全 文 ：盆物杖术通银
研 究报告 刀爪口2艺C 月N 口乙口G Y B [)乙L E Z I N 2(兀旧年 增刊
人凝血酶原复合物离子交换树脂的筛选及吸附性能研究
邱家山 ,3 陈刚 赵红卫 何琦 2 方为茂 钟本和 ,
四川大学化工学院 ,成都 61 仪巧5;, 中蓝展光化工研究院 ,成都 61 仪碎1;,成都英德生物工程有限公司.成都 61 峨又场3)
摘 要: 采用若干种人工合成的大孔阴离子交换树脂 ,对人血装中凝血酶原复合物(PC C )的分离纯化性能进行了研究
同时.将 D EA卫一 seP had ex A5 0 对Pc c 的分离纯化性能与该类人工合成分离纯化材料进行了时比研究结果表明,在各种人工
合成大孔阴离子交换树脂中,C G一6 对 Pc c 具有较优的分离纯化性能;并系统研究了C G一6 树脂对 Pc c 分离纯化性能
关扭词: 大孔阴离子交换树脂 人凝血醉原复合物 分离纯化
S electi o n Of Io n E x ch a n g e Re sin
H U刃比 s n P ro th r o刃比bi n
a n d A d so印 ti o n P erfo rm a n ce fo r
C o m P lex C on cen tra te s
Q iu Jias han l3 C h en G an g, Z hao H on尹 ei, H e Q iZ Fan g W euna o, Z h ong B enh e
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A bst act: Th e sep现 ion an d p如 五eatio n p erfo rman ee o f h uman prothr omb in eo卿 lex con eentra e, w ere stu di ed by us e o f seve司
am on ex ch ange res in . Th ese exP enm ents eo 哪 ar e 州 th th e ads orP ti on of D E A E 一Sephadex A 50 . T he resd ts 15 tha t C G 一6 has bet er
adso rp ti on Pe而 rman ee fo r PC C . Th e ads o 印tion Perfo rman e of C G 一6 fo r PC C w ere de司 ed ,tu di ed .
K6 y wo rd s : 随 cro reti eu址 ani on exehan罗r re sin prothromb in eo呻 lex con eentr ate s separti on an d pu ri fie胡o n
凝血酶原复合物(而 th ro m bin Com plex Concen-
tra tes,PC C )又称 lX 因子复合物 (Faeto: IX Com plex
Con ce ntra te s), 是从健康人混合血浆中分离制备的
一种主要含维生素 K 依赖的凝血因子 n 姐 IX
X 的血浆蛋白制品 临床上广泛应用于治疗乙型血
友病和因肝疾患引起的凝血功能异常 , 以及由维生
素 K 缺乏而继发的 1 姐 Ix X 因子低下所致出
血 在国内由于肝炎发病率很高因而大量应用在临
床肝脏出血的病人 随着医生的认同 , PC C 的使用
量正在逐年增加
PC C 中的四个因子有相似的理化性质 ,具有相
似的分子量 等电点 电泳迁移率 ,其相对分子量
为 :54一7 Ik D ,等电点为 :4.1一4. 6 目前均采用离子
交换吸附法 ,从去冷沉淀的血浆或低温乙醇分离组
份 nl 中分离纯化 PC C , 所采用的离子交换树脂基
本上均为由天然多糖制备的生物凝胶 ,如祛码西亚
公司生产的 D EA E一 Se pha de x A 50 树脂 该类分离
纯化材料除亲水性好 具较佳蛋白分离纯化性能
外 ,较为明显的缺点是机械强度不佳 ,使用中容易
