全 文 ：
技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
双标准曲线相对定量 PCR试验原理与方法
徐丽华1, 2
刘春雷 1, 2
常玉梅 1
梁利群 1
刘金亮1, 2
高国强 1, 2
韩启霞 1, 2
( 1中国水产科学院黑龙江水产研究所,哈尔滨 150070; 2上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306 )


摘
要:
实时荧光定量 PCR ( FQ
PCR )是一种准确有效的核酸定量分析技术, 具有易操作、高通量、高敏感性、高特异
性、高度自动化和低污染等优点, 并随新定量 PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是, 定量 PCR的高敏感性特点
使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法


双标准曲线法的试验原理和特点, 描述了定量 PCR体系的
优化方式, 探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明, 双标准曲线法是一种
经济、简单而准确的定量方法。
关键词:
双标准曲线法
相对定量 PCR
荧光扩增曲线
试验误差分析
归一化值
Theory andM ethod of Double
standard Curves
M ethod of Relative Quantification PCR
Xu L ihua
1, 2
L iu Chunlei1, 2
Chang Yume i1
L iang L iqun1
L iu J inliang1, 2
Gao Guoqiang1, 2
H an Q ixia1, 2
(
1
H eilongjiang R iverF isheriesR esearch Institute, Chinese Academy of F ishery Sciences, H arbin 150070;
2
College of Fisheries and L ife Sciences, ShanghaiO cean University, Shanghai 201306)


Abstrac:t
Rea l
tim e fluorescent quantita tive po lym erase chain reaction( FQ
PCR ) is a nucle ic acid quantifica tion techn ique, has
the advantage of simp lic ity o f operation, h igh flux, h igh sensitiv ity, re liable spec ificity, h igh ly autom ated and less po llu ted, and has been
used w idely w ith the introduction of new quantitative PCR instrum entation and operating m e thods. Rea l
tim e PCR exper im ents ca ll fo r
preciseness and redundancy because o f high sensitivity. In this v iew, w e d iscussed the expe rim en t princ iple and experim ent features of
double
standa rd curves m ethod


a improved re la tive quantification PCR m e thod, am plify how to op tim ize PCR reaction sy stem, then
descr ibed the ana ly tic approach of exper im enta l error and expe rim en tal operative sk ills, a t last, them eans o f dealing w ith exper iment da

ta. The results show ed that double
standa rd curves m ethod is econom ica,l sim ple and accurate.
Key words:
Doub le
standard curves m ethod
Re lative Quantification PCR
F luo rescence am plification curve
Ana lysis of ex

perim enta l error
Norm a lized value
收稿日期: 2010
08
09
基金项目:国家重点基础研究发展计划
973
项目 ( 2010CB126305 ) ,中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目 ( 2009H SYZX
S J

05 )
作者简介:徐丽华,女,硕士研究生,研究方向:鱼类分子生物学与基因工程育种; E
m ai:l zh engrong221@ 126. com
通讯作者:梁利群,女,研究员,硕士生导师,研究方向:水产动物基因工程育种; E
m ai:l lql iang@ f ishbreed ing. org
实时荧光定量 PCR ( rea l
tim e PCR )是 20世纪
90年代发展起来的一种准确、快速的核酸定量分析
技术, 通过在 PCR反应体系中引入一种荧光化学物
质,对 PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号
进行实时检测,得到一条荧光扩增曲线图,最后通过
参照标准曲线对反应体系中未知模板初始浓度进行
定量分析。它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、
定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生
物学研究中的重要工具。
实时荧光定量 PCR常使用的荧光化学方法主
要有 5种,分别是 DNA结合染料 ( SYBR G reen), 水
解探针,分子信标,荧光标记引物, 杂交探针 [ 1]。荧
光染料的优势在于它能监测任何 dsDNA序列的扩
增, 使用方便, 检测成本低, 但是非特异性结合容易
导致假阳性信号出现;其他方法特异性好,但是设计
探针的难度较大, 合成成本也较高。定量分析方法
2011年第 1期



