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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
一种构建新型 T载体的简便方法及应用
齐向辉1，2 陈辉1 沈琦1 何晨曦1 刘学1 郭齐1 陈华友1 徐虹2
(1江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013;2南京工业大学 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009)
摘 要: T 载体能够用于 PCR 产物的快速克隆且易于操作。以常用的克隆载体 pGEM-3zf(+)为出发材料，将其进行改
造为通用的 T载体。通过一步反向 PCR方法在该载体中插入带有 Xcm I酶切位点的一段序列，在 Xcm I酶的切割下产生两端
含有 T核苷酸的线型核苷酸序列，最终获得用于克隆 PCR产物的 T载体。外源基因 xdh克隆试验表明该载体构建成功，此载
体完全可以用于 PCR产物的基因克隆试验，为相关载体的改造提供了思路。
关键词: T载体 一步反向 PCR Xcm I
Simple Construction Method of a New T-vector and Its Application
Qi Xianghui1，2 Chen Hui1 Shen Qi1 He Chenxi1 Liu Xue1 Guo Qi1 Chen Huayou1 Xu Hong2
(1 School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013;
2State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Food
Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009)
Abstract: As T-vector can be operated easily，it has been widely used in the rapid cloning of PCR products． pGEM-3zf(+)as a
commonly cloning vector，was reconstructed into a common T-vector in this experiment． First of all，the sequence of Xcm I was inserted
into pGEM-3zf(+)vector by one-step-reverse PCR，then，the linear nucleotide sequence of pGEM-3zf(+)with T nucleotide at both ends
was generated through Xcm I enzyme cutting，eventually，the cloning T-vector used for PCR product was obtained． Cloning experiments of
xdh gene showed that this vector was constructed successfully，that can be used in the cloning experiment of PCR products． This re-
search provides a convenient and practical technique of vector reconstruction．
Key words: T vector One-step-reverse PCR Xcm I
收稿日期:2010-08-31
基金项目:国家自然科学基金项目(21006041) ，江苏省博士后基金项目(0901012B) ，江苏大学高级专业人才科研资助项目(08JDG009) ，江苏
大学科研立项项目(07A064)
作者简介:齐向辉，男，博士，副教授，研究方向:生物化工，分子酶工程;E-mail:qxh@ ujs． edu． cn
通讯作者:徐虹，女，教授，博士生导师，研究方向:生物化工;E-mail:xuh@ njut． edu． cn
目前有许多方法可以实现 DNA 片段的定向克
隆，其中双酶切是比较常用的方法［1］。利用限制性
内切酶可以识别并切割特定的核苷酸序列的原理，
对载体和特定 DNA进行酶切产生相同的黏性末端，
再使用 DNA连接酶实现基因的克隆。利用 T /A 克
隆也可以实现基因的定向克隆，由于在 T 载体的 3
末端有一游离的胸腺嘧啶残基(3-T) ，可以实现末
端含有游离的 A 的 DNA 片段的插入，从而完成
DNA片段与载体的连接。Taq 聚合酶等在 PCR 扩
增所得的 DNA 片段均拥有单个 3-A 残基，可以与
末端含有 3-T 的载体实现定向克隆。上述特点决
定了 T载体的运用前景十分广阔，但是商品化的 T
载体售价比较高，并且不能循环使用，使其在试验应
用中受到一定的限制。
利用 Xcm I等限制性内切酶独特的识别和切割
特性，可以人工创造 3-T 末端载体，在要改造的载
体两端人为地连接上一段含有 Xcm I 等的酶切位点
的序列，利用 Xcm I 等酶切就可以创造出新的 T 载
体。目前，人工设计的 T 载体多数是通过酶切后再
连接环化;或者克隆外源基因后再通过酶切位点连
接环化，最终由 Xcm I等酶切形成 T载体，步骤比较
繁琐［2，3］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
本研究对 pGEM-3Zf(+)进行改造，通过一步反
向 PCR方法插入带有两个 Xcm I 酶切位点的一段
部分互补的序列，通过自动环化、Xcm I 酶切，旨在
产生一种新型的两端含有 T 核苷酸的线性的基因
克隆载体，为 PCR产物的基因克隆服务。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌种与质粒 Gluconobacter oxydans NH-10
为本实验室自行筛选获得，宿主菌 XL10-Gold 和克
隆载体 pGEM-3zf(+)均为本实验室保藏。
1． 1． 2 试剂 T4 DNA 连接酶、LA Taq 聚合酶、
IPTG和限制性内切酶均购自大连 TaKaRa 公司，