破碎 ,流体力学性能不佳以及价格昂贵 因此 ,研制
开发具较佳机械强度 ,较佳分离纯化性能及成本低
廉的人工合成离子交换层析分离纯化材料就成为
十分迫切和有意义的工作 1. 2]
以自行合成的阴离子交换树脂为 PC C 层析分
离纯化材料 ,研究了其对 PC C 的分离纯化性能 ,同
时和 D EA E 一 Sephad ex A 50 进行T 比较
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
收稿日期:2(X 玲一03 一08
作者简介:邱家山(l % 3一).男 ,博士研究生 ,主要从事生物分离纯化研究;E 一画 卜可sqy @ 16 3.com
通讯作者:赵红卫 ,副教搜 ,E一耐 l:zb ao hw@ 163 com
2O( 为 年增 刊 邱家山等:人凝血酶原复合物离子交换树脂的筛选及吸附性能研究 34 1
O EM A RZ130/C 电子精密天平 ,奥豪斯 (上海 )
公司 ;SH A 一C 型往复式水浴恒温箱 ,江苏金坛正基
仪器有限公司;PH S一25 C 型酸度计 , 上海康仪仪器
有限公司;s HZ 一D (班) 水循环式真空泵 ,巩义英峪
予华仪器厂 ;72l w 微机型可见分光光度计 ,上海光
学仪器五厂
D EA E 一Se曲 ad ex A 50 凝胶型树脂 , A m ers ham
公司 ;新型高分子合成阴离子树脂 , 四川成都中蓝
晨光化工研究院;凝血酶原复和物浓缩制剂(PC C) ,
华兰生物工程公司 ;其它试剂均为分析纯试剂
1.2 方法
1.2.1 蛋白质含量的测定 PC C 用考马斯亮蓝法l3]
测定 ,波长为 595lun
1.2. 2 静态吸附方法 用纯水配制一定较高浓度
的 PC C 溶液 , 根据需要将其稀释成不同浓度的溶
液 ,准确量取溶液 15nil ,置于已加人一定量吸附剂
的 150m l具塞锥形瓶内 ,于恒温水浴振荡器中进行
吸附反应 , 一定时间后取出测定上清液中的 PC C
浓度 ,根据物料衡算求得吸附剂吸附的 PC C 量 静
态吸附量及吸附率可由下式计算:
吸附量的计算公式 :
(Cn 一C. ) 犷q = m g/g 湿重树脂)
吸附率的计算公式 : E = C0 一C .c0
上式中表示吸附液的初始浓度(m g/nil );表示吸
附平衡后吸附液中的平衡浓度(m g/以);表示吸附液
体积(nil );表示树脂重量(g)
1.2. 3 PCC 新型树脂的筛选 本实验通过静态吸
附实验来对不同类型的新树脂进行筛选 将合成得
到的六种新树脂依次命名为 D G I一D G 3 和 C G 一1-
CG一6 树脂用酸碱处理后用纯水洗至中性 ,抽滤干
燥五分钟后分别称取等量的树脂加人盛有 巧ml 相
同浓度和 pH 值 PC C 溶液的具塞锥形瓶中 ,在设定
温度的水浴恒温箱中振荡吸附 3h 后 , 测上清液中
的 PC C 浓度 , 根据吸附量的计算公式计算并比较
各树脂的吸附容量 ,从中选出静态吸附量较大的树
月旨
1.2. 4 吸附速率的确定 选出吸附量较大的树脂
后 ,采取与树脂筛选中静态吸附相同的操作 ,吸附
过程中每隔一定时间测一次吸附液中的蛋白浓度
C.,作时间与吸附液浓度的 t一C .关系曲线 ,并比较
不同树脂在相同条件下静态吸附量和达到平衡所
需的时间
1.2. 4 吸附等温线的测定 称取约 0. 49 交换树脂
(湿重),置于盛有不同浓度的 巧 m l PCC 溶液的具塞
锥形瓶中 ,在设定温度的水浴恒温箱中振荡吸附达
到平衡 ,取上层清液 ,测其中的 PC C 平衡浓度 ,通
过计算得吸附容量 q ,作 q一C.图 ,得吸附等温线
2 结果与讨论
2.1 PC C 分 离纯化树脂 (介质 )的筛选
2.1.1 各种大孔阴离子交换树脂对 PC C 的纯化
根据 PC C 的分子结构 等电点等物理化学性
能 , 选择阴离子交换树脂作为 PCC 的分离纯化材
料 实验结果见表 1
衰 , 几种大孔阴离子交换树脂吸附 PC C 的速率
