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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
在分子生物学试验中，常常要对通过 PCR 扩增
获得的目的 DNA 片段进行回收和纯化，除去非特异
性的 DNA 片段［1］。鉴于琼脂糖凝胶电泳的分辨率
在回收小片段 DNA 时存在较大的局限性［2，3］，小片
段 DNA 的回收纯化往往需要借助于分辨率更高的聚
丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或高效液相色谱（HP-
LC），以满足分子生物学中要求较高的试验［4，5］。虽
然高效液相色谱是一个强有力的分析工具，但使用
其回收 DNA 耗时长，价格昂贵且只能单线程操作［6］，
收稿日期 ：2012-10-29
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30830005），国家杰出青年科学基金项目（39925017）
作者简介 ：周颐，女，博士研究生，研究方向 ：生物化学 ；E-mail ：susie1213@pku.edu.cn
通讯作者 ：王忆平，男，教授，博士生导师，研究方向 ：固氮基因表达调控的生化基础研究 ；E-mail ：wangyp@pku.edu.cn
从非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速高效
回收 DNA 片段
周颐  王忆平
（北京大学生命科学学院，北京 100871）
摘 要 : 获得特异性的 DNA 是开展多种分子生物学试验的前提，具有高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳是纯化特异性 DNA
的首选。借助液氮对凝胶的固化作用，介绍了通过研磨破坏聚丙烯酰胺凝胶结构回收纯化 DNA 的方法。将通过该方法回收纯化的
DNA 和采用琼脂糖凝胶电泳回收纯化的 DNA，经由聚丙烯酰胺凝胶电泳的进一步检测，结果显示，该方法与琼脂糖凝胶电泳回收
法相比，所获得 DNA 的纯度高，特异性好，且效率相当。在提高 DNA 特异性的同时也兼具了经济高效耗时少等优点，可以广泛应用。
关键词 : 非变性聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 小片段 DNA 回收纯化 凝胶阻滞试验
Rapid and Efficient Recycling DNA Fragments from Non-denaturing
Polyacrylamide Gel
Zhou Yi Wang Yiping
（College of Life Science，Peking University，Beijing 100871）
Abstract:  Obtaining specific DNA fragments is a prerequisite to carry out varieties of molecular biology experiments and polyacrylamide
gel electrophoresis is the first choice to purify specific DNA owing to its high resolution. In this assay, by exploiting the curing effect of liquid
nitrogen, an approach applying grinding to break the structure of polyacrylamide gel electrophoresis to extract and purify DNA is introduced. The
DNA purified according to the method above and the counterpart based on the purification of agarose gel electrophoresis are subjected to further
detection through polyacrylamide gel electrophoresis, with the result manifesting, the DNA purified via the method above has a higher purity and
specificity as well as an equal efficiency comparing with the one purified by agarose gel electrophoresis. The method described here improves the
specificity of DNA, and simultaneously being economical, efficient and less time-consuming, thus it worth using widely.