λDNA /Hind Ⅲ、DL2000 Marker购自 MBI公司，其他
试剂均为分析纯，购自石家庄融慧生物科技有限公
司。引物合成与测序由江苏(镇江)恒美生物工程
有限公司完成。
1． 1． 3 培养基 G． oxydans NH-10 培养基参照文献
［4，5］，稍作改动。液体培养基(g /L) :葡萄糖
30. 0，酵母膏 5． 0，胰蛋白胨 3． 0，D-阿拉伯糖醇
10. 0，碳酸钙 15． 0，固体培养基添加 1． 5%琼脂。LB
培养基用于培养大肠杆菌，固体培养基添加 1． 5%
琼脂，加入氨苄青霉素(Amp)终浓度为 100 μg /mL
的 LB培养基，用于筛选和培养重组菌。
1． 2 方法
1． 2． 1 分子克隆技术 质粒 DNA 提取，DNA 连
接、细菌感受态制备和转化等均参照文献［6］进行。
1． 2． 2 含有 Xcm I酶切位点引物的设计和合成 运
用 Vector NTI生物信息学软件，根据载体序列情况设
计并合成以下引物。P1:5-GGACCACTCATCAAGTG-
GCCACTCAACAAGTGGGAGCTCGGTA-3;P2:3-CCC-
GCTTAAGGGTGAGTAGTTCACCGGTGAGTTGTTCACC
ACC-5，其中引物 P1 和 P2 分别含有两个首尾相连
的 Xcm I酶切位点(划线部分) ，并且两引物划线部
分完全互补。
1． 2． 3 新型 T 载体的构建 以质粒 pGEM-3zf(+)
为模板，用以上引物以及 LA Taq 酶进行 PCR 扩增，
扩增产物用 PCR试剂盒进行纯化，直接转化 XL10-
Gold感受态细胞，提取质粒即得环状的含有 Xcm I
酶切位点的 T载体质粒。
1． 2． 4 新型 T 载体的制备 环状的 T 载体质粒直
接用 Xcm I酶进行切割，得到两端分别含有 1 个“T”
末端的线性化的 T载体，命名为 pGEM-T，此载体直
接可作为含有“A”末端的 PCR产物的克隆载体。
1． 2． 5 pGEM-T载体的克隆应用 根据 NCBI上发
表的氧化葡萄糖酸杆菌的模式菌株 G． oxydans
621H 的木糖醇脱氢酶基因 xdh(约 800 bp)序列特
征，设计并合成引物:P3:5-TACCATGGTTATGTCG-
AAGAAGTTTAAG-3(划线部分为 NcoⅠ酶切位点) ;
P4:5-TGAAGCTTTCAACCGCCAGC AAT-3(划线部
分为 HindⅢ酶切位点)。以 G． oxydans NH-10基因组
DNA为模板，PCR 扩增目的基因。PCR 循环参数:
95℃预变性 2 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，
72℃延伸 60 s，反应 35个循环;最后 72℃延伸 10 min。
用 T4 DNA 连接酶将 PCR 产物连接于线性化的
pGEM-T，转化感受态细胞 XL10-Gold，菌体电泳筛
选重组子，得到重组克隆载体 pGEM-T-xdh，送公司
进行测序验证。
1． 2． 6 pGEM-T 载体克隆效率的鉴定 随机挑取
试验组菌落 14 个克隆，提取质粒，用 NcoⅠ和 Hind
Ⅲ进行双酶切验证，根据验证结果推测阳性克隆的
克隆效率。
2 结果与分析
2． 1 pGEM-T载体的构建及制备
使用 P1 和 P2 引物，以载体 pGEM-3zf(+)为模
板，通过 PCR扩增出约3． 2 kb的线性化基因片段(图
1) ，与预期结果相符，此片段两端分别引入了 Xcm I
M1，M2． DNA Markers;1． pGEM-T 载体 PCR 扩增产物;
2． xdh基因 PCR扩增产物
图 1 pGEM-T及 xdh基因 PCR电泳图
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2011 年第 3 期 齐向辉等:一种构建新型 T载体的简便方法及应用
酶切位点。PCR产物经试剂盒纯化后，直接转化感受
态细胞 XL10-Gold宿主，因引物部分具有部分互补序
列，含有两个 Xcm I 酶切位点的线性化片段自动环
化，并将该双酶切位点引入 pGEM-3zf(+)载体的多克
隆位点区域，此载体命名为 pGEM-T。以 pGEM-T 质
粒为材料，通过 Xcm I 酶切，得到线性化的在 5和 3
末端带有单个脱氧胸苷(dT)残基的载体(图 2)。该
线性 T载体经过纯化后可直接用于克隆 PCR产物。
图 2 pGEM-T载体构建示意图
2． 2 连接 xdh 基因的 pGEM-T 载体克隆及克隆效
率鉴定
以 G． oxydans NH-10 基因组 DNA 作为模板，通
过 PCR成功扩增出约 800 bp的基因片段(图 1) ，回
收纯化的 PCR 产物与 pGEM-T 载体连接并转化感
受态 XL10-Gold 细胞，挑选重组子送公司测序验证
克隆效果。结果表明，与 G． oxydans 的 xdh 基因的
相似性为 100%，说明 pGEM-T 载体将外源片段成
功克隆，此载体可以当作 T 载体用于克隆试验。随
机挑取转化菌落 14 个，液体培养后提取质粒用 Nco
Ⅰ和 Hind Ⅲ进行双酶切验证，结果(图 3)显示均有
目的条带出现，克隆正确，均为阳性克隆，无假阳性
出现。此载体完全可以用于“A”末端 PCR 产物的
克隆载体。
图 3 pGEM-T载体双酶切验证
3 讨论
国内外一些厂家已经生产出多种商用 T载体，然
而商用线性 T载体价格较贵，并且在转化宿主细胞后
不能再生，增加了科研试验的成本。另一方面，在应
用 Taq聚合酶或者末端脱氧核苷转移酶制备 T 载体
的过程中不可避免地会残留部分平末端背景载体，这
些背景载体易于自连，因此给筛选阳性克隆增添了许
多附加的工作。另外，也有一些研究通过在要改造的
载体上连接一段外缘 DNA的方法来构建 T 载体，步
骤比较繁琐。本研究构建了一种可以再生的 T 载体
pGEM-T，省去了酶切后再连接环化，或者克隆外源基
因再通过酶切位点连接环化的步骤，步骤简捷，操作
时间短［7］。该方法制备的线性 T载体不会自身环化，
连接效率及阳性克隆率较高，为廉价 T载体的制备以
及基因快速克隆提供一个具有应用前景的通用策略。
致谢:感谢广西科学院黄日波教授提供载体及其他帮助!
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红
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