N u m be r C G 一1 D G 一l )G 一2 D G 一3 C G 一5 C G 一6
伪 .绍e of , in (g ) 0.40 2 0 .405 0 .406 0 .40 3 0 .40 3 0 .40 3
Ad SO rp tion of 代 C (Ing ) 1.114 1.380 1.78 1 0 .580 9 .186 26 .33 1
A dso rP tion rat e (% ) 3 7 1 . 4 60 5 94 1 93 30 62 87 77
条件:PC C 初始浓度 C 二2. 0哪 耐一, ,PH 二7.0 ,吸附液体积巧d ,T二30 ,吸附时间 120 m in
衰 2 几种离子交换树脂的结构与特性
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C G 一 1 D G 一l D G 一2 D( ;一3 C G 一5 C G 一6
M 即功 re ticular M ac roretieul ar
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M 即m 花石 e ul ar M ac rore tie u lar M ac rored eu lar M ac ro re ti e ular
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Al k目.叨 enee M id一al kal i Al kal eseenee M id一al kal i
34 2 性物技术通稚刀细物为彻城盯 刀以翻咖 2侧为年增刊
动切钧即三甲已月护
从表 1知 ,在所进行的六个树脂实验中属于中
强碱的 CG一6 树脂对 代 C 的交换 (吸附)量最高 ,且
具有明显的优势 这是因为强碱树脂对活性蛋 白
PC C 的吸附能力过强 ,除容易导致其失去生物活性
外 ,还难于将其从树脂上解析下来 而 C G一6 树脂
具有较为适中的碱性 , 其官能基结构对活性蛋白
PC C 具有较好的亲和性 从表 1 和表 2 还可知 ,作
为弱碱树脂的 CG 一5 由于是亲水性较强的聚丙烯
酸醋 ,它对 PC C 也有较好的交换(吸附)量 而同为
弱碱树脂的 D G一2 由于聚合物骨架为疏水性较强
聚苯乙烯型 ,对 代 C 的交换 (吸附 )量就较低 因
此 , 要选择对 此 C 分离纯化好的树脂一是要有合
适的碱性基团 ;二是要有较为亲水的高分子骨架结
构
2.1.2 Ce 系列树脂和 n E^ E一se phadex ^ 50 树脂
PC C 交换 (吸附)性能的比较 在不同初始浓度条
件下将 CG 一1 CG 一2 两种 CG 系列树脂和 D EA E
跳 phad ex A5 0 树脂进行了静态吸附对比 结果见表
3
从表 3 可知 ,不管是 CG 系列树脂还是 DEA E -
Se pha de : A5 0 树脂对 PC C 的交换 (吸附)t 均是随
着 PC C 初始浓 度的增加而增加 的 但 D EA E -
免 phadex A50 树脂对 PC C 的交换(吸附)t 要比 CG
系列树脂大得多 此外 ,还可以看出当 PC C 初始浓
度小于 l mg /时 时 CG 一 的 代 c 交换 (吸附 )量较
为接近 DEA E一Se phade: A50 树脂 由图 1 可知 ,吸
附过程中 ,在前 30m in 内 , DEA E Se 户 ade x A 50 的吸
附率要比 CG 一6 高出近 30% , 随着吸附时间的延
长 , 二者吸附率的差距逐渐减小 , 最终 CG 一6 与
DE AE Se phad ex A 50 的静态 吸附率数值 均超过
95% 在较短的时间内达到平衡 , CG 一6 吸附 PC C
的吸附速率与 D EA E Se phadex A 50 相当 ,表明 C G -
6 对 PC C 有较好的吸附性能
2.1.3 CG 系列树脂孔结构对 PC C 的交换 (吸附)能