徐丽华等:双标准曲线相对定量 PCR试验原理与方法
包括绝对定量分析和相对定量分析, 绝对定量指的
是用已知的标准曲线推算未知的样本的量, 可以得
到某个样本中基因的绝对拷贝数和浓度; 相对定量
指的是在待测样本中靶序列相对于另一对照样本的
量的变化,比较对两个或多个不同处理的样本中的
基因表达水平的高低变化, 得到的结果是比率 [ 2 ]。
相对定量法又分为比较 C t法,双标准曲线法和比较
定量法, 本研究以 Ro tor Gene 3000定量 PCR仪为
例,用 SYBR G reen荧光化学法,探讨双标准曲线相
对定量分析的试验操作方法。
1
双标准曲线法原理
双标准曲线法就是每次试验都分别用标准品做
内参基因和目的基因的标准曲线, 并同时扩增各个
样本中目的基因和内参基因,然后从各自标准曲线
上计算待测样本中初始表达量,将目的基因表达量
进行归一化处理以消除初始 RNA或 cDNA量的差
异带来的表达差异。归一化值 =目的基因浓度 /看
家基因浓度,最后通过公式: F = (待测组样品目的
基因浓度 /待测组样品看家基因浓度 ) / (对照组样
品目的基因浓度 /对照组样品看家基因浓度 ) , 即可
得出不同样本或不同处理下目的基因的表达量差
异,假设对照组是表达量为 1的样本,则待测样本为
对照组表达量的 n倍 [ 3]。
此方法中目的基因表达量是相对于某个内参基
因的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容
易制备,对于所用的标准品只要知道其相对稀释度
即可,无需准确计算目的基因拷贝数或浓度。内参
基因一般为一些看家基因, 因为看家基因理论上没
有个体及组织特异性, 所以其表达量差异基本可以
代表初始 RNA或 DNA量的差异。内参须满足:

研究样本之间表达量相近;
处理因素不会影
响其表达;
可与待测基因同时进行相同的扩
增 [ 4]。常用的内参有 3
磷酸甘油醛脱氢酶 ( GAP

DH )、

肌动蛋白、
2
微球蛋白、18S rRNA、葡萄糖

6
磷酸脱氢酶 ( G
6
PDH )等。
2
双标准曲线法的特点
双标准曲线相对定量分析方法的最大特点是,
应用简便,无需像比较 C t法那样对试验进行严格的
优化, 基因扩增效率不要求达到 100%这种理想状
态,也不要求目的基因和看家基因有相同的扩增效
率。不足之处是每次试验都必需对目的基因和看家
基因做两组标准曲线,而且必需有一组稳定的标准
品; 并且, 如果用于做标准曲线的标准品不同于样
品, 如标准品为质粒或纯化的 PCR产物, 而待测样
品为 cDNA, 那么标准曲线的扩增效率并不能真实
地反映样品的扩增情况 [ 5] , 因此以标准曲线来计算
样品的实际浓度就存在一定误差, 但是最终试验数
据处理是求算待测基因和看家基因的比值, 这种误
差可以抵消。
双标准曲线法比较适合于样本量不大,但是研
究的目的基因数目比较多的试验, 相对于比较 Ct
法, 避免了对每个基因扩增条件的严格优化。同时,
最好统一每个目的基因 (包括内参基因 )的 PCR体
系和 PCR扩增条件,这样就避免每次都做内参基因
的标准曲线和优化反应体系,达到减少工作量,节省
试验成本的目的。
3
双标准曲线法的操作步骤
3
1
引物设计、cDNA模板及标准品的制备
定量试验要求引物的特异性好, 避免非特异性
扩增干扰目的片段的检测。引物设计原则: 引物的
长度为 18- 27 bp, G+ C含量 45% - 55%, 上下游
引物 Tm值差别不超过 2
, Tm 值在 55 - 62
之
间, 引物 3
端不能选择 A最好选择 T, 3
端自由能最
好小于 9 kJ /m o,l尽量避免引物自身互补尤, 其避免
3
端有发夹结构, PCR产物长度要小于 200 bp。片
段太长会使 C t值延时出现,并过分消耗 PCR反应
组分降低 PCR反应效率,影响试验结果的准确性。
制备 cDNA模板要保证所有样本的反转录体系
中 mRNA起始量相等,反转录完成后做定量 PCR预
试验,扩增所有样本中内参基因, 使其 C t值大约相
等。反转录产物原液稀释 10- 50倍后作反应模板,
否则浓度太高,荧光背景过高,定量结果不准确。为
避免模板中掺入抑制剂, 如 SDS、EDTA、胍盐、甲硫
胺和磷酸钠等, 影响 PCR的扩增效率, 所以最好使
用离心柱提取 RNA。
标准品可以是扩增的目的基因片段,也可以是插
入了目的片段的质粒。质粒较单纯的 DNA片段更加
稳定,易于保存。用特异性引物, 以获得的 cDNA为
模板进行 PCR扩增,得到目的片段并进行纯化, 将不
同基因的 PCR纯化产物与 pMD18
T载体进行连接,
71
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
经转化、细菌培养,最后提取质粒用作标准品。
3
2
定量 PCR体系的优化
经过 PCR反应体系的优化, 使扩增效率达到
80% - 100% , 对应的标准曲线斜率在 - 3
9 - 3
3
之间,此时得到的标准曲线可靠性较高。而使用优
质的热启动酶、dNTP、M g2+ 及尿嘧啶
N
糖基化酶
(UNG /dUTP)防污染系统预混成定量 PCR体系也
是很重要的, 现 Q IAGEN、ABI等公司出售的 2

