全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
植物M icroRNA的特点与研究方法
周立敬 高飞 马亭亭 刘冉 马玲 姚尧 周宜君
(中央民族大学生命与环境科学学院,北京 100081 )
摘 要: M ic roRNA s( m iRNA s)是一类在植物、动物、单细胞藻类和病毒等中存在的具有调控基因表达作用的内源非编
码小 RNA( sma llRNAs)。在植物中, m iRNA s主要依靠与靶基因之间完全或近乎完全的互补配对切割靶基因或翻译抑制实现
其调控功能。主要综述植物 m iRNA的特点, 并介绍 m iRNA的获得方式、靶基因预测及验证方法。
关键词: 植物 小 RNA M icroRNA 特点 研究方法
Characteristics and ResearchM ethods ofM icroRNA in P lant
Zhou L ijing Gao F ei M aT ingt ing L iu Ran Ma L ing YaoYao Zhou Y ijun
(College of L ife and Environmental Science, M inzu University of China, Beijing 100081)
Abstrac:t M icroRNAs( m iRNAs), wh ich we re found in plant, an im a,l un ice llu lar algae and v irus, are a c lass o f endogenous non
cod ing sm a ll RNA ( sRNAs) and play regu la tory roles in gene expression. The ir regu latory func tions w ere ach ieved by ta rgeting mRNA
cleavage in comp lete o r nearly com plete comp lementary way and translation repression in plant. The character istics of p lant m iRNA, as
w e ll as the access to obta in m iRNA, m ethods to predict and to verify the targe t gene of m iRNA were rev iewed in th is pape r.
Key words: P lant Sm a ll RNA M icroRNA Character istics Research ing me thods
收稿日期: 20101214
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 31070361) ,中央民族大学自主科研项目 ( 0910KYZY43 ),中央民族大学 985工程项目 (MUC985) ,中央民
族大学 211工程 三期 创新人才培养 项目 ( 0212110309090209 )
作者简介:周立敬,女,硕士研究生,研究方向:植物分子生物学; Em ai:l lijing_dongtu@ 163. com
通讯作者:周宜君,女,教授,研究方向:植物分子生物学; Em ai:l queen zhou@ 263. net
M icroRNA (m iRNA )是真核生物及病毒中存在
的由 19- 25 nt组成的一类内源性非编码的单链小
RNA, 主要是在转录后水平发挥调控基因表达的功
能 [ 1]。自 1993年 Lee等 [ 2] 在研究秀丽隐杆线虫
(Caenorhabditi elegan )胚胎发育过程中发现了第一
个基因 m iRNA基因 lin4以来, 已经通过克隆
和生物信息学等方法在拟南芥 [ 3]、水稻 [ 4]以及苔
藓 [ 5]等植物中先后发现了大量的 m iRNA。关于
m iRNA以及其他相关小分子 RNA ( sm all interfering
RNA, siRNA )生物学功能的研究逐渐受到重视, 尤
其是 m iRNA所具有的调控功能涉及动植物的生长
发育、细胞分化、细胞增殖与凋亡、激素分泌和肿瘤
形成等各种生物学过程以及对干旱、高盐和营养胁
迫等各种逆境响应的诸多方面 [ 6 - 8 ]。以拟南芥突变
体为材料研究 m iRNA在遗传发生和生物学功能中
的作用获得了大量的信息。如对 m iRNA直接调控
植物发育和响应环境变化的深入研究已经证明, 作
为植物分子生物学中的关键组分, m iRNA的作用非
常广泛 [ 9]。近来,关于决定水稻理想株型 ( shap ing a
better rice p lant)相关基因 OsSPL14的研究结果表
