全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建
刘娇 周帆 陈庆美 单晓亮 唐霓
(重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016)
摘 要: 旨在构建含 HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和 NS5b基因的重组腺病毒载体。运用 PCR 技术扩增目的基因片
段，通过酶切连接方法将上述 7 种基因片段克隆至穿梭质粒 pAdTrack-TO4 中，然后将重组质粒用 PmeⅠ线性化后与骨架质粒
pAdEasy-1 在 BJ5183 细菌中同源重组。用 PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染 HEK293 细胞后产生重组腺病毒颗粒。利
用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP对其感染效率进行监测。结果显示，酶切鉴定和测序结果均证实含 core、E1、E2、F、NS3、
NS5a和 NS5b基因的重组腺病毒构建成功，在感染的 Huh7 细胞中观察到绿色荧光蛋白 GFP。成功制备了高滴度的腺病毒
Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和 Ad-NS5b，为后续研究奠定了基础。
关键词: HCV编码蛋白 穿梭质粒 骨架质粒 同源重组 腺病毒
Construction of Recombinant Adenoviral Vectors Expressing
Important Hepatitis C Virus-encoded Proteins
Liu Jiao Zhou Fan Chen Qingmei Shan Xiaoliang Tang Ni
(Key Laboratory of Molecular Biology of Infectious Diseases Designated by Chinese Ministry of Education，
Institute of Viral Hepatitis of the Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016)
Abstract: The study aimed to construct recombinant adenoviral vectors respectively expressing HCV core，E1，E2，F，NS3，NS5a
and NS5b protein for further biofunctional analysis． The genes of core，E1，E2，F，NS3，NS5a，and NS5b were amplified by PCR，and
then cloned into shuttle plasmid pAdTrack-TO4 by enzyme and ligation． The recombinant plasmids were linearized using PmeⅠ and
then homogeneously recombinized with backbone plasmid pAdEasy-1 in BJ5183 bacteria． Subsequently，the plasmids were linearized
with PacⅠ and transfected into HEK293 cells to be packed into recombined adenoviral particles，and their infectious efficiency was ex-
amined using green fluorescent protein(GFP)expression in the shuttle plasmid． Results showed that through restriction endonuclease di-
gestion analysis and DNA sequencing，the recombined adenoviral vectors Ad-core，Ad-E1，Ad-E2，Ad-F，Ad-NS3，Ad-NS5a and Ad-
NS5b were successfully constructed． All the adenovirus carrying virus-encoded proteins can effectively infect hepatoma cells． We suc-
cessfully prepare high-titer adenoviruses Ad-core，Ad-E1，Ad-E2，Ad-F，Ad-NS3，Ad-NS5a，and Ad-NS5b，which could lay down the
footstone for the following biofunctional study．
Key words: Hepatitis C virus-encoded proteins Shuttle plasmid Backbone plasmid Homogeneous recombination Adeno-
virus
收稿日期:2010-08-09
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30972586) ，重庆市自然科学基金重点项目(CSTC，2009BA5036)
作者简介:刘娇，女，硕士，研究方向:病毒性肝炎的发病机制;E-mail:liujiaocy@ 126． com
通讯作者:唐霓，女，博士，研究方向:病毒性肝炎的发病机制;E-mail:nitang809@ 163． com
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，
HCV)感染引起的一种传染性疾病，主要通过血液
