全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2010年第 1期
从非变性聚丙烯酰胺凝胶回收纯化 DNA样本
朱玉君 樊叶杨 庄杰云
(中国水稻研究所 国家水稻改良中心水稻生物学国家重点实验室 , 杭州 310006)
　　摘 　要 : 　介绍一种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收和纯化目标 DNA片段的方法 ,经比较回收纯化前后 PCR产物的电
泳结果 ,表明该方法具有简单快捷和效率高的优点。
关键词 : 　非变性聚丙烯酰胺凝胶 回收纯化 　目标 DNA片段
Rapid Recovery and Purif ication of DNA Fragments from
Nondenatur ing Polyacrylam ide Gel
Zhu Yujun Fan Yeyang Zhuang J ieyun
( Chinese N ational Center for R ice Im provem ent, S ta te Key Laboratory of R ice Science,
China N ational R ice Research Institu te, Hangzhou 310006)
　　Abs trac t: 　A method of recovering and purifying DNA fragments from nondenaturing polyacrylam ide gel was reported1 PCR p rod2
ucts amp lified from the recovered DNA samp les were detected by nondenaturing polyacylam ide gel electrophoresis and compared with
those from the original DNA samp les isolated from rice seedlings1 Results showed that this rap id method can efficiently recover the tar2
get DNA fragments from nondenaturing polyacrylam ide gel1
Key wo rds: 　 Nondenaturing polyacylam ide gel Recovery and purification Target DNA fragment
收稿日期 : 2009210213
基金项目 :国家转基因专项 (2008ZX080012004) ,水稻生物学国家重点实验室自主研究课题 ( ZZKT200801)
作者简介 :朱玉君 ,男 ,研究实习员 ,研究方向 :水稻遗传育种 ; E2mail: zhuyujun0324@ yahoo1com1cn
通讯作者 :庄杰云 ,男 ,研究员 ,博士 ,主要从事水稻遗传育种 ; E2mail: jz1803@ hzcnc1com
在分子生物学研究中 ,常常需要对目标 DNA片
段进行回收和纯化 ,其主要目的是排除非目标 DNA
片段。常见的情况有两种 ,一种是 DNA扩增反应中
往往存在非特异性扩增或多位点扩增 ,产物中一般
会出现一些非目标片段 ;第二种是对载体及目标
DNA片段酶切后 ,产物中往往含有目标片段外的多
余片段。因此 ,在应用目标片段进行进一步试验前 ,
必须对其进行回收和纯化。常见的方法有磁珠
法 [ 1 ]、凝胶浸泡法 [ 2 ]、挤压回收法 [ 3 ]等 ,其基本程序
都是应用凝胶电泳分离 DNA样品 ,显色后切取目标
条带 ,处理后释放出 DNA ,再通过酚 /氯仿抽提后乙
醇沉淀回收。
应用凝胶电泳回收 DNA片段 ,可采用琼脂糖凝
胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) ,其中 ,基于
琼脂糖凝胶的回收和纯化方法较多且较成熟 ,但琼
脂糖凝胶电泳的分辨率较低 ,一般只适用于分离
015 - 25 kb的 DNA片段 ,对于分子量较小的 DNA
片段 ,回收后需对目标 DNA片段的有效性进行验
证 [ 4 ]。小分子量 DNA片段的回收一般采用分辨率
较高的 PAGE[ 5 ]。两种方法的基本差异表现在切下
目标条带后 DNA的释放 ,其后步骤相同 ,而 DNA从
凝胶中的释放正是应用 PAGE回收 DNA 的主要
难点。
DNA难以从 PAGE胶中释放出来 ,是由丙烯酰
胺的一些特性造成的。无论是采用变性 PAGE胶 ,
还是非变性 PAGE胶 ,丙烯酰胺以 C2C键聚合 ,聚合
后很难解聚 ,在高温下又不会像琼脂糖一样熔化 ;同
时在常规试验中 , PAGE胶浓度一般为 6% - 10% ,
其分子结构非常紧密 ,不利于 DNA释放。目前通常
的做法是 ,采用无菌枪头将切取的 PAGE胶捣碎 ,放
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2010年第 1期
置在低温环境中过夜浸泡 ,收集上清液 ,用冰乙醇沉
淀纯化。但是 ,用无菌枪头捣碎胶 ,既费时 ,胶的破
碎度也不够 ,导致 DNA释放量低 ;为了提高胶的回
收率 ,需要浸泡过夜 ,会导致 DNA的降解。
本试验在前人的研究基础上 ,摸索出一种从非
变性 PAGE中回收和纯化目标 DNA片段的简易方
法 ,并应用回收后样本为模板重新扩增和电泳分离 ,
与回收纯化前 PCR产物进行比较。