明, 该基因受到 O sm iR156的调控 [ 10]。因此关于
m iRNA的深入研究,将对功能基因组学的研究产生
深刻的影响。
通过克隆技术、高通量测序以及复杂的生物信
息学和遗传筛选等方法,促进了 m iRNA的分离鉴定
技术的进步, 使在 Sanger m iRNA数据库中注册的
m iRNA数量迅速增加。 2002年 2月 m iRNA仅有
218个 ( Version 10) ,经过近 6年的时间, 2007年 12
月 m iRNA达到 5 395个 ( Version 101)。 2009年 9
月发现并鉴定出的 m iRNA 为 10 833个 ( Version
140) , 2010年 9月公布的 m iRNA增加到 15 127个
( V ersion 160, http: / /www. m irbase. org ), 在一年的
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
时间里, 数据量增加了近 5 000个。目前获得的
m iRNA (V ersion 160)分布于植物、动物、单细胞藻
类和病毒等 142个物种中,其中在 42种植物中已经
鉴别出 3 057个 m iRNA,数量超过 100个 m iRNA的
植物物种有 9个, 分别来自水稻 ( Oryza sa tiva, 462
个 )、苜蓿 (M ed icago trunca tula, 375个 )、杨树 (Popu
lus trichocarpa, 234个 )、小立碗藓 ( Phy scom itrella
patens, 229个 )、拟南芥 ( Arabidop sis thaliana, 213
个 )、大豆 ( G lycine max, 203个 )、玉米 ( Z ea mays,
170个 )、葡萄 ( Vitis vinif era, 163个 )和高粱 ( Sor
ghum bicolor, 148个 )。m iRNA数量的增多丰富了
m iRNA数据库, 为深入研究 m iRNA的功能提供了
资源。
1 植物中 m iRNA的存在特点
M icroRNA简称 m iRNA, 是一类不编码蛋白质、
不具有开放阅读框 ( ORF)的单链短序列内源 RNA。
成熟 m iRNA长度大约 21 n,t 5端有一磷酸基团, 3
端为羟基, 且具备独特的序列特征, 即其 5端第一
个碱基对 U具有强烈的倾向性, 而对 G具有排他
性,但第二到第四个碱基缺乏 U,且一般来讲,除第
四个碱基外, 其他位置碱基通常都缺乏 C。成熟
m iRNA所具有的上述特点可以使它与大多数寡核
苷酸和功能 RNA的降解片段区分开来。
11 植物 m iRNA与动物 m iRNA的比较
m iRNA在植物和动物中普遍存在, 尽管在结构
和功能上具有许多相似的特点,但也存在许多差异。
对植物 m iRNA的研究始于 2002年, 与动物 m iRNA
的研究相比其起步较晚。但因植物的不可移动性,
当环境条件变化时, 只能通过调节体内各个基因的
表达以适应多变的环境。由于植物中存在的 m iR
NA与动物 m iRNA相比,不仅种类多样,且参与的调
控机制复杂。植物 m iRNA在发挥调控功能时, 主要
依靠 m iRNA和靶基因之间完全或近乎完全互补配
对切割靶基因 [ 11] , 而动物 m iRNA的调控作用的实
施主要依赖 m iRNA与靶基因的 3UTR区域结合,
抑制靶基因翻译, 实现基因沉默; 植物 m iRNA的形
成主要依靠 RNA聚合酶 、DCL1、HYL1(Hyponas
t icLeaves 1)及其他因子的参与,而动物主要为 RNA
聚合酶 及 Dorsha等参与。与动物 m iRNA相同,
植物中多数 m iRNA具有高度保守性、时序性和组织
特异性 [ 12, 13]。利用植物中 m iRNA 所具有的保守
性, 可以通过查询 m iRBase数据库中的植物 m iRNA
与在其他植物中新获得的 m iRNA进行比对分析, 以
确定存在的保守 m iRNA的种类。研究表明, 拟南芥
的 m iR156、m iR157、m iR158、m iR165和 m iR829在根
组织中高丰度表达,而在根组织中表达丰度很低或
没有表达的 m iR167、m iR169、m iR170、m iR171a、
m iR172、m iR319、m iR396、m iR397和 m iR398在叶组
织中却表达丰富 [ 14]。
12 植物 m iRNA与 siRNA的比较
基于生物合成的方式和功能上的差异,植物中
内源 sm all RNA 划分为两类: m iRNA 和 siRNA。
m iRNA由具有茎环结构的单链 RNA加工而成, siR
NA源自于长的双链前体, s iRNA有 4种: casiRNA