Key words:  Non-denaturing polyacrylamide gel Agarose gel Small DNA fragment recovery and purification Electrophoretic mobili-
ty shift assay
而聚丙烯酰胺凝胶电泳由于耗时短，价格经济，同
时可操作回收多个样品且易掌握，被广泛应用于小
片段 DNA 的回收纯化［7，8］。
针对从聚丙烯酰胺凝胶电泳中回收目的 DNA，
目前报道了几种常用的回收方案（挤压回收法［9］、
凝胶浸泡法［10］、磁珠法［11］等），并且生物公司（Qiagen，
OMEGA，Biospin 等）也研发了相应的回收试剂盒，
但冗繁的操作流程和高昂的费用以及时间成本，极
大地限制了它们的使用。考虑到从 PAGE 凝胶中回
2013年第5期 195周颐等 ：从非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速高效回收 DNA 片段
收 DNA 的困难，主要在于以 C-C 键聚合的 PAGE 胶，
其分子结构非常紧密，在高温下又不会像琼脂糖一
样熔化［12］，而挤压、凝胶浸泡等方法由于耗时久，
胶的破碎度低，限制了 DNA 的释放，回收效率差。
本试验综合考虑了以上存在的问题，结合前人的研
究成果［13-15］，探索一种简单快捷的通过增强 PAGE
凝胶的破碎度，从非变性聚丙烯酰胺凝胶中最大程
度地释放并回收纯化 DNA 片段的方法，并将回收后
的 DNA 样本用于后续的凝胶阻滞试验，旨在验证这
种纯化方法的实用性和可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
长度在 186-200 bp，通过限制性内切酶 EcoR I，
Hind III 克隆到 pUC18 载体上的大肠杆菌 merR 的一
系列启动子。
Bio-Rad 30%（29∶1）丙烯酰胺储液，ddH2O，
过硫酸铵，TEMED，6×loading buffer（0.25% 溴酚蓝、
0.25% 二 甲 苯 青、40% 蔗 糖 ），Trans2K DNA ladder
marker，Easy Pfu supermix，无水乙醇或异丙醇，醋
酸钠（pH5.2，3 mol/L），Tiangen 琼脂糖胶回收试剂
盒，Roche DIG Gel Shift Kit（2nd Generation），天恩泽
溴化乙锭（EB）清除剂，天恩泽 PAGE 回收 DNA
试剂盒，GE Health NanoDrop ND-1000。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩 增 目 的 片 段 使 用 Bio-Rad PCR 仪
C1000 进行 DNA 片段扩增。50 μL 反应体系包括 ：
25 μL 全式金 2×Easy Pfu supermix，正反向引物（10
μmol/L）各 1 μL，质粒模板 1 μL，50 ng，ddH2O 22
μL。反应条件 ：94℃ 2 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，
72℃ 15 s，30 个循环 ；72℃ 10 min。
1.2.2 PAGE 胶电泳 6% 浓度的非变性 PAGE 胶的
制备参照分子克隆（第 3 版）［1］（不同大小的 DNA
片段应选择适宜的凝胶浓度）。取 10 μL 1% 琼脂
糖切胶回收的 PCR 产物加入 2 μL 6×loading buffer
（0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，40% 蔗糖），混
匀上样。150 V 恒压电泳至二甲苯青接近胶板 3/4 处
停，室温电泳即可，冰浴效果更佳。
1.2.3 溴化乙锭染色 小心撬开玻璃板，将胶轻轻
拨入盛有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的容器中，室温染色
10 min。染色完毕后，用清水小心洗脱非特异性结
合于凝胶上的溴化乙锭。
1.2.4 从 PAGE 中回收纯化 DNA 片段 在凝胶尚
未干燥时，用干净的手术刀片将待回收的目的 DNA
片段小心的切割下来，放入干净的小号研钵中。若
PAGE 胶已经干燥并卷边，可将凝胶重新放入装有
双蒸水的培养皿中，于脱色摇床上摇动约 5 min，即
可重新获得平整的凝胶用于切胶回收。将液氮小心
的注入盛有目的 DNA 凝胶的研钵中，待液氮挥发，
用干净的小号瓷杵，将固化后的凝胶碾成均匀的粉
末，加入 2 倍胶体积的去离子水，用 1 mL 的移液
器，充分吹吸混匀并转移至 1.5 mL 的 eppendorf 管
中，14 000×g 室温离心 10 min。吸取上清至新的 1.5
mL eppendorf 管中，加入 2 倍体积预冷的无水乙醇
或 70% 体积的异丙醇，1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸
钠（pH5.2），-20℃静置 20 min，14 000×g 离心 15
