全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
植物抗冻基因研究进展
饶磊 田长恩 杨礼香 王正询
(广州大学生命科学学院,广州 510006)
摘 要: 低温是作物生长一大限制因素, 许多作物不能在低温下生长或者容易受到冻害,所以通过基因工程的方法,转
入抗冻基因, 是扩大作物生长区域, 稳定作物产量的有效办法。目前通过对植物抗冻基因在抗冻机理、研究技术、应用等方面
的研究, 已经取得了一定的成果。综述抗冻基因的来源、抗冻机理、研究技术, 并做适度的展望。
关键词: 抗冻基因 植物 统计软件 研究技术
Progress in the Studies of P lantAntifreeze Gene
Rao Le i T ian Changen Yang L ix iang W ang Zhengxun
(College of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006)
Abstrac:t The temperatu re is a m ajor crop grow th constra ints, and m any crops can not g row at low temperatures, o r susceptib le
to dam age, so through genetic eng ineer ing m ethods, w e could im por an tifreeze gene into crop. Th is m ethod cou ld expand the crop area
and m ake the y ie ld stab ility. The current through the antifreeze gene in antifreeze m echan ism, research techn iques, app lication of re
search, has achieved som e results. Th is article rev iew ed the source of an tifreeze genes, antifreeze m echanism, research techniques,
and moderate outlook.
Key words: Antifreeze gene P lants S tatistica l so ftwa re Techn iques resea rch
收稿日期: 20100310
基金项目: 2008年市教育局科技计划 (应用基础研究 )一般项目 ( 08C029穗教科 [ 2008] 28号 )
作者简介:饶磊,硕士,研究方向:生物教育; Em ai:l raom ingle@i yahoo. com. cn
通讯作者:王正询,博士生导师,教授,研究方向:遗传学与分子生物学; Em ai:l w angzhengxun@ 163. com
近年来,随着人口的增长, 作物增产的压力越来
越大, 扩大作物生产区域和提高产量是两条有效的
解决途径。我国北部较为寒冷,提高作物的抗寒性
可有效扩大作物可耕种区域,向现有作物品种转入
抗冻基因,是一条有效的途径, 逐渐成为研究热点。
H ightow er等 [ 1]将抗冻基因转入番茄中,果实具有很
强的抗冻性, 已进行大田试验是其中的一个代表。
随着研究的深入,抗冻基因的来源大大扩展,研究技
术不断涌现,抗冻理论也取得了实质的发展。
1 抗冻基因来源
1. 1 鱼类
抗冻基因最初是从鱼类中发现的 [ 2] , 目前认为
鱼类抗冻蛋白从结构上至少可以分成 6种类型 [ 3 ] :
抗冻糖蛋白 ( an tifreeze g lycoproteins, AFGPs)、I型抗
冻蛋白 (AFPI)、n型抗冻蛋白 ( AFPn)、m型抗冻
蛋白 (AFPm )和 W型抗冻蛋白 ( AFPW )以及 H y
peractiveAFP[ 4]。但是由于对其调控机理不了解,
用鱼抗冻蛋白基因转化植物的研究未能达到理想的
效果 [ 5]。
1. 2 昆虫
继鱼类之后, 研究人员在一些昆虫体内发现抗
冻基因,而且与鱼类和植物相比, 昆虫抗冻蛋白的活
性高,从黄粉甲 ( tenebrio molitor)和云杉卷叶蛾 ( cho