( cisacting siRNA )、tasiRNA ( transact ing siRNA )、
lsiRNA ( longsiRNA )和 natsiRNA ( natura lantisense
transcript siRNA )
[ 15]
; m iRNA的功能主要表现为在
转录后水平通过介导靶基因降解或抑制翻译来调控
基因表达, s iRNA的功能主要是参与真核生物基因
组 DNA的甲基化修饰;通常认为 21 nt为 m iRNA的
主要形式, 24 nt为 siRNA的主要形式 [ 16, 17]。
目前,对植物中分离获得的 small RNA文库的
大小分布特征研究表明, 21 nt和 24 nt的 sm allRNA
所占比例较高,且随着植物的种类不同,各自所占的
比例不同,表现出一定的规律性。例如,属于一年生
被子植物的拟南芥 [ 18, 19]、苜蓿 [ 20]、玉米 [ 21] 和番
茄 [ 22]中 24 nt所占比例高于 21 n,t 葡萄 [ 23 ]、紫
杉 [ 24]、松树 [ 25 ]、红豆杉 [ 26 ]和杨树 [ 26]中 21nt所占比
例高于 24 n,t这些植物都属于多年生植物。一般认
为, 大小为 21 nt的 sma llRNA在多年生的裸子植物
中所占比例较高, 大部分一年生被子植物中大小为
24 nt的 sm all RNA所占比例较高。两类植物的
smallRNA文库中 21 nt和 24 nt的分布差异可能与
smallRNA在两类植物中的合成途径不同相关, 也
可能与 smallRNA的作用方式相关。一方面, 24 nt
主要为 siRNA, siRNA通过异染色质化介导基因沉
默, 其调控作用所占比例随着生长时间 (以年计 )的
增加呈下降趋势, 因而在多年生植物中 24 nt所占比
例低于 21 n;t另一方面, 一年生植物的基因沉默必
须通过 siRNA介导异染色质化实现,且以 siRNA介
16
2011年第 5期 周立敬等:植物M icroRNA的特点与研究方法
导异染色质化活性高于多年生植物 (如葡萄和树
木 ) ,所以一年生植物的 24 nt所占比例高于 21 n,t
与多年生植物的表现相反 [ 23 ]。
2 m iRNA的研究方法
21 m iRNA的筛选
总体上, 从组织中获得 m iRNA的方法有两种,
包括传统的测序方法和高通量测序方法。
211 传统的测序方法 m iRNA的克隆可以通过
构建 m iRNA的 cDNA文库来实现。具体步骤: 总
RNA的提取, sma llRNA的富集,通过聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离约 20- 25 nt序列, 3和 5端加接头,反
转录及 PCR扩增获得 m iRNA的 cDNA文库,对这些
cDNA进行克隆、测序。一般来说,传统的测序方法
操作复杂,测序费用较高。
212 高通量测序方法 随着分子生物学技术的
进步, 454、MPSS和 Solexa等高通量测序技术的应
用,为各物种的 m iRNA鉴定与定量分析提供了良好
的研究平台。高通量测序在检测 m iRNA方面具备
很多优势,以 So lexa测序技术为例,由于 So lexa测序
技术具有灵活性、高灵敏度的特点, 可以检测 17-
35 nt内的任何小分子 RNA, 一次试验可以读取 40
万到 400万条序列,使一些低丰度表达的 m iRNA被
检测出来, 几乎可以涵盖单个细胞所有的 m iRNA,
这种高通量的测序可为新的 m iRNA的发掘提供条
件,同时大大降低了测序成本。此外, So lexa测序能
确定 m iRNA 的大小分布情况, 精确地给出各个
m iRNA的表达量, 使得 m iRNA在不同情况下表达
情况的研究成为可能。因此通过大量的平行测序,
理论上可以发掘、鉴定并定量出任何物种全基因组
水平的 m iRNA图谱, Solexa测序技术平台也提供了
解密 m iRNA图谱的方法。
213 生物信息学分析 无论是传统方法还是高
通量测序,获得的测序数据很多,必须结合生物信息
学进行分析确定该序列是否为 m iRNA。由于 m iR
NA在各个物种中保守性极高, 将测序结果与 m iR
Base库中的植物 m iRNA序列进行比对, 若完全一
致,则可作为本物种保守的 m iRNA;同时, 随着各个
物种基因组序列及 EST序列的获得, 人们利用 m iR
NA的前体 prem iRNA具有茎环结构, 成熟的 m iR
NA及其反义链 m iRNA* 位于 prem iRNA的两条臂
上, 以及二级结构自由能最低等特征为原则,开发了
各种预测新的 m iRNA软件, 如 RNA fo ld、N INAM elt
和 m iRRACE等。
RNA fo ld是一种 m iRNA二级结构的预测软件,