min。弃上清，预冷 70% 浓度乙醇漂洗 2 次（亦可
更多次），真空抽干或室温待乙醇挥发完全，去离子
水溶解即可，如需要去除溴化乙锭，可加入溴化乙
锭清除剂处理 24 h。
2 结果
2.1 目的DNA片段的获取
大肠杆菌 merR 系列启动子经由 PCR 扩增，产
物通过 1% 的琼脂糖回收胶电泳检测的结果（图 1）
显 示， 目 的 DNA 片 段（ 大 小 在 196-200 bp 之 间 ）
通过 PCR 得到了有效地扩增，并且在 1% 的琼脂糖
回收胶的分辨率下，除了目的条带以外，没有非特
异性扩增的条带。
1 2 3 4 M
250
100
bp
1-4 ：从以不同长度的 merR 启动子为模板扩增产物中的 4 个样品 ；
M ：全式金 Trans2K 的 DNA ladder marker
图 1 PCR 目的 DNA 片段 1% 琼脂糖电泳图（回收胶）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期196
2.2 两种回收目的DNA方法的比较
将图 1 中的目的条带从 1% 的琼脂糖回收胶上
切下来，使用 Tiangen 琼脂糖胶回收试剂盒加以回收，
回收产物经由 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图
2）显示，回收的目的片段为单一 DNA 条带。
条带的干扰。
1 2 3 4 M
250
100
bp
1-4 ：将 1 中样品切胶，琼脂糖回收后得到的对应的 4 个样品 ；
M ：全式金 Trans2K 的 DNA ladder marker
图 2 琼脂糖凝胶回收纯化 DNA 的检测（1% 琼脂糖电泳）
同时将图 2 中的样品（即琼脂糖切胶回收后的
DNA 片段），上样于浓度为 6% 的非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳（图 3）。比较图 2 和图 3 可以看出，琼脂
糖电泳检测特异的单一条带经聚丙烯酰胺电泳后出
现多条非特异性条带，这些非特异性条带可能会影
响后续的凝胶阻滞试验的结果。
1 2 3 4M
1-4 ：与图 2 中相同的 4 个样品 ；M ：全式金 Trans2K 的 DNA ladder marker
图 3 琼脂糖凝胶回收纯化 DNA 的检测（6% 非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳）
将图 1 中的 PCR 扩增产物直接用于非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳，接着进行回收纯化，得到图 4 的
结果。由图 4 中的条带可见，经过非变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳回收纯化后，可以有效地消除非特异性
1R
N
N
N
2 2R 1M
1，2 ：图 1 中对应的样品 ；1R、2R ：分别是将样品 1、2 按照方法 1.2
回收纯化后的 DNA ；M ：Trans2K 的 DNA ladder marker ；N ：指示非
特异性条带的位置
图 4 聚丙烯酰胺凝胶回收纯化 DNA 的检测（6% 非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳）
2.3 两种方法回收的DNA应用在凝胶阻滞试验检
中的效果比较
进一步用凝胶阻滞试验检测不同方法下所回
收的 DNA 片段的特异性情况。将图 2 中的启动子
DNA 样品用于凝胶阻滞试验（图 3），检测启动子与
转录调控蛋白 CRP 之间的相互作用，结果见图 5。
2
T
N
N
F
3 41
1 ：DNA only ；2-4 ：加入 CRP 蛋白，并依次增加蛋白浓度 ；T ：目
标阻滞带 ；N ：非特异条带 ；F ：free DNA
图 5 琼脂糖凝胶回收纯化 DNA 用于和 CRP 蛋白的
凝胶阻滞电泳图
从图 5 可以看出，除了最下面的 free DNA 条带
和最上面的目的阻滞条带以外，还有多条非特异的
阻滞条带，这是由于不纯的 DNA 与蛋白间的非特异
性结合造成的。而通过聚丙烯酰胺凝胶回收纯化的
DNA 用于同样的凝胶阻滞试验，发现除了单一目的
2013年第5期 197周颐等 ：从非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速高效回收 DNA 片段
阻滞带以外，没有其他非特异的阻滞带出现（图 6）。 DNA，而采用本研究“1.2 方法”中回收所获得的
DNA 浓度最高，且通过该方法回收的 DNA 在纯度
上与两种回收试剂盒回收获得的 DNA 纯度相当。
3 讨论
尽管近年来有许多关于 DNA 回收、纯化方法
的报道和比较，但基本上这些方法都是基于琼脂糖
凝胶的回收和纯化方法的改良，针对从 PAGE 胶中
回收和纯化 DNA 方法的报道极少［16-18］。由于聚丙
烯酰胺凝胶在高温下不熔，强韧致密的结构又限制
了 DNA 的释放，煮沸、挤压、捣碎、浸泡的处理都
不甚理想，严重影响了回收效率［12］。就目前报道的
方法来看，有的回收率低，有的操作繁琐，有的价
