全 文 ：林业科学研究 ２０１２，２５（１）：９３ ９９
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０１００９３０７
金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究
周兴文１，２，李纪元１，范正琪１
（１中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 ３１１４００；２广西玉林师范学院，广西 玉林 ５３７０００）
收稿日期：２０１１０６２８
基金项目：国家林业公益性行业科研专项（２００７０４０２８）；国家林业局＂９４８＂引进项目（２００７４０４）；国家国际合作项目（２０１１ＤＦＡ３０４９０）
作者简介：周兴文（１９７９—），男，河南南阳人，讲师，在读博士生，主要从事观赏植物分子育种研究．
通讯作者：李纪元（１９６４—），男，湖南湘阴人，研究员，博士，博士生导师，主要从事观赏植物与花卉分子育种研究．Ｅｍａｉｌ：ｊｉｙｕａｎ＿ｌｉ＠
１２６．ｃｏｍ
摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ技术，从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，
ＣＨＩ）基因的 ｃＤＮＡ全长，命名为 ＣｎＣＨＩ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＨＱ２６９８０５１。碱基序列分析表明，ＣｎＣＨＩ基因全长９５３
ｂｐ，包含５６ｂｐ的５’非翻译区、２０４ｂｐ的３’非翻译区和一个长为６９３ｂｐ编码２３０个氨基酸的开放阅读框。氨基酸
序列比对分析表明，ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的ＣＨＩ蛋白同源性都在７５％以上，与山
茶科山茶属茶树ＣＨＩ蛋白同源性高达９９％。相对荧光定量 ＰＣＲ分析表明，ＣｎＣＨＩ基因在金花茶花蕾发育过程中
呈现先急剧上升后平缓下降的趋势；在花器官的不同部位中，ＣｎＣＨＩ基因表达量最高的是雌蕊，其次是雄蕊，在萼
片和花瓣中的表达量较低且相差不大。
关键词：金花茶；查尔酮异构酶基因；序列分析；相对定量ＰＣＲ；表达特性
中图分类号：Ｓ７１８４６ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈａｌｃｏｎｅＩｓｏｍｅｒａｓｅＧｅｎｅｃＤＮＡ
ｆｒｏｍＣａｍｅｌｉａｎｉｔｉｄｉｓｓｉｍａ
ＺＨＯＵＸｉｎｇｗｅｎ１，２，ＬＩＪｉｙｕａｎ１，ＦＡＮＺｈｅｎｇｑｉ１
（１．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｙａｎｇ ３１１４００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
２．ＹｕｌｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｕｌｉｎ ５３７０００，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＣＨＩ）ｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｐｅｔａｌｓｏｆＣａｍｅｌｉａｎｉ
ｔｉｄｉｓｉｍａｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲａｎｄＲＡＣＥ，ｎａｍｅｄＣｎＣＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．
ＨＱ２６９８０５．１）．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣｎＣＨＩｉｓ９５３ｂｐｉｎｆｕｌｌｅｎｇｔｈａｎｄｃｏｎｔａｉｎｓａ５′ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅ
ｇｉｏｎ（５′ＵＴＲ）ｏｆ５６ｂｐ，ａ３′ＵＴＲｏｆ２０４ｂｐ，ａｎｄａｎｏｐｅｎｉｎｇｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ６９３ｂｐｅｎｃｏｄｉｎｇａ２３０ｐｒｅ
ｄｉｃｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＣｎＣＨＩｓｈａｒｅｄｍｏｒｅｔｈａｎ７５％ ｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈ
ＣＨＩｆｒｏｍｐｌａｎｔｓｏｆＲｏｓａｃｅａｅ，Ｅｒｉｃａｃｅａｅ，Ｓｏｌａｎａｃｅａｅａｎｄ９９％ ｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ．ＲｅｌａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
ａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣｎＣＨＩｓｈｏｗｅｄｔｈｅｔｅｎｄｅｎｃｙｏｆａｓｈａｒｐｉｎｃｒｅａｓｅａｔｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｌｏｗｌｙ；
ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｂｕｎｄａｎｃｅｉｎｃａｒｐｅｌｓ，ａｎｄｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｎｓｔａｍｅｎｓ，ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｆＣｎＣＨＩｉｎｓｅｐａｌｓａｎｄｐｅｔ
ａｌｓｗｅｒｅａｌｍｏｓｔａｔｔｈｅｓａｍｅｌｅｖｅｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｅｌｉａｎｉｔｉｄｉｓｉｍａ；ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｇｅｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｒｅｌａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｈａｒａｃｔｅｒ
金花茶组植物隶属于山茶科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）山茶属
（ＣａｍｅｌｉａＬ．），常绿灌木或小乔木，其模式植物为金
花茶（ＣａｍｅｌｉａｎｉｔｉｄｓｉｍａＣｈｉ）［１］。金花茶花色金黄，
具有很高的观赏价值，在国内被誉为“茶族皇后”、“植
物界中的大熊猫”，国外则称之为“幻想中的黄色山
茶”［２］，是培育黄色山茶花新品种的重要亲本［３－６］。
金花茶花青苷的主要成分为槲皮黄酮７葡糖
苷（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ７ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）［７］，属于类黄酮色素群。
林 业 科 学 研 究 第２５卷
查尔酮异构酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＣＨＩ）是类黄酮合
成途径中的第２个关键酶，它能催化查尔酮异构化
为４’，５，７－三羟基黄烷酮（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ），该中间产
物在经其它后续酶的催化下可形成其它黄酮类代谢
物质［８］。目前已从玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）［９］、矮牵牛
（ＰｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａＶｉｌｍ．）［１０］、紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａ
ｔｉｖａＬ．）［１１］等很多物种中克隆到了 ＣＨＩ基因，利用
基因工程手段调控查尔酮异构酶的表达来改变花色
的研究也屡见报道［１２］。但有关金花茶查尔酮异构酶
的研究尚未见报道。本研究利用 ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）和 ＲＡＣＥ技术，根据已发表的
ＣＨＩ基因保守区从金花茶花瓣中克隆到了一个 ＣＨＩ
基因ｃＤＮＡ全长，命名为ＣｎＣＨＩ，并对该基因在金花
茶花发育不同阶段以及花器官不同部位的表达特性
进行了研究，旨在为进一步研究金花茶 ＣＨＩ基因的
功能，探讨金花茶花色形成的分子机制提供理论依
据，为今后合理利用基因工程技术培育山茶新品种
提供理论基础及可操作基因。
１ 材料与方法
１．１ 材料、菌株和试剂
金花茶栽培于中国林科院亚热带林业研究所观
赏植物苗圃，于２０１０年２月盛开时采集花瓣，液氮
处理后，保存于－８０℃冰箱备用。
ＲＮＡ提取试剂盒（植物 ＲＮＡｏｕｔ）购自天泽基因
公司，反转录酶（ＡＭＶ）购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，大肠杆
菌Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α购自 ＴａＫａＲａ公司，ｐＧＥＭＴＥａｓｙ
ｖｅｃｔｏｒ购自 Ｐｒｏｍａｇｅ公司，ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡ
ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６３４９２３）为Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司
产品，限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶和其它工具酶
均购自ＴａＫａＲａ公司，质粒提取试剂盒购自 Ａｘｙｇｅｎ
公司。ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自北京博大泰克公