SYBR G reen PCR M asterM ix试剂盒, 试验所要添加
的只有引物、cDNA模板及水, 可以最大程度降低反
应变量,减少优化参数, 提高试验可重复性和可靠
性 [ 6]。一般而言,定量 PCR反应体系中各组分的终
浓度:热启动酶 1- 2 U, dNTPs( dATP、dGTP、dCTP、
dTTP / dUTP ) 0
2 - 0
5 mm o l/L, M gC l2 2
5 -
5
5 mm o l /L, UNG 0
2 - 1 U, 上游 (及下游 )引物
0
2- 1
mo l/L,退火温度及模板终浓度根据具体试
验进行优化 [ 7, 8]。引物储存时间、引物特异性及结
合能力、扩增产物的长度及 G+ C含量、PCR体系中
各组分含量、不同样本间 DNA聚合酶抑制物的存在
情况、退火温度以及循环扩增仪上不同位置的差异
等都会影响扩增效率,因此,扩增效率太低时要从这
些方面进行优化。
3
3
标准曲线的制备
每条标准曲线至少要有 5个浓度梯度, 而且每
个浓度梯度至少要有 3个重复,才能保证标准曲线
有好的线性关系。标准品做梯度稀释时要讲求技
巧,以 10倍连续梯度稀释方法为例:取 1 V标准品
原液 + 9 V稀释缓冲液, 得 10- 1标准品;取 1 V 10- 1
标准品 + 9 V稀释缓冲液,得 10- 2标准品,同理依次
稀释 10- 3, 10- 4, 10- 5,共 5个浓度梯度,切勿直接把
1 V标准品原液加入到不同体积的稀释缓冲液中,
而且每一个梯度的稀释液一定要充分混匀, 再进行
下一个浓度梯度的稀释, 这样才能使标准曲线有较
高的 R2值, 线性关系好。
如果出现不理想 (不规则 )的扩增曲线,表现为
有高的荧光初始值,线性关系不好,原因是模板浓度
高于仪器检测范围,模板一开始就结合大量染料,扰
乱了基线,这时要调整标准品稀释梯度,如可以选择
10
- 5
- 10
- 9稀释度。一般最高浓度梯度对应的 Ct
值至少不要小于 5,选取的 5个浓度梯度对应 C t值
最佳范围位于 10- 30个循环, 同时被选点的模板浓
度范围要包括待测样本浓度。
C t值的确定取决于阈值 ( thresho ld ), 荧光阈值
的缺省设置是 3- 15个循环的荧光信号标准偏差的
10倍。阈值确定后,阈值与扩增曲线的交点所对应
的循环数就是 C t值,即荧光信号强度达到设定阈值
时所经历的循环数 [ 9]。阈值应在 PCR反应的指数
扩增期设定 (图 1) ,因为这一时期每个模板的 C t值
与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系 logN 0 =
- C t
logE+ logN, 起始拷贝数越大, C t值越小。利
用不同稀释梯度的标准品作标准曲线,其中横坐标
代表标准品稀释浓度, 纵坐标代表 C ,t然后通过扩
增曲线获得未知样品的 C t值,即可从标准曲线上计
算出该未知样品目的基因起始浓度。
图 1
荧光扩增曲线
72
2011年第 1期