ristoneura fum iferana )等昆虫中分离的抗冻蛋白的热
滞活性是鱼类的 10- 100倍 [ 6]。目前在昆虫中已
经提取出 20多种抗冻蛋白 [ 7 ]。肖艳华 [ 8]利用准噶
尔小胸鳖甲 MpAFP149基因对驱蚊香草进行了遗传
转化,使驱蚊香草获得了一定的抗冻性。
1. 3 植物
植物抗冻基因发现较晚,截止 2004年, 从菠菜、
大麦等植物中一共发现 20多种抗冻基因 [ 9]。尹明安
等用克隆的胡萝卜 AFP基因, 构建成植物表达载体
2010年第 8期 饶磊等:植物抗冻基因研究进展
pBAF,为农杆菌介导转化番茄、甜椒等作物奠定了试
验基础。随后,一些抗冻蛋白基因再次被成功转入到
烟草,转基因植株的抗冻性明显高于对照组 [ 10]。
1. 4 其它
在细菌等生物中也发现了抗冻基因, 但研究较
少。从目前的研究看, 植物的抗冻蛋白的热滞活性
往往低于动物和昆虫的抗冻蛋白 [ 11] , 可能在调节机
制等方面具有趋同性, 所以往往转基因效果较好。
昆虫抗冻基因转录蛋白活性较高, 但对其调节机理
还不是很清楚,所以在转录的时候,往往翻译效果或
者表型效果 (有许多非蛋白物质,如柠檬酸盐、琥珀
酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、硫酸铵、甘
油、山梨醇、丙氨酸、重碳酸铵在合适的浓度能提高
抗冻蛋白的热滞活性数倍 [ 12 ] )差异很大。
2 现有抗冻理论
通过多年的研究,学界提出过许多理论模型,比
如结合水学说、表面结合学说、吸附抑制学说等。就
目前研究看,吸附抑制学说比较合理,但是解释 AF
Ps吸附冰晶抑制其生长的理论依据尚不完善 [ 13]。
Raymond和 DeV rie[ 14 ]在 20世纪 70年代提出,
抗冻蛋白可逆地吸附在冰晶表面, 通过 Ke lvin效应
抑制其生长。G riffith和 Pihakask iMannsbaeh等认
为抗冻植物中的抗冻蛋白能结合在冰晶表面, 并通
过降低冰点来减缓冰晶形成速度, 而冰核聚物质则
能促进冰晶形成,通过这两种物质的协同作用而形
成一种特殊的控制胞外冰晶形成的机制, 从而减缓
或避免结冰造成的对细胞的机械损伤及渗透
胁迫 [ 11]。
研究发现单独抗冻蛋白的热滞性并不能达到理
想的抗冻效果,抗冻蛋白的热滞活性与抗冻蛋白的
浓度之间呈现双曲线形模型关系 [ 15] , 后来证实,抗
冻蛋白功能的发挥, 还有一系列物质的促进作用。
W u等 [ 16]分离鉴定一种抗冻蛋白的协同蛋白,可使
抗冻蛋白热滞活性提高近 4 。
一些小分子量的物质也能提高抗冻蛋白活性,
甘油、山梨醇、丙氨酸和重碳酸铵提高抗冻蛋白的热
滞活性约 3倍 [ 12]。一般当溶质的浓度在 0. 25 -
1 mol /L之间时,才会引发最佳的热滞活性 [ 17]。
抗冻基因的表达, 在多数情况下是需要冷诱导
的,这时候可溶性蛋白积累, 自由糖浓度增加, 一些
氨基酸含量发生变化,膜脂不饱和度增加,酶的构象
及同工酶酶谱发生改变, 以及一些非酶蛋白质积
累 [ 18]。要了解产生这些物质的调控机理, 弄清它们
之间的关系还需要做大量的工作。
3 挑选抗冻基因的技术路径
3. 1 染色体片段挑选
Yazd iSam adi B等 [ 19]用染色体替换法研究抗冻
基因在染色体水平的抗冻忍耐力。该试验使用
! Cheyenne∀和 !W ich ita∀两个冬麦品种, 把染色体
片段 4A、6A、1B、3B 和 4D从 ! W ich ita∀中转入
! Cheyenne∀,增加了植株冠部的湿重, 把染色体片
段 4A、5A、3B、4D 和 5D从 ! Cheyenne∀ 中转入
!W ichita∀,就会减少植株冠部的湿重。把 6A、3B和
5D 3个染色体片段从 !W ich ita∀转入 ! Cheyenne∀会
降低植株冠部的生存率,而把 5A、6A、3B、4D和 5D
从 ! Cheyenne∀转入 !W ichita∀会增加植株冠部的生
存率。把 6A、3B、7B、4D和 5D转入 ! Cheyenne∀会
显著增加冠部的含水量, 把 5A、1B、3B、5B、6B、4D
和 5D转入 !W ichita∀会显著降低冠部的含水量。这
些信息有助于研究人员找到抗冻基因,比如含水量
与抗旱性能紧密联系。从蔺忠龙等 [ 20]统计的资料