司，ＰＣＲ引物由生工生物工程（上海）有限公司合
成，测序由（上海）华大基因科技有限公司完成。
１．２ 试验方法
１．２．１ 引物设计 根据 ＧｅｎＢａｎｋ公布的 ＣＨＩ基因
的ｍＲＮＡ序列和ＣＤＳ信息，通过分析查找ＣＨＩ基因
保守区，用软件 Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０设计正、反向引物 ＳＰ、
ＡＰ，经ＰＣＲ扩增得到该基因的保守片段并测序；根
据测序结果设计 ＲＡＣＥ特异引物 ＧＳＰ１、ＧＳＰ２，分别
用于全长 ｃＤＮＡ的 ３’ＲＡＣＥ、５’ＲＡＣＥ扩增；最后
根据保守区、３’ＲＡＣＥ、５’ＲＡＣＥｃＤＮＡ序列的拼接
结果，在３’ＵＴＲ和５’ＵＴＲ区域设计引物Ｐ３、Ｐ４，用
于金花茶ＣＨＩ基因ｃＤＮＡ全长扩增（表１）。
表１ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因克隆及表达分析所用引物
引物名称 引物序列 用途
ＳＰ ５′ＣＡＣＧＧＣＴＡＴＣＧＧＡＧＴＧＴＡＣＣＴＣ３′ 扩增保守序列
ＡＰ ５′ＧＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡ３′
ＧＳＰ１ ５′ＧＡＡＡＧＡＣＧＧＴＴＣＣＴＴＡＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧ３′ ３’ＲＡＣＥ
ＧＳＰ２ ５′ＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＧ３′ ５’ＲＡＣＥ
Ｐ３ ５′ＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧ３′ 扩增全长
Ｐ４ ５′ＣＡＣＧＴＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＴ３′
Ｙ１ ５′ＣＧＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣ３′ 检测ＣｎＣＨＩ表达
Ｙ２ ５′ＴＧＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴ３′
１８ＳＦ ５′ＧＡＣＴＣＡＡＣＡＣＧＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣ３′ 扩增内参基因
１８ＳＲ ５′ＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ３′
１．２．２ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因ｃＤＮＡ全长的获得 金
花茶花瓣总ＲＮＡ提取采用 ＲＮＡ提取试剂盒（植物
ＲＮＡｏｕｔ２．０，天泽基因公司）说明书进行操作，然后
用Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司的反转录酶合成 ｃＤＮＡ第一链，以
反转录ｃＤＮＡ为模板用引物对 ＳＰ、ＡＰ进行扩增，扩
增条件为：９４℃预变性 ５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５４
℃退火３０ｓ，７２℃延伸５０ｓ，共３０个循环；最后，７２
℃延伸７ｍｉｎ。凝胶回收与预期目的片段大小一致
的泳带，电泳检测后连接克隆载体（ｐＧＥＭＴＥａｓｙ
ｖｅｃｔｏｒ）并转化感受态细胞（Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α），通过蓝
白斑筛选及质粒酶切鉴定阳性克隆后，送交（上海）
华大基因科技有限公司测序。
根据所得的 ｃＤＮＡ片段序列，分别设计特异性
引物 ＧＳＰ１、ＧＳＰ２，按照 ＲＡＣＥ试剂盒 ＳＭＡＲＴｅｒ
ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６３４９２３）说
明书采用ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ程序进行ｃＤＮＡ末端快速
扩增，将测序所得该基因的 ３’和 ５’序列以及中间
序列进行拼接得到 ｃＤＮＡ全长，再根据所得全长设
计特异引物ＣＨＩＦＰ、ＣＨＩＲＰ以总ｃＤＮＡ为模板进行
扩增，扩增产物凝胶回收后测序，测序结果在 Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ中进行Ｂｌａｓｔ分析。
１．２．３ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因及其编码蛋白质的生物
信息学分析 利用 ＮＣＢＩ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ）提供的在线 Ｂｌａｓｔ进行同源序列比对分析
４９
第１期 周兴文等：金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究
等，采用ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ在线查找ＣｎＣＨＩ基因ｃＤＮＡ开