能够计算 DNA /RNA序列的最低自由能, 并给出二
级结构图形化结果, 由此确定此序列是否为形成
m iRNA的候选基因。RNA fo ld在线运行, 若不想在
线, 可以提供一个 Ema i,l程序运行完毕后, 其结果
的链接可发到邮箱中, 十分方便,应用也最为广泛。
Zhao等 [ 27] 利用 RNA fold预测了 14个新的花生
m iRNA。
N INAM e lt也是一种预测 m iRNA二级结构的软
件。为了更好的预测 m iRNA, 其条件设定为 ( 1) m iR
NA: m iRNA* 来自候选基因的茎环结构两臂上, 且完
全处在发夹结构内; ( 2)m iRNA: m iRNA* 的错配 4;
( 3)由不完全对称形成的泡 < 1, 且不配对碱基 < 2。
Trupti Joshi等 [ 28] 利用此方法预测了 87个 G ly cine
max的新的 m iRNA。
m iRRACE技术于 2009年问世, 能够确定生物
信息学预测的 m iRNA精确序列,该方法克服了生物
信息学预测 m iRNA中无法确定 m iRNA两端精确序
列的缺点,具有广泛的通用性。Yu等 [ 29]利用 m iR
RACE从苹果 324 000条 EST中预测了 31个可能的
m iRNA,共属于 16个 m iRNA家族。
22 m iRNA的靶基因预测
由于植物 m iRNA与其靶基因以完全匹配或近
乎完全匹配的方式结合, 利用此特点设计了多种预
测软件, 主要包括 Target F inder( http: / / jcc lab. sci
ence. oregonstate. edu /node), PatScan, m iRU ( http: / /
b io in fo3. nob le. org /m iRU. htm )及其升级版本 psRNA
( http: / /b io info3. nob le. org /psRNATarget)。
psRNA依靠评分来评估靶基因与 m iRNA的匹
配程度。GU为 05分, 缺失一个碱基为 2分, 每
对碱基不符合碱基互补配对为 1分, 若最后总分低
于 30, 则视为 m iRNA的靶基因。利用此软件预测
靶基因,不仅可以根据软件自带数据库分析,还能够
支持 Custom Search Regulators& Targets, 研究者可以
自己上传靶基因数据,为尚未得到基因组的植物进
行 m iRNA靶基因的分析提供了途径, 可以采用 EST
数据或者 GSS数据来代替基因组数据, 因此 psRNA
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
被广泛使用。Zhao等 [ 27 ]利用 psRNA预测了花生 14
个新的 m iRNA靶基因。
PatScan最初设计用于查找基因组特定模式的
序列, Rhoades等 [ 30 ]首先将其运用到 m iRNA靶基因
的预测,同时估算了此种预测的假阳性。在运用时
需要两个文件,一是制定的 patscan文件, 包括 m iR
NA序列和匹配模式; 二是用来预测的基因序列文
件。采用指定的匹配方式寻找特定 m iRNA的靶
基因。
23 m iRNA的试验验证
通过生物信息学预测的新的和保守的 m iRNA
假阳性较高,需要通过试验手段验证 m iRNA是否真
实存在,即 m iRNA本身的验证;对 m iRNA进行功能
研究时,需要采用生物信息学预测其靶基因,对于预
测的靶基因是否真实存在也需要采用试验手段验
证,即 m iRNA靶基因的验证。
231 m iRNA的验证 m iRNA本身的验证方法
有多种, 如 Northern b lo tting、Stemloop qRTPCR、原
位杂交和基因芯片等。
Northern b lo tt ing验证方法可靠性高, 但要用到
放射性同位素,并且对于表达丰度较低的 m iRNA无
法有效检测出来 [ 31 ] ,大大降低了其使用范围。而对
于表达丰度较高的 m iRNA, 此方法真实可靠, 不需
要特殊试验仪器及试验技能,且能反映 m iRNA表达
量及 m iRNA分子大小, 许多 m iRNA的验证 [ 32- 35]都
用到了此方法。W ang等 [ 31]从拟南芥基因组序列中
预测了 83个新的 m iRNA, 其中 25个高丰度表达的
m iRNA采用 N orthern b lo tt ing得到了证实。
S temloop qRTPCR ( quantitative reverse tran
script ionPCR )验证。这种方法虽需要设计特异性
引物及探针,且试验结果受体系、操作及环境影响较
大,但操作简单,检测灵敏度高,现被广泛采用。其
原理如图 1所示。
图 1A为终点法检测 m iRNA。 Stemloop引物