力比较 为了考察 CG 系列树脂孔结构对 PC C 的
交换(吸附)能力的影响 ,在其他合成条件不变的情
况下 ,将交联度较高的 CG 一5 树脂和交联度较低的
CG 一6 树脂的 此C 的交换 (吸附)能力进行比较 ,见
表 4
1劫
硬 1加
2 3 4 5
n . 奄九
圈 I C G 一6 与 A印 的吸附班率
q 二2. 0叱 d 一, , pH 二7. 0 , T二30
衰 4 不同树臼孔结构对 PC C 吸附性能的影晌
R 闽 n C G 一 5 C G 一se C G 一6 C G 一倪
氏哪e of , in (g) 0 39 3 0.395 2 0.3988 0.42 59
A 山泊 rP d on ca侧犯ity 13 97 45 15 .94 39 .盯 5 39 .587
(叱了 9 wet wei 户t)
物加旧j叨 U衅 (h )
条件 :o.o75M NaCI缓冲液 pH 6.o 初始浓度
1.sm gl而 吸附液体积 15 耐 ,吸附温度 30 ,且作是
否用缓冲液浸泡的对照(加 c 表示用缓冲液浸泡过)
从表 4 知 ,在同等条件下孔结构较松散 (交联
度较低)的 CG一6 树脂对 PC C 的交换(吸附 )能力要
比孔结构较为紧密(交联度较高 )的 CG 一5 树脂高
衰 3 G C 系列的树助与 A印 树脚吸附 P C C 的性能比较
R . in C G 一2
侃 gi n ~ 即妞on (吨ld ) 0. 肠7
Sat Ula ti二 ~ en加山on (哪 尸过 ) 0. 乃5
Adso 印 tion ca到蛇ity (吨了9 wet wei户一) 14 .859
阮加晓山on U心 (h )
CG 一1
1
0 .月马33
20 .89 ,
3 .5
2.73
28 .26
0. 肠 7
0 .47 8 9
6 .5 39
0 .7 5 8
8 .47 %
3 .5
2 .9 34
20 .4 5
0. 肠 7
0. 02 3 7
23 .8 6 7
l
0 .0 34 3
35.074
0 .3 7 3
l的 .82
条件:27 一30 吸附液中含 0. 07 5M NaQ 体积15园 pH7 .
2 X珍 年 增 刊 邱家山等:人凝血酶原复合物离子交换树脂的筛选及吸附性能研究 34 3
得多
综合上述实验结果 , CG一6 树脂对 PC C 的交
换 (吸附 )能力在各种合成高分子离子交换树脂中
是较佳的 下面对 CG一6 树脂进行较为全面的研
究
2. 2 C G一6 树脂 PC C 的交换(吸附)性能
2. 2.1 不同孔结构树脂的 PC C 吸附动力学曲线比
较 从图 2 可知 , C G一6 树脂对 PC C 的交换 (吸附)
速率要比 CG 一3 树脂快得多 这是因为 PC C 各因子
蛋白的分子量一般都在 50 KD 以上 ,其分子在树脂
内部的扩散速度成为吸附速率的决定因素 而 CG -
6 树脂 (交联度较低)与 CG 一3 树脂(交联度较高 )相
比具有较为疏松的结构 因此 ,可以在一定范围内
利用树脂交联都高低的调节来调节树脂对 代C 复
合物的吸附速率
2. 2. 2 CG 一6 树脂对 PC C 的吸附动力学 从图 3 可
以看出 , C G一6 树脂对 PCC 的吸附 (交换 )在 25 m in
左右有一个吸附 (交换 )平衡 ;然后在约 15Omin 处
基本达到吸附 (交换 )平衡 第一个平衡点时 PC C
吸附(交换 )率可达约 62 .5% ,而第二个平衡点 PC C
的吸附(交换)几近达到完全 通过图 2 ,在工艺可
以确定出合理 PC C 的吸附 (交换 )终点 这样既可
保证 PC C 的吸附(交换 )量 ,又可提高生产效率
履县
T i祀 加 i n
圈 3 C G 一6 的吸附动力曲线
q 二2. 01叱 .d 一, , p H 二7.0 , T 二30
2. 2. 3 CG 一6 树 脂用 量 对 PC C 吸 附率 的影 响
在一定的 PC C 浓度下有一最佳的树脂用量 树脂
用量过大造成树脂的浪费 ,树脂用量不够又导致对