放阅读框。利用瑞士生物信息学研究所（Ｈｔｐ：／／
ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）提供的ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件进行氨基酸残
基数目、组成、蛋白质相对分子量、理论等电点、稳定
性及平均可塑性等参数的在线分析；利用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ、
ＨＮＮ软件等在线分析 α螺旋（Ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ）、β转角
（Ｂｅｔａｔｕｒｎ）、无规卷曲（Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ）、延伸链（Ｅｘ
ｔｅｎｄｓｔｒａｎｄ）及疏水性等。采用 ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ（ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ）同源建模（Ｈｏｍｏｌｏ
ｇｙｍｏｄｅｌｉｎｇ）预测该基因编码蛋白质的三维结构。
利用软件ＤＮＡＭＡＮ进行ｃＤＮＡ全长电子拼接、系统
发育树构建和氨基酸序列比对等。
１．２．４ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因在花蕾中的相对荧光定
量表 达 分 析 用 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 （植 物
ＲＮＡｏｕｔ２０，天泽基因公司）提取金花茶不同发育时
期花蕾（表２）以及苞片、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊的总
ＲＮＡ，然后各取１μｇ用 Ｆｅｒｍｅｎｔａ公司的反转录酶合
成ｃＤＮＡ第一链。根据所获得的ＣｎＣＨＩ基因序列，
按照荧光定量引物要求设计引物 Ｙ１、Ｙ２，扩增片段
长度为 １４３ｂｐ。以山茶（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａＬ．）１８ＳＲＮＡ
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 Ｕ４２８１５１）为内参设计其特异引
物１８ＳＦ、１８ＳＲ（表１）。反应在ＡＢＩ７３００实时荧光定
量ＰＣＲ仪上进行，反应试剂采用 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰｒｉｍｅ
ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴＰＣＲＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）进行 ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ
反应，反应程式为两步法。每个试验设３次重复，利
用ＡＢＩ７３００实时荧光定量 ＰＣＲ仪 ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃ
ｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒｅ软件和 Ｅｘｃｅｌ软件进行数据分析，每个
样品独立重复３次，数据分析采用２－ΔΔＣＴ法［１３］。
表２ 金花茶花蕾不同发育时期及状态描述
时期 花蕾直径／ｃｍ 花蕾状态
幼蕾期 ０．８±０．１ 闭合 浅绿
初蕾期 １．１±０．１ 闭合 黄绿
显色期 １．４±０．１ 闭合 浅黄
半开期 ２．２±０．２ 半开 金黄
盛开期 ４±０．５ 盛开 金黄
２ 结果与分析
２．１ 金花茶 ＲＮＡ提取及 ＣｎＣＨＩ基因全长 ｃＤＮＡ
的获得
金花茶花瓣总ＲＮＡ提取见图１。从图上可以看
出，２８Ｓ亮度约为１８Ｓ的２倍，说明提取的总ＲＮＡ完
整无降解，质量较高，可以满足后续试验的要求。
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准ＤＬ２０００；１、２：ＲＮＡ样品
图１ 金花茶花瓣总ＲＮＡ提取
２．２ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因ｃＤＮＡ全长的克隆
采用同源克隆方法，根据 ＣＨＩ基因蛋白保守区
设计引物ＳＰ、ＡＰ（表１），以金花茶花瓣 ｃＤＮＡ为模
板经ＰＣＲ扩增及测序后得到一个长为５１７ｂｐ的目
的ｃＤＮＡ片段（图２Ａ）。将该片段所编码的蛋白在
ＮＣＢＩ上比对，发现与多个物种 ＣＨＩ基因编码的蛋
白有９０％以上的同源性。依据所得的同源特异片
段序列设计 ＲＡＣＥ特异引物 ＧＳＰ１、ＧＳＰ２分别扩增
金花茶ＣＨＩ基因的３’末端序列（图２Ｂ）和５’末端
序列（图２Ｃ），将测序后的３’、５’序列及ＲＴＰＣＲ所
得中间序列拼接后得到了全长为９５３ｂｐ的金花茶
ＣＨＩ基因序列，将该基因命名为 ＣｎＣＨＩ，提交 Ｇｅｎ