传播。目前全世界有超过 1． 7 亿人感染 HCV，其中
80%的感染者会转变成慢性持续感染状态，并进一
步发展为肝硬化甚至肝癌，但目前尚无有效预防
HCV感染的疫苗和抗病毒药物［1 － 3］。HCV 感染已
成为严重危害人类健康的公共卫生问题。
HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属，是有被膜的
单股正链 RNA 病毒，主要在肝细胞中复制［4］。HCV
基因组全长约 9． 6 kb，编码约 3 010 个氨基酸的多蛋
2011 年第 3 期 刘娇等:丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建
白前体，在宿主和信号肽酶的作用下，最后加工成至
少 10种成熟的病毒蛋白，包括 4 种结构蛋白(core、
E1、E2 和 p7)和 6 种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4a、
NS4b、NS5a 和 NS5b)［5］。最近还检测到了一种由
HCV核心蛋白编码序列的移码产物———F蛋白［6］。
目前认为病毒编码蛋白可以直接与细胞内的重
要调节蛋白结合，以病毒 －宿主细胞相互作用方式
影响某些重要信号通路的传递，导致 HCV感染后相
关肝病的发生。本试验拟构建表达 core、E1、E2、F、
NS3、NS5a和 NS5b 的重组腺病毒载体，旨在研究上
述蛋白对细胞生物学功能的影响以及与 HCV 相关
疾病的关系。
1 材料和方法
1． 1 材料
1． 1． 1 质粒、菌株 含有 HCV1a 型全长基因组
cDNA克隆的重组质粒 H/FL、穿梭质粒 pAdTrack-
TO4、含腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 的 BJ5183 感受
态细胞、电转感受态细胞 JM109 为本实验室保存。
1． 1． 2 主要试剂 各种限制性内切酶、T4 DNA连接
酶、PmeⅠ酶和 PacⅠ酶购自 NEB，质粒提取试剂盒为
Promega公司产品，Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 购
自 TaKaRa 公司，转染试剂 Lipofectamine 2000 为 In-
vitrogen产品。
1． 1． 3 细胞株 HEK293 细胞、人肝癌细胞系
Huh7 分别培养于含 10%胎牛血清，100 μ /mL 青霉
素及 100 μg /mL 链霉素的 DMEM 或 MEM 培养基
(Hyclone)中，在 37℃，5% CO2条件下常规培养。
1． 2 方法
1． 2． 1 穿梭载体的构建和鉴定 根据 core、E1、
E2、F、NS3、NS5a、NS5b 基因序列进行引物设计(表
1) ，由 Invitrogen公司合成引物后，以含有 HCV1a 型
全长基因组 cDNA 质粒 H/FL 为模板，进行 PCR 扩
增。扩增得到的目的基因片段和骨架载体 pAdTrack-
TO4经相应的限制性酶切后(表 1) ，用 T4 DNA 连接
酶连接，得到重组质粒 pAdTrack-core、pAdTrack-E1、
pAdTrack-E2、pAdTrack-F、pAdTrack-NS3、pAdTrack-
NS5a和 pAdTrack-NS5b。经 PCR、酶切验证后送 In-
vitrogen公司测序。
表 1 PCR引物序列及酶切位点
引物和酶切位点 核苷酸序列(5→3)
HCV Core(Fwd /Kozak + BamH I) CGC GGATCC ACC ATG GGCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAA
HCV Core(Rev /stop + Hind IIII) CCC AAGCTT TCA GGCTGAAGCGGGCACAGTCAG
HCV F(Fwd /Kozak + BamH I) CGC GGATCC ACC ATG GGC AGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAACCAAACGTAAC
HCV F(Rev /stop + Hind IIII) CCC AAGCTT TCA CGCCGTCTTCCAGAACCCGGA
HCV E1(Fwd /Kozak + Kpn I) CGG GGTACC ATG GGCTACCAAGTGCGCAATTCCTCGGGG
HCV E1(Rev /stop + Hind III) CCC AAGCTT TCA CGCGTCGACGCCGGCAAATAG
HCV E2(Fwd /Kozak + BamH I) CGC GGATCC ACC ATG GAAACCCACGTCACCGGGGGAAGT
HCV E2(Rev /stop + Hind IIII) CGC AAGCTT TCA CGCCTCCGCTTGGGATATGAG
HCV NS3(Fwd /Kozak + BamH I) CGC GGATCC ACC ATG GCGCCCATCACGGCGTACGCCCAG
HCV NS3(Rev /stop + Hind IIII) CCC AAGCTT TCA CGTGACGACCTCCAGGTCGGC
HCV NS5a(Fwd /Kozak + Kpn I) CGG GGTACC ATG GGC TCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATC
HCV NS5a(Rev /stop + Hind IIII) CCC AAGCTT TCA GCAGCACACGACATCTTCCGT
HCV NS5b(Fwd /Kozak + BamH I) CGC GGATCC ACC ATG GGC TCAATGTCTTATTCCTGGACAGGC
HCV NS5b(Rev /stop + Xho I) CCG CTCGAG TTA TCGGTTGGGGAGGAGGTAGAT
1． 2． 2 穿梭载体与腺病毒骨架质粒的同源重组