徐丽华等:双标准曲线相对定量 PCR试验原理与方法
3
4
熔解曲线制备
由于 SYBR Green是一种双链 DNA结合染料,
能非特异地掺入到双链中去,导致假阳性出现,影响
定量结果,所以一般 PCR反应完成后增加一条熔解
曲线, 对 PCR产物进行特异性检测, 以区分由产物
和本底造成的荧光信号 [ 10]。如果得到的熔解曲线
有单一峰值,而且峰线窄而尖 (图 2) ,说明引物特异
性好, 扩增产物单一。
图 2
熔解曲线
3
5
样本中目的基因表达量检测
如果样本量太大, 样本不能与标准品同时进
行 PCR扩增, 则做完标准曲线后再以相同的 PCR
体系和条件扩增各组样本, 然后将标准曲线导入
样本扩增曲线来计算各个样本中目的基因浓度。
为了导入标准曲线, 需要在样本扩增反应中使用
一个已知浓度的参照, 可以选择标准曲线的 5个
浓度点中的任意一个为参照, 在样品编辑中将样
品类型设置为标准品并给予相应浓度值。同一参
照可以输入多个拷贝以提高该方法的准确性。但
不能定义超过一个参照的浓度, 例如, 可以有 3个
重复的 1 000拷贝参照,但是在同一试验中不能有一
个 1 000拷贝参照和一个 100拷贝的参照 [ 11 ]。试验
完成做熔解曲线。


3
6
试验操作注意事项
定量检测试验十分灵敏,加样不准确会造成每
个样本的重复性不好,进而影响最终结果。加样要
仔细、认真、缓慢,确定每次加样完毕枪头中无明显
的残留。试验过程中使用的枪头、离心管都需经无
DNA酶的 RNA酶处理且硅化程度较高。同时, 尽
量减少枪头换取频率, 避免耗材间的差异给加样带
来的误差。由于试验中每个基因都对应多个样本模
板, 且每个模板都要做 3次重复,所以在 PCR体系
构建时,将 2
SYBR Green PCR M asterM ix,引物和
无 RNase水混在一起, 再均分到每个反应管中。而
每个模板需要单独加到反应管, 为了避免小量加样
带来误差,每次加样量不要低于 2
L,所以如果模
板浓度太高可以进行一定程度的稀释,以增加每次
的加样量。
2
SYBR Green PCR M aster M ix中含有热启动
Taq DNA聚合酶,所以操作不需在冰上进行, 但是为
了避免操作时间太长会对导致引物、模板降解和对
M asterM ix质量产生影响, 建议冰上操作。加样时要
避免强光线直射, 强光会加速 M aster M ix中的荧光
淬灭。试验药品和材料分装保存, 避免交叉污染。
试验中用于引物和模板稀释的水都要确保无菌、无
酶、无核酸及无热源污染。
操作台要设在安静,洁净的环境中,少有人员走
动, 空气流动性小, 避免空气中的杂质影响试验结
果, 可以在超净工作台上操作但不要开风机或风速
要小,防治水分蒸发导致加样误差。试验前用 75%
乙醇擦拭操作台, 加样枪等试验必需品。试验全程
穿戴手套,口罩和干净的实验服。
4
标准曲线试验误差分析
用不同批次试验来检测人为操作及实验仪器误
差对标准曲线制作的影响。本研究以鲤脑组织 cD