格昂贵，因此完善而高效的回收方案亟待探索。本
试验在沿用一贯采用的乙醇沉淀 DNA 方法的基础
上，借助液氮对聚丙烯酰胺凝胶的固化作用，通过
研磨固化后的凝胶成粉末，破坏凝胶的结构，最大
限度的从凝胶中释放 DNA，从而提高 DNA 的回收率。
与以往报道的回收 DNA 片段的方法不同的是 ：由于
不需要反复挤压、浸泡 PAGE 胶，整个试验所需操
作时间短，随即避免了因凝胶长时间浸泡以及煮沸
法而导致 DNA 降解［15］；尽管磁珠法回收 DNA 效率
高，但磁珠价格昂贵，提高了试验成本［11］，而本方
法则没有耗材依赖性 ；无需借助组织研磨仪等高级
器材［14］，摒弃了对仪器的依赖性。
在定量评估不同方法回收 DNA 的效率上，本研
究的方法相较于另外两种方法而言，能够获得较高
的 DNA 浓度，且维持与试剂盒纯化回收的 DNA 相
当的纯度。通过一般 PAGE 试剂盒回收 DNA 得率低
的原因主要是 ：捣碎、浸泡、煮沸的方法无法最大
限度释放 PAGE 胶中的 DNA，导致溶解在液相中待
回收 DNA 样品量降低 ；用琼脂糖回收试剂盒回收
的 DNA，得率高于用 PAGE 回收试剂盒回收的结果，
但仍低于“1.2 方法”中所获得的 DNA，究其原因，
是因为吸附柱上的 DNA 在较小洗脱体积时不能最大
限度的洗脱下来，仍有部分 DNA 残留在洗脱柱上，
而如果用较大体积洗脱，固然能获得最大量的总
DNA，却牺牲了单位体积的 DNA 浓度，不能达到试
验的要求。
使用本方法回收纯化 DNA 要注意的是 ：（1）当
T
F
T ：目标阻滞带 ；F ：free DNA
图 6 聚丙烯酰胺凝胶回收纯化 DNA 用于和 CRP 蛋白的
凝胶阻滞电泳图
2.4 三种不同方法回收DNA的定量评估
从电泳结果可以看出，同一 DNA 样本，通过
PAGE 回收纯化的 DNA 在纯度和特异性上，显著
高于应用琼脂糖方法回收纯化的 DNA。与此同时，
DNA 的回收率也是我们最为关心的指标之一。针对
不同方法回收到的 DNA 得率的评估，在此将图 1 中
的两个不同的 PCR 产物，平均分为一式 3 份（每份
100 μL），通过 3 种方法加以回收（最后回收到相同
溶解体积 50 μL）：a. Tiangen 琼脂糖凝胶回收试剂盒
回收 ；b. 天恩泽 PAGE 回收 DNA 试剂盒回收（浸
泡煮沸法）；c. 利用“1.2 方法”中 PAGE 回收，通
过 NanoDrop 仪器来检测。用于校准零点的去离子水
中也相应加入了溴化乙锭清除剂，以保持与回收的
DNA 样本中的一致性，结果见表 1。
表 1 三种不同方法回收 DNA 浓度及纯度的比较
样品 A 样品 B
方法 a
浓度（ng/μL） 99.4 121.6
A260/A280 1.90 1.89
A260/A230 2.31 2.30
方法 b
浓度（ng/μL） 86.8 115.7
A260/A280 1.92 1.90
A260/A230 2.20 2.18
方法 c
浓度（ng/μL） 128.0 165.6
A260/A280 1.85 1.89
A260/A230 2.16 2.20
从表 1 中可以了解到，将样品 A 和样品 B 通过
3 种方法回收后，用 PAGE 回收试剂盒回收的 DNA
浓度最低，其次是通过琼脂糖回收试剂盒回收的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期198
用双蒸水充分溶解被研磨成粉末中的 DNA，并通过
离心分离上清和下层胶碎片后，在用移液器吸取上
清的过程尽量不要吸入下层碎片，以免影响乙醇沉
淀的效果 ；（2）为了加大上样量，可以在配胶时使
用 1.5 mm 的梳子，或者将样品先通过琼脂糖电泳回
收浓缩再上样聚丙烯酰胺凝胶电泳 ；（3）切胶用的
刀片要干净，所切条带要尽量细 ；（4）用于研磨的
研钵要清洗干净，避免 DNA 交叉污染 ；（5）无水乙
醇，醋酸钠和 75％的乙醇都要提前预冷。由于本试
验中所研究的目的 DNA 长度约有 200 bp，而分子生
物学研究中往往要用到更短的 DNA 片段（< 50 bp），
如果通过本方法回收纯化这类小片段，首先要选择
合适的丙烯酰胺储液（丙烯酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺
混合液，19∶1），同时提高用于电泳的聚丙烯酰胺
胶的浓度以加大分辨率，另外在乙醇沉淀的过程中
要相应地延长冰浴时间和离心时间。对于单链寡核
苷酸的回收也可参考使用本方法，考虑到用于分离
单链寡核苷酸的凝胶中含有尿素，因此在最后洗涤
的时候要相应多洗涤两次以除去尿素。
4 结论
通过研磨固化的凝胶以最大限度释放凝胶中的
DNA，从而快速高效地从非变形聚丙烯酰胺凝胶中
回收 DNA 片段的方法。通过不同试验手段检测，该
方法回收纯化的 DNA 特异性强，得率高，纯度较好。
因此，对于那些需要高纯度 DNA 样品的分子生物学
试验而言，是一种简单经济，能够被广大的实验室
所采纳接受的方法。
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（责任编辑 马鑫）