1 材料和方法
111 材料
水稻微卫星标记 RM19座位上的 7个等位基因
相对应的我国主栽水稻亲本。
112 方法
11211　DNA提取 将 7份亲本材料种子分别置于
预先标号的培养皿 , 30℃发芽 7 d,采用简易法从幼
苗中提取 DNA [ 6 ]。
11212 PCR扩增 扩增反应在 EDC2810 PCR仪 (东
胜创新 )上进行 , 50μL 反应体系 : Tris2HCl (pH818)
3315 mM, ( NH4 ) 2 SO4 810 mM , MgCl2 115 mM ,
Tween220 0105% , dNTPs 012 mM ,上、下游引物各
313 ng/μL, Taq DNA聚合酶 210单位 ,模版 DNA 50
ng。反应条件 : 94℃ 2 m in; 94℃ 45 s、55℃ 45 s、
72℃ 1 m in, 30个循环 ;最后 72℃ 8 m in。
11213　PCR产物电泳及显色 在扩增产物中加入
10μL 6 ×加样缓冲液 (0125%溴酚蓝 , 0125%二甲
苯青 , 40%蔗糖 ) ,混匀 ,每份样品取 10μL上样于
6%非变性 PAGE胶。接通电极 ,在 100 V恒定电压
下电泳 ,当溴酚蓝迁移至足够分离 DNA片段时 ,关
闭电源。取下凝胶 ,用 400 mL 0105%硝酸银染色 20
m in,再用 400 mL 显色液 ( 375 mM 氢氧化钠 , 015
mM四硼酸钠 , 014%甲醛 )显色 10m in。
11214　目标 DNA片段的回收和纯化 样品清洗 :
用无菌手术刀切取含有目标 DNA 片段的非变性
PAGE胶 ,胶条宽约 2 mm,放入预先编号的称量皿
中 ,加入 1 mL ddH2 O洗涤 ,再用干净的镊子将胶条
转入 210 mL离心管。样品研磨 :将离心管置于组织
研磨仪 ( TissueLyser, Q IAGEN ) ,以 25 次 / s处理 1
m in,取下离心管 ,以 13 000 r/m in离心 30 s,将打碎的
胶收集到管底。样品浸泡 :加入 200μL分散缓冲液
(015 M醋酸铵 , 0101 M醋酸镁 , 1 mM EDTA pH810,
011% SDS) ,用无菌枪头将碎胶和缓冲液混匀 ; 60℃
温浴 60 m in,期间每 15 m in振荡 1次 ,确保缓冲液和
碎胶充分接触 ,提高 DNA的释放量。凝胶去除 :加
入 200μL氯仿萃取液 (氯仿 ∶异戊醇 ∶无水乙醇为
19∶1∶5)混匀 ,以 13 000 r/m in离心 3 m in,吸上清液
150μL,转到新的 115 mL无菌离心管中。酒精沉
淀 :加入 300μL经 - 20℃预冷的冰乙醇 ,混匀 ,静置
10 m in; 以 13 000 r/m in离心 4 m in; 弃上清液 ,用
75%的乙醇清洗 ,倒置干燥 15 - 20 m in。DNA 溶
解 : 加入 50μL 1 ×TE 缓冲液 ( 10 mM Tris2HCl
(pH810) , 1 mM EDTA (pH810) )溶解。
11215　回收产物的再扩增 以 110μl DNA溶液为
模板 ,采用 10μL反应体系 ,按前述方法进行扩增、
电泳、显色。
2 结果
幼苗中提取的 DNA经过 PCR扩增 ,产物通过
非变性 PAGE检测结果见图 12A。在 RM19座位上
的 7 个等位基因片段大小在分子量标记 200 -
300 bp之间 ,各等位基因非特异性扩增条带较多 ,背
景不清晰。将非变性 PAGE胶中目标 DNA的 PCR
产物割胶回收和纯化 ,处理后的 DNA经过 PCR再
扩增 ,电泳检测结果见图 12B。各等位基因片段大
小与回收纯化前一致 ,非特异性扩增明显减少 ,图版
背景清晰。
比较回收纯化前后 PCR产物的电泳结果 ,可以
得出以下结论 :经回收和纯化 ,有效地去除了非目标
DNA片段 ,使得非特异性扩增明显减少 ;碎胶过程
未破坏目标 DNA片段的完整性 ,纯化前后 PCR产
物片段大小一致 ;纯化前后 PCR产物电泳检测出的
条带强度基本一致 ,说明本方法的回收率达到后续
试验的要求。
3 讨论
近几年关于 DNA回收和纯化的简易方法报道
较多 [ 7 - 11 ] ,有些研究还对各类方法的优缺点进行了
比较 [ 12, 13 ] ,但这些方法都是针对基于琼脂糖凝胶的
回收和纯化 ,而从非变性 PAGE胶中回收和纯化的
报道极少。
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2010年第 1期 朱玉君等 :从非变性聚丙烯酰胺凝胶回收纯化 DNA样本
A. 以原始 DNA 样本为模板 ; B. 以纯化后
DNA为模板 ; M. DNA 分子量标记 ; 1 -
71RM19的 7个等位基因
图 1　应用非变性 PAGE对水稻微卫星标记
RM 19扩增产物的检测结果
从非变性 PAGE胶中回收 DNA片段的方法 ,最
关键的步骤是 DNA的释放 ,曾尝试前人研究所用的
方法 ,如用枪头将胶条捣碎或通过挤压将胶条碾碎 ,
但回收效果都不理想。通过不断摸索后 ,采用组织
研磨仪将胶条打碎 ,有利于 DNA的释放 ,而且试验
过程操作时间短 ,避免了因凝胶长时间浸泡而导致
DNA降解 ;回收纯化后的再扩增产物片段大小无变
化 ,说明了 DNA片段在碎胶过程中并未发生断裂。
这些结果表明 ,应用本方法可以简单快捷地从非变
性 PAGE胶中有效地回收和纯化目标 DNA片段。
参 考 文 献
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