NA为模板,扩增鲤 18S rRNA基因 200 bp左右片段
序列,然后将其纯化并连接到 pMD18
T载体中, 克
隆后提取质粒作为标准品。紫外分光光度检测质粒
浓度为 20
g /m L,将质粒进行 10倍连续梯度稀释,
经过预试验选择 10- 3 - 10- 7 5个合适的浓度点, 用
相同的 PCR反应体系、PCR反应程序,但是分 3个
试验批次做 18S rRNA基因的标准曲线, 每条标准
曲线都有 5个浓度梯度,每个浓度梯度做 3次重复。
同一阈值进行 3次试验结果分析, 得到 3条 18S
rRNA基因的标准曲线回归方程及相关参数, 结果
见表 1。3次试验 R 2都大于 0
99,说明线性关系很
好, 标准品梯度稀释恰当, 加样误差小;扩增效率都
在 90%左右,说明引物设计合理, 而且 PCR反应体
系得到优化。
73
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
表 1
标准曲线及相关参数
试验次序 R 2 扩增效率 标准曲线回归方程
1 0
99788 0
92555 CT = - 3
514
log( con c) + 36
221
2 0
99865 0
89299 CT = - 3
608
log( con c) + 36
832
3 0
99881 0
89422 CT = - 3
605
log( con c) + 36
817
利用 Excel对标准曲线每个浓度点的 3次试验
结果进行单因素方差分析 [ 12 ] ,得到各浓度点 F检验
结果如表 2所示。结果表明, 3次试验中标准曲线 5
个浓度点的检测值差异并不显著 (P > 0
05) ,而且 3
次试验的 R2值及扩增效率很接近,说明试验批次及
自身操作所带来的试验误差对试验结果并未产生影
响。所以在用双标准曲线法对多个基因进行定量
时, 如果各个基因的 PCR反应体系、反应条件一致,
则不需要同时做内参基因和目的基因的标准曲线,
内参基因标准曲线做一次就足够; 而且如果样本数
过多,一个 RUN不能完成所有样本的检测, 可以分
成不同的批次做,试验误差不会影响定量结果。
表 2
三次重复试验各浓度梯度 F检验
浓度梯度 差异源 SS d f MS F P F crit
108
组间 6
42E + 13 2 3
21E + 13 1
97E - 01 0
826659 5
143253
组内 9
8E + 14 6 1
63E + 14
总计 1
04E + 15 8
107
组间 4
05E + 12 2 2
02E + 12 4
13E + 00 0
074423 5
143253
组内 2
94E + 12 6 4
9E + 11
总计 6
99E + 12 8
106
组间 7
19E + 10 2 3
59E + 10 1
52E + 00 0
291623 5
143253
组内 1
42E + 11 6 2
36E + 10
总计 2
13E + 11 8
105
组间 2
07E + 08 2 1
03E + 08 1
26E + 00 0
348876 5
143253
组内 4
92E + 08 6 8
20E + 07
总计 6
99E + 08 8
104
组间 3
77E + 06 2 1
88E + 06 2
59E + 00 0
15424 5
143253
组内 4
36E + 06 6 7
26E + 05
总计 8
12E + 06 8
5
试验数据处理
为了使结果准确并有统计学意义,就要求每个
试验组 (对照组和待测组 )样本量 n
6,每个样本的
重复次数
3。这样目的基因及看家基因的标准曲
线和样本不能在一个 RUN中检测完成 ( RG3000定
量 PCR仪 36孔转子 )。因此, 可以先在一个 RUN
中同时做目的基因和看家基因的标准曲线, 然后在
另一个 RUN中同时扩增每个样本的目的基因和看
家基因,如果样本过多可以分成几个 RUN来检测,
但是同一个样本的目的基因和看家基因的检测要在
同一个 RUN中完成,以避免不同试验批次造成的试
验误差。试验完成后将标准曲线导入样本扩增曲线
中,得到每个样本目的基因和看家基因 C t值和浓度
(重复样本软件自动算出均值 )。试验结果要用归
一化值表示,归一化值 =目的基因浓度 /内参基因浓
度, 根据公式算出每个样本的归一化值 [ 13] , 然后分
别统计待测组和对照组所有样本归一化值的算术平
均数及标准偏差,结果用柱形图表示 [ 14]。本试验以
18S rRNA基因为内参基因, 检测鲤低温处理组
( 6
)和常温对照组 ( 20
)中细胞色素 c氧化酶亚
基 ( s6)及肌醇
1
磷酸盐合成酶 ( s10)的基因表达量
差异,其结果用柱形图表示, 见图 3。
74
2011年第 1期