中可以看出, 在统计的 58个抗冻基因中有 41. 4%
的基因是已知抗旱的。这在原理上也比较好理解,
像抗旱、抗冻、抗盐等抗逆基因往往都包含高度亲水
基因,抗冻基因翻译出高度亲水蛋白,可以提高植株
的热滞性 (指冻点和融点之间的温度差值 ) [ 21] , 保
护细胞减轻冻害, 而抗旱和抗盐基因翻译出的高亲
水蛋白可以使植物从高渗透压的环境中吸取水分,
所以抗逆基因往往具有共通性。
3. 2 基因群挑选
近年来 DNA测序费用持续降低,测序手段日益
自动化,尤其高通量测序技术的发展为 DNA测序的
普及化奠定了基础 [ 22]。在鉴别染色体片段是否具
有抗冻性以后,从基因图谱中调出这段序列。随后
利用抑制性消减杂交 PCR和 cDNA芯片筛选技术
筛选出相关基因群。岳修乐等 [ 23]利用抑制性消减
杂交 PCR和 cDNA芯片筛选技术筛选离子芥抗冻
相关基因,找到 100多个冷诱导差异显著基因。
3. 3 基因挑选
利用序列分析软件可以找到所得序列阅读框,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
然后翻译成氨基酸序列 [ 24]。目前在抗冻基因结构
方面已有一些初步成果, 比如含有锌指结构 [ 25 ] ,含
有比较多的亲水氨基酸,含有比较多的重复序列 [ 26]
等。目前,编写这类选择、构型软件 [ 27 ]已比较易行。
确定大概的序列以后,就可以用各种软件帮助
设计引物, 用 PCR就可调出各种基因 (基因群 1) ,
与利用 RTPCR方法调出的基因 (基因群 2)进行比
对,能够从两个基因群中找到可能作为小分子 RNA
调节的基因,有可能为抗冻基因的调控原理作出重
大贡献或者优化基因挑选的技术路径。
此外, 蛋白质的翻译往往是多基因共同作用的
结果, RNA干扰技术可以使同源的靶基因沉默 [ 27 ] ,
利用此项技术使某个基因在原环境中受到功能检
验,也更有利于阐明抗冻基因的作用原理。
4 人工设计基因
长久以来, 人工定向设计功能基因一直是生物
学家的梦想,但由于配套条件与发展理论的缺失,还
远未能实现。翁宏堪 [ 28 ]以家蚕抗菌肽 Cecropin B
和 Thanatin为基础, 利用计算机辅助设计, 合成了
10个 N 端为 Ceerop in B 两亲螺旋序列, C端为
Thana tin双反向 p折叠片序列, 中间以连接序列相
连的杂合抗菌肽。目前这只是人工设计基因不多的
个例, 定向设计还有相当长的路。郭龙彪等 [ 29]设想
了一个虚拟基因组设计技术,需要根据基因间的互
作网络、连锁关系等, 涉及数量遗传学、系统生物学、
分子进化、生物信息学、数据库技术等学科的相关技
术,虽是一个有益的尝试, 但限于对水稻功能基因的
了解太少,还远不能实现。基于现在统计软件的发
展、结构决定功能的理念, 以及抗冻基因研究的功能
专一性,可以利用 AMOS等模型软件,以抗冻性 (如
热滞性,已有有效测定方法 [ 30] )为因变量, 以 螺
旋、转角、氨基酸含量、重复序列数等结构信息为
自变量 (目前已有基于序列的统计软件可以预测这
些结构信息 ) ,筛选拟合优度最好的模型, 以此模型
为出发点,设置因变量为极大值, 自变量为任意值,
利用大型计算机筛选出合适的结构参数。因目前人
工合成较短基因的技术已比较成熟, 可把合成的基
因转入模式生物中进行表型验证。
5 展望
目前对抗冻蛋白的抗冻机理研究有了更为深入
的发展,但未解释清楚, 还需要做大量的工作。以此
为出发点,今后转基因可能是不仅仅转入单独的基
因, 而是将相关影响表达的基因, 以及影响抗冻蛋白
活性的一系列物质的基因共同表达。
针对目前在植物上导入抗冻基因的弊端, 比如
抗冻基因转入后, 需要冷诱导不能应对剧烈天气变
化, 或者在基因前面加入强启动子做组成型表达会
引起代谢混乱,未来做出可控的抗冻基因是非常有
前途而且比较可行的。一方面保持对环境冷诱导的
温度敏感性,适应正常季节交替; 另一方面能够被人
工手段诱导, 比如一些小分子物质, 暂命名为抗冻
剂, 诱导产生抗冻物质以适应剧烈天气变化。
随着生物信息学、计算科学、抗冻基因原始构型
资料的积累,利用一类基因构建数学模型,辅助甚至
自动设计高热滞活性蛋白基因序列将成为可能。
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