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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-08-02
基金项目 : 广东省教育部产学研结合项目（2009B090200070）
作者简介 : 刘秋英 , 女 , 博士研究生 , 研究方向 : 生物医药工程 ;E-mail:qiuying_liu@126.com
通讯作者 : 王一飞 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 生物医药工程 ;E-mail:twangyf@jnu.edu.cn
人 BMP4 基因的克隆及其原核表达载体的构建
刘秋英 陈伟 毛国梁 熊盛 钱垂文 利奕成 王一飞
（暨南大学生命科学技术学院生物医药研究开基地，广州 510632）
摘 要 : 以成熟人胎盘组织为材料来源，克隆人 BMP-4 基因的全长 cDNA，经过 PCR 扩增后与 pMD18-T 载体连接，构建
pMD18-T-BMP4 克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体 pET-22b 的多克隆酶切位点连接，构建原核表达载体 pET22b-BMP4，酶
切及测序鉴定重组子。重组质粒转化至感受态的 Rosseta 宿主菌，经 IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 检测蛋白表达情况。结果显示，
从胎盘组织中成功地克隆到人 BMP4 基因，与 NCBI 中公布的序列 100% 相符合，原核表达载体 pET22b-BMP4 转化至 Rosseta 构建
表达菌体，经 IPTG 诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带。
关键词 : 骨形成蛋白 4 基因克隆 原核表达 pMD18-T 载体 pET-22b 载体
Cloning of Human Bone Morphogenetic Protein 4 and Construction of
Its Prokaryotic Expression Vector
Liu Qiuying Chen Wei Mao Guoliang Xiong Sheng Qian Chuiwen Li Yicheng Wang Yifei
（Biomedical Research and Development Center of Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract: To clone the gene sequences of bone morphogenetic protein 4 and construct the expression vector of this gene, total RNA was
extracted from human placenta and reverse transcripted to cDNA. Gene sequence of bone morphogenetic protein 4 was cloned from cDNA with
specific primers and linked to pMD18-T vector, and then, gene sequence was cloned to the expression vector pET-22b through Nde Ⅰ和 Sal Ⅰ
double digestion. The sequence of BMP4 was 100% matched with the sequence reported in NCBI. The expression vector pET22b-BMP4 was
transferred to Rosetta, and the recombined protein was expressed successfully after induced by IPTG.
Key words: Bone morphogenetic protein 4 Gene clone Prokaryotic expression pMD18-T vector pET-22b vector
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，
BMPs） 属 于 转 化 生 长 因 子 -β（transforming growth
factor β，TGF-β）超家族的成员［1］，是由 Urist 等［2］
首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种有活性
的蛋白质。BMP 活性蛋白具有使未分化的间充质细