徐丽华等:双标准曲线相对定量 PCR试验原理与方法
图 3
柱形图表示基因表达差异
利用公式相对表达量 = (待测样品目的基因初
始浓度 /待测样品内参基因初始浓度 ) / (对照样品
目的基因初始浓度 /对照样品内参基因初始浓
度 ) ,计算待测组目的基因相对于对照组的表达差
异倍数。
6
结束语
相比于其他定量方法,双标准曲线法在试验操
作上有种种优势,如对 PCR体系和扩增效率的要求
不那么严格,试验误差可以在最终结果处理时消除
一部分,这就大大减少了试验的工作量,而且得到的
试验结果比较可靠,是一种经济实用,准确合理的试
验方法。目前已有人将其用于鱼类抗逆方面的研究
中 [ 15] ,并得到了预期结果。该方法必将以其高效、
简便、准确及易操作的优点,在基因表达定量研究方
面得到广泛应用。
参 考 文 献
[ 1] 张驰宇,成婧,李全双,等.荧光实时定量 PCR的研究进展.江苏
大学学报:医学版, 2006, 16 ( 3) : 268
271.
[ 2] 唐永凯,贾永义. 荧光定量 PCR数据处理方法的探讨. 生物技
术, 2008, 18( 3 ): 89
91.
[ 3] 王行,王惠民.实时定量 PCR技术的方法学分类. 临床检验杂
志, 2007, 25( 1 ): 71
72.
[ 4] 纪冬,辛绍杰.实时荧光定量 PCR的发展和数据分析.生物技术
通讯, 2009, 20( 4 ): 598
600.
[ 5] 基因有限公司 (生命科学组 ) .荧光定量 PCR技术专辑.
[ 6] 轩昊科技.荧光定量 PCR实验指南. h ttp: / /www. transhold. cn /
static/pcrmm 003. h tm
[ 7] Appl ied B iosys tem s. SYBR
G reen PCR M as ter M ix and RT
PCR
Reagen ts Protoco.l
[ 8] QIAGEN. Quant iT ect
SYBR
G reen PCR H andbook.
[ 9] 李洁.实时荧光定量 PC R技术及实例分析.中国现代教育装备,
2009( 1) : 47
50.
[ 10] 阳成波,印遇龙,黄瑞林,等.实时定量 RT
PCR的原理及方法.
免疫学杂志, 2003, 19 ( 3) : 145
150.
[ 11] Corbettresearch. R otor
Gene 3000的 6
0版本软件操作手册 (中
文版 ).
[ 12] 郭文久. M icrosoft Excel方差分析的使用.云南农业大学学报,
2000, 15( 1 ): 9
12.
[ 13] 张鋆.荧光实时定量 PCR技术初探. 生命科学趋势, 2003, 1
( 4) : 1
28.
[ 14] 侯彦峰,张照斌,胡建英, 范光丽.定量 RT
PCR检测雌二醇诱
导的青鳉鱼基因表达.中国环境科学, 2006, 26( 5 ) : 599
602.
[ 15] 李勇,丁雷,李言.低温对鲤鱼的 5个基因在不同组织中表达量
的影响.动物学报, 2008, 54 ( 3) : 460
466.
(责任编辑
李楠 )
75