将测序正确的穿梭质粒 pAdTrack-core、pAdTrack-
E1、 pAdTrack-E2、 pAdTrack-F、 pAdTrack-NS3、
pAdTrack-NS5a和 pAdTrack-NS5b用 PmeⅠ酶切线性
化，电转至含腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 的感受态细
胞 BJ5183。卡那霉素培养基筛选阳性克隆，挑取克
隆扩增培养，提取质粒。用 PacⅠ酶切鉴定质粒，鉴
定成功的重组子再次转化 JM109 感受态细胞，筛选
阳性克隆并提取和酶切鉴定重组腺病毒质粒 pAd-
core、pAd-E1、pAd-E2、pAd-F、pAd-NS3、pAd-NS5a和
741
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
pAd-NS5b。
1． 2． 3 重组腺病毒在 293 细胞内的包装和扩增
重组腺病毒质粒 pAd-core、pAd-E1、pAd-E2、pAd-F、
pAd-NS3、pAd-NS5a和 pAd-NS5b经 PacⅠ酶切线性
化后转染 293 细胞，按照 Lipofectamine 2000 转染试
剂说明书操作。24 h 后在荧光显微镜下观察绿色
荧光蛋白(GFP)的表达，14 － 20 d后离心收集细胞，
液氮 /37℃水浴反复冻融 4 次，离心收集病毒裂解
液，在 293 细胞中进行病毒扩增。
2 结果
2． 1 PCR扩增目的基因
以含 HCV1a型 cDNA 的质粒 H/FL 为模板，分
别以特异性的引物经 PCR 扩增后，用 1%琼脂糖凝
胶电泳检测 PCR 产物，与 core(573 bp)、E1(576
bp)、E2(1 089 bp)、F(483 bp)、NS3(1 893 bp)、
NS5a(1 344 bp)和 NS5b(1 773 bp)预期长度一致
(图 1)。
1． DNA Marker(DL 2000) ;2． core;3． F;4． E1;5． E2;6．
NS3;7． NS5a;8． NS5b
图 1 PCR扩增 HCV core、F、E1、E2、
NS3、NS5a、NS5b基因片段
2． 2 酶切鉴定重组质粒
重组质粒 pAdTrack-core、pAdTrack-E1、pAdTrack-
E2、pAdTrack-F、pAdTrack-NS3、pAdTrack-NS5a 和
pAdTrack-NS5b经双酶切后，分别产生 573 bp、576
bp、1 089 bp、483 bp、1 893 bp、1 344 bp 和 1 773 bp
的基因片段，与预期长度一致(图 2，图 3)。测序结
果也证实插入到 pAdTrack-TO4 的 core、E1、E2、F、
NS3、NS5a和 NS5b基因序列完全正确。
1． DNA Marker(λEcoT 14 I digest) ;2． pAdTrack-TO4;
3．双酶切 pAdTrack-TO4;4，6． pAdTrack-F;5，7． 双酶切
pAdTrack-F
图 2 双酶切鉴定重组质粒 pAdTrack-F
1． DNA Marker(λEcoT 14 I digest);2．双酶切 pAdTrack-core;
3． pAdTrack-core;4．双酶切 pAdTrack-E1;5． pAdTrack-E1;6．
双酶切 pAdTrack-E2;7． pAdTrack-E2;8．双酶切 pAdTrack-
TO4;9． pAdTrack-TO4;10． 双酶切 pAdTrack-NS3;11．
pAdTrack-NS3;12．双酶切 pAdTrack-NS5a;13． pAdTrack-
NS5a;14．双酶切 pAdTrack-NS5b;15． pAdTrack-NS5b
图 3 双酶切鉴定重组质粒
2． 3 酶切鉴定重组腺病毒质粒
重组腺病毒质粒 pAd-core、pAd-E1、pAd-E2、
pAd-F、pAd-NS3、pAd-NS5a 和 pAd-NS5b 经 PacⅠ
酶切后，除了释放出 30 kb 的大片段外，还产生
4. 5 kb或 3． 0 kb小片段(图 4)。pAdTrack-TO4 有
两个 PacⅠ 酶切位点，穿梭质粒与重组质粒可以
在两者的翻译起始区或左臂发生同源重组，因此，
重组腺病毒质粒可以释放出 4． 5 kb 或 3． 0 kb 的
小片段。
841
2011 年第 3 期 刘娇等:丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建
1 ． DNA Marker(λEcoT 14 I digest) ;2 ． 双酶切 pAd-
core;3 ． 双酶切 pAd-E1;4 ． 双酶切 pAd-E2;5 ． 双酶切
pAd-F;6 ． 双酶切 pAd-NS3;7 ． 双酶切 pAd-NS5a;8 ． 双
酶切 pAd-NS5b
图 4 重组质粒 PacⅠ酶切鉴定
2． 4 荧光显微镜观察
将 HEK293 细胞包装扩增获得的高滴度重组腺
病毒 Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a
和 Ad-NS5b分别感染人肝癌细胞系 Huh7(图 5，图
6) ，观察病毒的感染效率。
图 5 重组腺病毒 Ad-core、Ad-E1、Ad-E2
和 Ad-F分别感染 Huh7 细胞
图 6 重组腺病毒 Ad-NS3、Ad-NS5a和
Ad-NS5b分别感染 Huh7 细胞
3 讨论
目前对于 HCV 编码蛋白生物学的研究主要集
中在核心蛋白、F、NS3、NS5a和 NS5b，现已证实这些
蛋白可以通过影响细胞重要的信号通路直接调控细
胞活性和增殖［7］，但除了上述蛋白以外，对于 HCV
编码的其他蛋白如 E1、E2 等的研究还不够系统和
深入;对它们与宿主细胞相互作用的分子机制的
认识还有待加深，而且上述试验大部分都是在肝
源性细胞株如 Huh7 上进行的，它们对质粒转染效
率较差，限制了进一步深入研究。本试验采用
AdEasy-1 重组腺病毒系统成功构建了高滴度病毒
Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a 和
Ad-NS5b，不仅克服了质粒转染效率较差的缺点，还
具有以下几个特点:宿主范围广，对人致病性低;在
增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;与人类基因
同源;不整合到染色体中，无插入致突变性;能在悬
浮培养液中扩增;能同时表达多个基因。但是
AdEasy-1 系统为复制缺陷性腺病毒，只有在带有病
毒转录单位的细胞(HEK293)中才获得启动转录的
能力。所以对包装细胞 HEK293 的要求很高［8］。在
构建腺病毒中所用的细胞一定要在培养的过程中保
(下转第 159 页)
941
2011 年第 3 期 柳蔚等:高表达精脒 /精胺 N1-乙酰基转移酶对人肺癌 A549 细胞株生长的影响
参 考 文 献
［1］Thomas T，Thomas TJ． Polyamines in cell growth and cell death:mo-
lecular mechanisms and therapeutic applications． Cell Mol Life Sci，
2001，58(2) :244-258．
［2］Moinard C，Cynober L，de Bandt JP． Polyamine:metabolism and im-
plications in human diseases． Clinical Nutrition，2005，24 (2) :
184-197．
［3］ Gerner EW，Meyskens FL． Polyamines and cancer:old molecules，
new understanding． Nature Reviews Cancer，2004，4:781-792．
［4］Maria CB，Vito G，Jiang JS，et al． Structures of wild-type and mutant
human spermidine /spermine N1-acetyltransferase，a potential thera-
peutic drug target． Biochemistry，2006，103(7) :2063-2068．
［5］Casero RA，Marton LJ． Targeting polyamine metabolism and function
in cancer and other hyperproliferative diseases． Nature Reviews Drug
Discovery，2007，6(5) :373-390．
［6］Marton LJ，Pegg AE． Polyamines as targets for therapeutic interven-
tion． Annu Rev Pharmacol Toxicol，1995，35:55-91．
［7］Huang Y，Pledgie A，Casero RA Jv，et al． Molecular mechanisms of
polyamine analogues in cancer cells． Anticancer Drugs，2005，16
(3) :229-241．
(责任编辑 马鑫
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 149 页)
持状态良好，传代不能超过 5 代，且传代之前的融合
率保持在 70% －80%左右。
本研究成功构建了高滴度病毒 Ad-core、Ad-E1、
Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a 和 Ad-NS5b，并将其
导入 Huh7 细胞，为进一步研究上述蛋白的生物学
功能和与肝癌的关系奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Alter HJ． To C or not to C:these are the questions． Blood，1995，85
(7) :1681-1695．
［2］Chisari FV． Unscrambling hepatitis C virus-host interactions． Nature，
2005，436:930-932．
［3］Gale M，Foy EM． Evasion of intracellular host defense by hepatitis C
virus． Nature，2005，436:939-945．
［4］Irshad M，Dhar I． Hepatitis C virus core protein:an update on its mo-
lecular biology，cellular functions and clinical implications． Med
Princ Pract，2006，15(6) :405-416．
［5］Drazan K． Molecular biology ofhepatitis C infection． Liver Transpl，
2000，6(4) :396-406．
［6］Walewski JL，Keller TR，Stump DD，et al． Evidence for a new hepati-
tis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame． RNA，
2001，7:710-721．
［7］唐霓．丙型肝炎病毒编码蛋白的生物学功能． 世界华人消化杂
志，2009，17(28) :2863-2870．
［8］Luo J，Deng ZL，Luo X，et al． A protocol for rapid generation of re-
combinant adenoviruses using the AdEasy system． Nat Protoc，2007，
2(5) :1236-1247．
(责任编辑 马鑫)
951