胞定向分化为成骨细胞，并进而合成胶原 , 形成钙
化的骨组织能力，因此命名为骨形态发生蛋白。人
BMP4 基因位于 14 号染色体长臂，试验表明 BMP4
具有调节成骨细胞和软骨细胞的分化［3］，诱导异位
骨形成，促进骨折愈合［4］，以及具有控制哺乳动物
骨骼不同形态特征形成的功能［5］。在胚胎发育的早
期，BMP4 对于中胚层的造血系统的形成是必需的［6］，
BMP4 基因的缺失会导致胚胎早期的致死。本研究
拟从人成熟胚胎组织中克隆 BMP4 基因序列，再构
建到 pET-22b 原核表达质粒载体上，IPTG 诱导表达
重组蛋白，旨在为 BMP-4 蛋白的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与细菌 pET-22b 质粒和大肠杆菌 E.coli
为本实验室所保存，pMD18-T 质粒购自大连宝生物
公司。成熟人胎盘组织取自暨南大学第一附属医院
妇产科，经产妇同意后取健康足月新生儿的胎盘。
1.1.2 酶及试剂 限制性内切酶 Nde Ⅰ和 Sal Ⅰ、T4
DNA 连接酶是 TaKaRa 公司产品，Pfu DNA 聚合酶购
2012年第2期 91刘秋英等 ：人 BMP4 基因的克隆及其原核表达载体的构建
自天为时代公司，M-MuLV 逆转录酶购自 Fermentas
公司，TRNzol 总 RNA 提取试剂是 Invitrogen 公司产品，
质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒是 OMEGA 公司产
品。
1.1.3 主要仪器 凝胶琼脂糖电泳仪和蛋白电泳系
统为 Bio-Rad 公司产品，凝胶成像系统为 Beckman
公司产品，PCR 仪是美国 MJ-100。
1.2 方法
1.2.1 人胎盘组织总 RNA 的提取 取液氮冻存的人
胎盘组织，每 50-80 mg 组织加 1 mL TRNzol，用匀
浆仪进行匀浆处理。将匀浆样品室温放置 5 min，使
得核酸蛋白复合物完全分离，离心取上清，采用氯仿、
异丙醇提取，酒精沉淀后用水溶解得到总 RNA。
1.2.2 BMP-4 基因的克隆 以 RNA 为模板，Olig d
（T）为引物，根据 M-MuLV 逆转录酶说明进行操
作获得 cDNA。根据 BMP4 的 mRNA 序列的编码区
（GenBank 登录号 ：BC020546） ，利用 primer5.0 软件
进行基因克隆的 PCR 引物的设计。上游引物 ：5-G
TGCATATGATTCCTGGTAACCGAATGC-3，下游引物：
5- CATTGTCGACGCGGCACCCACATCCCTCTACTA
C-3。PCR 反应 50 μL 体系包括：cDNA 模板 1 μL，正
向引物 1 μL，反向引物 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，
dNTP 1 μL，Taq DNA 聚 合 酶 1 μL，ddH2O 40 μL。
反应程序 ：预变性 94℃ 2 min ；变性 94℃ 45 s，退
火 58℃ 30 s，延伸 72℃ 45 s，28 个循环。PCR 产物
经琼脂糖凝胶电泳分析后，使用胶回收试剂盒进行
切胶纯化。
1.2.3 pMD18-T-BMP4 质 粒 的 构 建 及 鉴 定 纯 化
后的 PCR 产物与线性的 pMD18-T 载体连接。参照
pMD18-T 载体操作说明，16℃反应 30 min，42℃热
冲击 45 s，转化感受态细胞 DH5α，氨苄抗性筛选阳
性克隆，双酶切进行鉴定。
1.2.4 pET22b-BMP4 载 体 构 建 及 鉴 定 抽 提 pET-
22b 载 体 质 粒 和 pMD18-T-BMP4 质 粒， 分 别 进 行
Nde Ⅰ和 Sal Ⅰ双酶切后回收大片段和小片段，T4
DNA 连接酶 16℃连接过夜，转化感受态细胞 DH5α，
氨苄抗性筛选阳性克隆，菌液 PCR 对重组子进行
初步鉴定。抽提 pET22b-BMP4 重组质粒，Nde Ⅰ和
Sal Ⅰ双酶切鉴定，并送测序。确认序列正确的质
粒转化感受态的 Rosetta 菌种，获得表达菌 pET22b-
BMP4（Rosetta）。
1.2.5 IPTG 诱 导 BMP4 蛋 白 表 达 按 1% 接 种 新
鲜 菌 液 pET22b-BMP4（Rosetta） 到 含 有 氨 苄 的 LB
培养基中，并以 pET-22b（Rosetta）空载体为对照
组。当菌体生长至吸光值约为 0.6 时加入终浓度为
1 mmol/L 的 IPTG 进行诱导表达，继续培养 4 h 后，
12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加上样缓冲液溶
解菌体沉淀，以 12% SDS-PAGE 电泳进行蛋白质分
析，观察目标蛋白的表达情况。
2 结果