ｂａｎｋ，登录号为ＨＱ２６９８０５１。根据电子拼接的 ＣＨＩ
基因ｃＤＮＡ全长和ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ分析的开放阅读框信
息，在该序列的３’ＵＴＲ与５’ＵＴＲ设计全长特异扩
增引物，经ＰＣＲ扩增后得到７４４ｂｐ的目的基因全长
（图２Ｄ），测序结果表明所得序列与 ＣＨＩ基因电子
拼接结果一致。
５９
林 业 科 学 研 究 第２５卷
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准ＤＬ２０００；１：Ｃｎ－ＣＨＩ基因特异片段；２：３’ＲＣＡＥ扩增产物；
３：５’ＲＡＣＥ扩增产物；４：ＣｎＣＨＩ基因全长扩增产物
图２ 金花茶ＣＨＩ基因扩增电泳图
２．３ 金花茶Ｃｎ－ＣＨＩ基因ｃＤＮＡ核苷酸序列分析
利用ＮＣＢＩ提供的 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ进行分析发现，
金花茶ＣｎＣＨＩ基因包含一个长度为６９３ｂｐ的开放
读码框（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），５’非翻译区长５６
ｂｐ，３’非翻译区长２０４ｂｐ，含有植物基因中典型的加
尾信号序列 ＡＡＴＡＡ以及 Ｐｏｌｙ（Ａ）。表明该序列完
全符合一个完整基因序列的结构特征，是一条完整
的基因序列（图３）。
方框内分别表示起始密码子和终止密码子；下划线表示加尾信号序列；虚线表示Ｐｏｌｙ（Ａ）结构
图３ ＣｎＣＨＩ基因ｃＤＮＡ全长及预测的氨基酸序列
将该基因序列在 ＮＣＢＩ上进行序列比对分析，
发现该基因与西红柿（ＳｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＬ．）、圆
叶牵牛（Ｉｐｏｍｏｅａｐｕｒｐｕｒｅａ（Ｌ．）Ｒｏｔｈ）、美洲葡萄
（ＶｉｔｉｓｌａｂｒｕｓｃａＬ．）、牡丹（ＰａｅｏｎｉａｓｕｆｒｕｔｉｃｏｓａＡｎ
ｄｒ．）等物种查尔酮异构酶基因的相似性达 ７５％
以上。
２．４ 金花茶 ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白质的结构及功
能位点分析
２．４．１ 金花茶 ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白质结构分
析 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ分析表明，Ｃｎ－ＣＨＩ基因的开放阅
６９
第１期 周兴文等：金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究
读框位于５７ ７４９ｂｐ区域，编码一条含有２３０个氨
基酸的蛋白质。ＰｒｏｔＰａｒａｍ在线分析显示该蛋白的
分子量为２４６７７ｋＤ，理论等电点（ＰＩ）为５４１，原子
总数３５０４，分子式为Ｃ１１２０Ｈ１７６３Ｎ２７７Ｏ３４０Ｓ４，无信号肽，
不稳定系数４７８２，为不稳定亲水性蛋白。
金花茶ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白质二级结构以无
规则卷曲为主，占 ４３０４％；其次为 α螺旋，达
３８７％；延伸链占１８２６％；无 β转角分布区域，这
与其它多种植物的ＣＨＩ基因编码蛋白的预测结果相
似［１０］。蛋白质的功能很大程度上取决于其空间结
构，其中 α－螺旋主要功能是对蛋白质骨架起到稳
定作用，而无规卷曲结构决定了蛋白质的功能，特别
是酶的功能部位常常处于这种构象区域，通过对蛋
白质三级结构预测与分析，对理解该蛋白质功能与
结构之间的关系有着非常重要的意义。从图４可以
看出，ＣｎＣＨＩ基因预测的编码蛋白质三级结构与二
级结构预测结果相符。
图４ ＣｎＣＨＩ基因推导的编码蛋白三级结构
２．４．２ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白质功能位点分
析 利用 ＮＣＢＩＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈ进行保守
域分析表明，ＣｎＣＨＩ基因编码的蛋白属于查尔酮超
家族（图５）。
图５ ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白的保守域分析
进一步的功能位点分析表明，ＣｎＣＨＩ蛋白含有
两个保守的氢键结合位点Ｔｈｒ（Ｔ５２处）和 Ｔｙｒ（Ｙ１１０
处）（图６Ａ），两个活性催化位点 Ａｓｎ（Ｎ１１７处）和
Ｓｅｒ（Ｓ１９４处）［１４］（图 ６Ｂ），底物结合位点 Ａｒｇ４０、
Ｇｌｙ４１、Ｌｅｕ４２、Ｐｈｅ５１、Ｉｌｅ５４、Ｌｙｓ１１３、Ｖａｌ１１４［１５］，这些
位点高度保守且相对位置保持不变。
２．５ 金花茶 ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白序列多重比对
与同源性分析
为查明金花茶 ＣｎＣＨＩ基因编码蛋白与其它物
种ＣＨＩ蛋白的同源性，利用ＤＮＡＭＡＮ软件对金花茶
及其它多个物种的ＣＨＩ蛋白氨基酸序列进行多序列
比对，结果发现金花茶 ＣＨＩ蛋白与已知其它植物的