末端的 6个碱基结合到 m iRNA的 3端,起始反转录
反应。使用 m iRNA的特异引物和通用引物对 RT
产物进行扩增获得 m iRNA。图 1B为 SYBR G reen
染料分析。图 1C 是采用 U niversa l Probe Library
(UPL)探针分析 [ 36 ]。3种方法比较, A方法的费用
最低, 但只能做半定量检测, 需要选择合适的循环
数, 确保 PCR反应处在指数扩增期; B方法的费用
处于 A和 C之间, 其灵敏度较高, 可做定量分析。
由于 SYBR G reen染料与碱基互补形成的双链结构
小沟相结合后,便能检测到荧光, 若本身含有二级结
构, 检测结果会比实际亮度更高, 此种干扰无法排
除; C方法由于需要 TaqM an探针,费用较高,但检测
m iRNA的特异性高于 B方法。李贺等 [ 37]采用 Stem
loop RTPCR鉴定了草莓中保守的 m iRNA的存在。
图 1 S temloop法验证 m iRNA [ 36]
m iRNA基因芯片验证。这种技术可以使高通
量分析所获得的所有已知的 m iRNA在不同环境胁
迫下的基因表达差异分析成为可能。L iu等 [ 38]采用
基因芯片分析了拟南芥中已鉴定或克隆的 117个
m iRNA对于高盐、干旱和低温胁迫的响应, 确定了
10个响应高盐、4个响应干旱和 10个响应低温胁迫
的 m iRNA。m iRNA基因芯片方法以大量已知的
m iRNA序列为前提设计探针, 因此采用生物信息学
预测的 m iRNA可以通过基因芯片来验证。
232 m iRNA的靶基因验证 对预测的 m iRNA
靶基因的验证方法主要有 3种: 5RACE法、农杆菌
注射法及体外检测 m iRNA对靶基因的剪切活性。
5RACE法是利用修饰化的 5RACE ( 5RLM
RACE )直接分析 m iRNA的剪切产物 (图 2)。m iR
NA切割靶基因后, 含有 poly A的靶基因 mRNA的
5末端带有磷酸基团,而大多数的 mRNA不含磷酸
基团 [ 31]。连接接头, 经随机引物反转录, 采用巢式
PCR扩增目的基因, 不仅可以证实 m iRNA对靶基因
的切割特性,还能够鉴定 m iRNA的切割位点, 这种
5RACE验证方法是目前最为可靠的方法。许多研
究都用 5RACE方法验证了 m iRNA靶基因 [ 39- 42] ,
研究结果表明,这种剪切作用通常精确发生在 m iR
NA第 10或 11位碱基处 [ 39, 43]。
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2011年第 5期 周立敬等:植物M icroRNA的特点与研究方法
图 2 5RLMRACE流程图 [ 31]
农杆菌注射法是一种瞬时表达, 一般利用 35S
启动子分别构建 m iRNA及其靶基因表达载体, 然后
借助农杆菌注射接种植物叶片,使两种表达载体在
植物活体组织内共表达 ( coexpression )。 L lave
等 [ 39]将构建的含有 m iRNA171及其靶基因 SCL
mRNA载体的农杆菌注射接种烟草叶片,检测到了
m iRNA对靶基因的剪切。
体外检测 m iRNA对靶基因的剪切活性。主要
方法是表达抗性靶基因,即在预测的 m iRNA靶位点
处引入多个碱基突变,使目标 m iRNA不能与靶基因
结合, 同时不改变靶基因编码蛋白序列, 验证目标
m iRNA与靶基因相互作用。已有研究表明, 该方法
是一种有效验证 m iRNA靶基因的方法 [ 44, 45 ]。Mal
lo ry等 [ 46] 利用小麦胚芽裂解物体外检测到 m iR
NA160对靶基因 ARF17的剪切活性。
3 展望
植物 m iRNA是一类重要的具有调控作用的小
分子 RNA。对获得的一些植物 m iRNA的功能研究
表明, 多数植物 m iRNA的靶基因为转录因子 (如
m iR156的靶基因为 SBP家族 ) ,还有一些是编码植
物代谢过程中的重要蛋白质 (如 m iR398负调控编
码 Cu /Zn SOD酶的基因 CSD1)。因此,植物 m iRNA
中的调控作用不仅涉及植物的整个生长发育进程
(如植物组织器官发育 ) , 而且参与植物对多种逆境
胁迫 (如营养胁迫、干旱胁迫、高盐胁迫和低温胁迫
等 )的响应。虽然目前已经鉴定了很多植物 m iR
NA,部分 m iRNA的作用机制已被研究阐释, 但大部
分仍然处于未知状态,尤其是低丰度表达的 m iRNA
的分离与鉴定,需要进一步深入研究。随着 m iRNA
研究方法的不断改进, m iRNA数据库 m iRBase中植
物 m iRNA的增多, m iRNA在植物体中的生物学功
能、作用机制及调控途径将会越来越明晰。
参 考 文 献
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