2.1 BMP-4基因的克隆
以人胚胎组织 cDNA 为模板，设计 BMP4 引物，
通过 PCR 方法扩增目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳
鉴定，得到预期的 1 224 bp 片段（图 1）。
2.2 pMD18-T-BMP4载体构建
PCR 产物连接到 pMD18-T 载体上，经 Nde Ⅰ和
Sal Ⅰ双酶切可得到 1 200 bp 左右的小片段，说明
pMD18-T-BMP4 载体构建成功（图 2）。
2.3 pET22b-BMP4载体构建及鉴定
阳 性 克 隆 的 pET22b-BMP4（DH5α） 经 菌 液
PCR 初 步 鉴 定，BMP4 基 因 表 达 阳 性（ 图 3）。 抽
1.BMP4 基因 PCR 产物 ；2.DNA Marker
图 1 BMP4 的 PCR 琼脂糖凝胶电泳结果
1.pMD18-T-BMP4 双酶切 ；2.DNA Marker
图 2 pMD18-T-BMP4 双酶切鉴定电泳结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期92
提 pET22b-BMP4 重 组 质 粒， 并 经 Nde Ⅰ 和 Sal Ⅰ
双酶切能切下约 1 200 bp 的小片段（图 4），大小片
段都与预期相符合。测序结果与 NCBI 标准序列比
较，100% 匹配，序列完全正确，说明原核表达载体
pET22b-BMP4 构建成功，转化表达宿主菌 Rosetta，
获得表达菌 pET22b-BMP4（Rosetta）。
2.4 BMP4重组蛋白的诱导表达
工程菌经过 IPTG 诱导表达后，SDS-PAGE 电
泳分析结果（图 5）可见在分子量约为 50 kD 处有
明显的重组蛋白表达条带，与重组的 BMP4 蛋白的
分子量相符合。
1.DNA Marker ；2,3. 菌液 PCR 鉴定阳性克隆 1,3.DNA Marker ；2.pET22b-BMP4 双酶切
图 3 pET22b-BMP4 重组子 PCR
鉴定电泳结果
图 4 pET22b-BMP4 载体双酶切
鉴定电泳结果
1. 蛋白质 Marker ；2.pET22b-BMP4（Rosetta）未诱导 ；3.pET-
22b（Rosetta）空载体 ；4.pET22b-BMP4（Rosetta）诱导表达
图 5 IPTG 诱导 BMP4 重组蛋白表达的电泳结果
3 讨论
不同于其他造血因子，BMP4 可以促进骨髓红
系、粒系、血小板的全面增殖，作用广泛。在促进
干细胞分化的同时，保护相当数量的干细胞，促骨
髓增殖能力更持久。而 BMP2 和 BMP7 只是促进干
细胞的分化，作用短暂。本试验取胎盘作为首选组织，
提取人胎盘组织总 RNA，并以此为模板克隆得编码
hBMP4 的 cDNA，将 hBMP4 序列首先插入克隆载体
pMD18-T，不仅提高了 PCR 产物的连接效率，而且
T 载体本身带有较多酶切克隆位点，方便以后试验
中将 hBMP4 基因亚克隆至其他类型表达载体。本试
验采用原核表达载体 pET-22b 质粒，该质粒使用 T7
启动子，编码区 C 端添加了 His-Tag 序列，使表达
的目的蛋白带上了 His-Tag 便于通过 Ni+ 柱亲和层析
纯化目的蛋白。进一步的试验将优化工程菌的表达
工艺，并且对重组 BMP4 蛋白进行分离纯化。
4 结论
本研究从人胎盘组织中克隆了人的 BMP-4 基因，
获得长度为 1 224 bp 的基因片段，测序结果与 NCBI
所报道的基因序列 100% 匹配。通过 IPTG 诱导获得
表达重组的带有 his 标签的 BMP-4 蛋白，重组蛋白
大小约为 50 kD，与理论值相符。
参 考 文 献
［1］ Chen D, Zhao M, Mundy GR. Bone morphogentic proteins. Growth
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［2］ Urist MR, Lietze A, et al. A bovine low-molecular weight bone morp-
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［4］ Rose T, Peng H, et al. Treatment of critically sized defects and
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［5］ Drosse I, Volkmer E, Seitz S, et al. Validation of a femoral critical
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（责任编辑 李楠）