PC C 的吸附 (交换 )率过低 由图 4 可知 ,在实验条
件下 0. 吃 的树脂用量可以保证树脂对 PC C 较为完
全的吸附(交换) ,再增加树脂用量已无意义
O 一太
0 0.2 0.4 0 .6 0. 8
呵 g
一今一.C 份3 一司卜- CG币
圈 4 C G 一6 加t 对 P C C 吸附速率的影晌
q 二 2.0 11唱.园一, , pH 二7 .0 , T = 25 Tim e:150 m in
fles.nnUC 08b通乃且
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0 . 5
0
4 \ 水 ~* 叫, ~ -一
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l加 20 0 30 0
T im e/口in
圈 2 C G 一3 与 C G 一6 吸附动力曲跳比较
c0 二2. onlg.d 一, ,声 =7 .0 ,T二25
2 0 3 0 40
T /
圈 5 盆度对 C G 一6 吸附 P C C 的影晌
q 二2. onlg .园一, , pH =7 .0
3料 性物杖术通稚忍勿. 为肋城盯 刀川肠血 2仪拍 年增 刊
用 ,使得蛋白质与吸附剂间的结合力减弱 , PC C 蛋
白质大分子不能较为宽松地舒展 ,阻碍了大分子和
树脂之间的相互作用 ,使蛋白质分子难于在介质表
面吸附和重排
七润巴口
的.留\b
2. 2. 4 温度对 CG 一6 吸附 PC C 的影响 温度对蛋
白质的生理活性有着一定的影响 , 由于 PC C 为人
血浆蛋白 ,为保持 PC C 在吸附过程中性质的稳定 ,
吸附操作应在不高于 37 (体温 ) 条件下进行为
宜 本实验考察了 5一30 之间 CG 一6 树脂对 PC C
的吸附(交换 )性能 由图 5 可知 ,在 5 到 30 范
围内树脂对 PC C 的吸附 (交换 ) 率从 犯% 增加到
8 % 可见在保证 PC C 活性的前提下 ,温度的升高
有利于吸附(交换)反应的进行 ,吸附(交换)反应为
吸热过程
属40
理38写
ZC 10/mlo l.l:06 8
圈 7 离子强度对 C G 一6 吸附 p C C 的形晌
. 3 6气了
3 2 一 -- 一 一一一-- -----一 - 一
q 二 2. (ha g .d 一.pH 二7 .0 , T二15 Ti 二 :l5( 坛lin
5 6 7 8
团 va lue
圈 6 pH 位对 C G 一6 吸附 户C C 的影晌
C0 二 2 .0叱 血一, , T二30 Ti m e: 15加lin
2. 2. 5 pH 值对 CG 一6 树脂吸附 PC C 的影响 从图
6 可知 , pH 值低于 5.4 时 C G一6 树脂对 PC C 的吸附
较低 , 而且从 pH 值 5. 4 到 5.8 的趋势来看 , pH 值
低于 5.4 时对 PC C 的吸附趋势已无考察意义 另一
方面 , 当 pH 值高于 5.8 后 CG 一6 树脂对 PC C 的吸
附增加趋势也开始减缓 考虑到 Pc c 活性对 pH 值
的敏感性 , 确定 CG 一6 树脂对 PC C 吸附的最佳 pH
值为 6. 0一7. 0
2. 2. 6 离子强度对 CG一6 吸附 PC C 的影响 从图 7
可以看出 ,随着离子强度的增加 , C G一6 树脂对 PC C
的吸附量减少 这可能是因为随着离子强度的增
加 ,强化了对蛋白质与吸附剂间静电吸引的屏蔽作
3 结论
本文所研究的 CG 一6 树脂和其他人工合成高
分子分离纯化树脂相比具有对 PC C 较佳的分离纯
化性能 ,在某些方面较为接近 D EA E 一Se phad ex A 50
树脂 有望在 PC C 或其他活性蛋白的分离纯化中
部分代替 D EA E一 Se phad ex A 50 树脂或其他天然分
离纯化介质
参考文橄
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