ＣＨＩ蛋白序列具有很高的同源性。金花茶ＣＨＩ蛋白
序列与山茶科山茶属植物茶树（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ．）Ｏ．
Ｋｕｎｔｚｅ）ＣＨＩ蛋白同源性高达９９％，与蔷薇科（Ｒｏｓａ
ｃｅａｅ）、杜鹃花科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、茄科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）等植
物的ＣＨＩ蛋白同源性都在７５％以上（图７），金花茶
ＣＨＩ蛋白与山茶科山茶属植物ＣＨＩ蛋白的高同源性
表明，ＣＨＩ在同属物种间的进化上是很保守的。
Ａ：氢键结合位点；Ｂ：活性催化位点
图６ ＣｎＣＨＩ基因蛋白功能位点三维分布
７９
林 业 科 学 研 究 第２５卷
物种后代码为该物种ＣＨＩ蛋白氨基酸序列的ＧｅｎＢａｎｋ登录号
图７ 金花茶ＣＨＩ与其它物种ＣＨＩ氨基酸序列的同源性分析
２．６ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因在花器官中的表达分析
２．６．１ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因在花不同发育时期的表
达分析 以山茶１８ＳｒＲＮＡ基因为内参照基因，采用
荧光定量ＰＣＲ的方法对金花茶花不同发育时期Ｃｎ
ＣＨＩ基因的表达进行了检测，结果见图８。从相对表
达量来看，ＣｎＣＨＩ基因在初蕾期的表达量最高，几
乎是幼蕾期的４倍。其次为显色期，在盛开期的表
达量最低。该基因整体的表达趋势为先急剧升高而
后慢慢降低。
图８ 金花茶花不同发育时期ＣｎＣＨＩ基因的相对表达量
２．６．２ 金花茶ＣｎＣＨＩ基因在花器官不同部位中的
表达分析 用荧光定量 ＰＣＲ的方法对金花茶花器
官不同部位ＣｎＣＨＩ基因的表达情况进行了检测，结
果见图９。可以看出，ＣｎＣＨＩ基因在雌蕊中的表达
量最高，其次为雄蕊，在萼片和花瓣中的表达量比较
接近。
图９ 金花茶花器官不同部位ＣｎＣＨＩ基因的相对表达量
３ 结论与讨论
本研究通过ＲＴＰＣＲ和 ＲＡＣＥ技术从金花茶花
瓣中成功分离出查尔酮异构酶的完整的同源基因
ＣｎＣＨＩ。该基因包含有一个全长为６９３ｂｐ的开放
阅读框，编码２３０个氨基酸，其蛋白二级结构以无规
则卷曲为主，其次为 α螺旋，无 β转角分布区域。
蛋白质功能分析表明该基因编码的蛋白属于查尔酮
超家族，具有两个保守的氢键结合位点 Ｔｈｒ５２和
Ｔｙｒ１１０，两个活性催化位点Ａｓｎ１１７和Ｓｅｒ１９４，７个底
物结合位点 Ａｒｇ４０、Ｇｌｙ４１、Ｌｅｕ４２、Ｐｈｅ５１、Ｉｌｅ５４、
Ｌｙｓ１１３、Ｖａｌ１１４，该基因编码的蛋白质与其它物种
ＣＨＩ具有极为相似的蛋白结构特征［１６］。ＣＨＩ蛋白
氨基酸同源序列比对表明，金花茶ＣＨＩ蛋白序列与
山茶科山茶属植物茶树的ＣＨＩ蛋白同源性高达９９％，
８９
第１期 周兴文等：金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究
与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的 ＣＨＩ同源性在
７５％以上，这些结果表明 ＣＨＩ在不同物种之间是相
对比较保守的。
通过相对荧光定量 ＰＣＲ的方法对金花茶不同
发育时期及花器官不同部位中 ＣｎＣＨＩ基因的表达
进行了研究，发现在金花茶花芽发育过程中 ＣｎＣＨＩ
基因的表达呈现出先急剧上升而又平缓下降的趋
势，说明金花茶ＣｎＣＨＩ基因主要在花芽发育的早期
阶段表达；对ＣｎＣＨＩ基因在花器官中的表达研究发
现，金花茶ＣｎＣＨＩ基因在苞片、萼片、花瓣、雄蕊、雌
蕊中均有表达，但在雌蕊中的表达量最高，在萼片和
花瓣中的表达相差不大，表明金花茶ＣｎＣＨＩ基因的
表达具有一定的组织特异性。此外，Ｈ．Ｉ．ＭｃＫｈａｎｎ
等对ＣＨＩ基因在紫花苜蓿中的表达进行了研究，发
现ＣＨＩ基因在幼根和根尖中的表达量最高，在叶片、
茎段中的表达量比较低［１１］。周军等对巨峰葡萄
ＣＨＩ基因的表达进行了研究，发现ＣＨＩ基因在果皮、
果肉、种子、幼叶、幼根中均有表达，但主要在花后
２ ４周的果皮中表达［１７］。本试验结合上述研究结
果可以推测，ＣＨＩ基因主要在生命活动较旺盛的部
位表达，其原因可能在于查尔酮异构酶处于植物体
内类黄酮合成途径的上游，对植物生命活动所需的
类黄酮等次生物质的合成具有重要的作用［８］。
前人研究表明ＣＨＩ是类黄酮合成途径中的第２
个关键性限制因子，对植物花色素的合成具有非常
重要的作用。有关植物花色的研究中，降低 ＣＨＩ活
性可导致查尔酮在植物体内的大量积累，从而使花
朵呈现黄色［１８－１９］，利用 ＲＮＡ干扰抑制烟草 ＣＨＩ活
性能使花粉囊变得更黄［２０］。本试验成功分离了金
花茶的ＣＨＩ基因，并对该基因及其所编码的蛋白进
行了功能预测分析，对其在花发育过程及花器官不
同部位中的表达特性进行了研究，为进一步研究该
基因的功能及其在金花茶花色形成机制中的作用奠
定了基础，为山茶花色的分子育种提供了相关的理
论依据和可操作基因。
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