNA i位置效应特点。试
验发现针对不同靶位点设计的 siRNA分子, 其基
因沉默效果的确存在差异。在 3对 MKK4基因特
异的 siRNA ( siRNA ID# 64447、ID# 64539和 ID#
186583)中, 发现 Amb ion siRNA ID# 64447下调细
胞内 MKK4 基因的 mRNA 表达水平最多 (约
85% )。因此, 可将 siRNA ID# 64447选出做进一
步的 RNA i实验。
总之,获得了能够高效下调 MKK4基因表达的
89
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
siRNA,为采用 RNA干扰技术确定 MKK4在 myosta

t in激活 JNK中的作用打下了良好的基础。
致谢:本研究在美国马里兰大学完成,感谢马里兰大学孟江洪
教授在实验中给予的帮助。
参 考 文 献
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(上接第 85页 )
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