全 文 ：人凝血酶原复合物分离纯化工艺的研究进展
邱家山 徐琦 方为茂** 钟本和
(四川大学化工学院,成都 610065)
摘 要: 人凝血酶原复合物( PCC)为人血浆中微量蛋白组份, 其浓缩制剂由凝血因子 II、VII、IX、X 组成, 在
临床上具有治疗乙型血友病等疾病的确切疗效。本文综述了近来 PCC 及 FIX 浓缩制剂分离纯化工艺的研究进展
及结合蛋白新型分离纯化技术的发展情况,讨论了该产品制备新工艺的开发方向。
关键词: 人凝血酶原复合物 分离纯化 血浆蛋白
Advance in Fractionation and Purification for Human
Prothrombin Complex Concentrates
Qiu Jiashan Xu Qi Fang Weimao Zhong Benhe
( Chemical Eng ine ering I nsti tu te , S ic huan Univ er sit y , Chengdu 610065)
Abstract: Prothrombin Com plex Concentr ates ( PCC) are minim fr act ion in human plasma. I t contains factor
II, facto r V II, facto r IX , factor XI. PCC are cur rently licensed fo r the t reatment of Hemophilia B and of the def-i
ciencies of the V itamin K dependent coagulation factor . This paper has resulted in t he development of the f ractiona-
tion and purif ication for PCC and highly purified FIX. The new preparat ion o f PCC and FIX are present ed by the de-
velopment of new techno lo gy about pr oteins fractionat ion and purificat ion.
Key words: Prothrombin complex concent rate F ractionation and pur ification Plasma pro tein
1 前言
人凝血酶原复合物 ( P rothrombin Complex
Concentrate, PCC)是一种供静脉输注, 促进血液凝
固的止血制剂, 含有凝血因子 II(凝血酶原)、凝血因
子 VII(稳定因子)、凝血因子 IX(抗乙型血友病因
子)和凝血因子 X(自身凝血酶 III)。这是一组依赖
维生素 K 在肝脏合成的凝血因子, 因而也称为/维
生素 K 依赖因子0。PCC 属糖蛋白, 分子中均含有
特殊的氨基酸残基 ) ) ) C羧基谷氨酸( Gla) , Gla 是
可以与钙离子结合的氨基酸, 它的存在使依赖维生
素 K凝血因子具有与金属离子结合的性质。依赖
维生素 K 凝血因子与钙离子结合后发生构象改变,
从而显露出与磷脂膜结合的特征, 并进而参与血液
凝固过程。依赖维生素 K 凝血因子都是丝氨酸蛋
白酶(原) ,它们的催化区在结构和氨基酸顺序上与
糜蛋白和胰蛋白酶同源。另外, 这类因子氨基酸末
端区的氨基酸顺序相似, Gla 即集中在肽链氨基末
端的前 45个氨基酸残基组成的肽段中,这一肽段被
称为/ Gla 区0。这些因子有相似的理化性质, 具有
相似的分子量、等电点、电泳迁移率, 其相对分子量
为: 54~ 71KD,等电点为: 4. 1~ 4. 6,详见表 1[ 1~ 2] 。
表 1 PCC中各组分因子的性质
名称 分子量( kD) 糖含量( % ) 氨基酸残基数 Gla数量 等电点( PI) 生物半寿期( h) 正常含量( mg/ L)
FII 72 8 579 10 4. 1 72 150~ 200
FVII 50 13 406 11 4. 0~ 4. 6 4~ 6 0. 5~ 2
FIX 56 17 415 12 4. 0~ 4. 6 24~ 56 3~ 5
FX 59 10 448 11 4. 1~ 4. 6 48~ 72 6~ 8
收稿日期: 2005-11-17
作者简介:邱家山( 1963- ) ,男,四川成都人,博士研究生,研究方向:生物分离纯化,电话: 028-85252191-8014 , Email: qjsqy@ 163. com
** 通讯作者:方为茂,博士,电话: 028-85400487, Em ail: w eimao@ 163. com
生物技术通报
# 综述与专论# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
在临床上, PCC被广泛地用于治疗乙型血友病
和由肝疾患、维生素 K 缺乏而继发的 II、VII、IX、X
因子低下所造成的出血, 也用于治疗具有 VIII 因子
抗体的甲型血友病的出血,疗效充分肯定。此外还
用于治疗在抗凝疗法中, 因服用抗凝药物如双香豆
素等过量而引起的出血症状[ 3] 。
在国内由于肝炎发病率很高, 因而大量应用在
临床肝脏出血的病人, 随着医生的认同, PCC 的使
用量正在逐年增加。
2 人凝血酶原复合物的分离纯化技术进展
制备 PCC 的原料主要为新鲜冷冻血浆、去冷沉
淀的血浆和低温乙醇法分离出的组分 I 上清或组份
III 沉淀,分离纯化的方法主要为凝胶吸附法和亲和
层析法。PCC 生产工艺生产中的关键是防止凝血
酶的激活,采用去冷沉淀的上清血浆为原料比低温
乙醇法的组分 I上清、组分 III 沉淀更好。原因是乙
醇会使血浆中存在的一些天然抑制剂灭活, 从而使
凝血因子活化。曾经采用磷酸钙、氢氧化铝和硫酸
钡作为吸附剂来吸附 PCC[ 4] ,由于采集血浆过程中
加入的柠檬酸盐会干扰其吸附过程,并且不易将该
法与现有的低温乙醇法相结合, 所以经典的批式吸
附法采用离子交换剂。该分离纯化技术经荷兰红十
字会输血中心 H eysteck 等人 [ 5] 提出, 后经 Br um-
melhuis等人 [ 6] 完善后被用于大规模的制备 PCC,
其工艺为:血浆(去冷沉淀上清)加 DEAE- Sephadex
A50( 1~ 1. 5g 干重/ L 血浆) ,在 10~ 15 e 下搅拌 45
分钟;离心分离出的上清去进一步分离其它血浆蛋
白,分离出的凝胶用含 0. 01M 枸橼酸钠的 0. 2M
NaCl, PH7. 0溶液洗涤三次,洗液废弃,此过程只造
成 FVII大约有 20%的损失; 再用含 0. 015M 枸橼
酸钠的 2. 0M NaCl, PH7. 0 溶液洗脱两次;洗脱液
经 Sephadex G-25凝胶过滤脱盐后加入 0. 3% T N-
BP和 1% T ween-80 经 24~ 26 e 、6h 病毒灭活; 最
后经除菌过滤后, 分装、冻干得成品。通常 PCC 制
备的最后阶段前, 加入肝素或肝素与 AT-III, 以防
止或减少凝血因子活化的危险。详见图 1, 该工艺
的缺点是:由于吸附是在搅拌罐内进行,凝胶的机械
强度不高, 凝胶的破损率大, 生产成本高; PCC经批
式吸附后,洗涤和洗脱需在柱内进行,操作麻烦, 易
产生交叉污染,血浆处理量受到限制。
图 1 BRUMMELHUIS提出的 PCC制备工艺流程
为克服经典批式吸附法的缺点,美国红十字会
Holland实验室的 T har akan 等发展了一种半流动
方法 [ 7] , 用离子交换吸附剂从去冷沉淀血浆中制备
PCC。该方法是用一个带搅拌的圆柱, 无需手工操
作,增加了血浆与凝胶的接触,从而减少了总的操作
过程时间。实验操作步骤为: 将 DEAE- Sephadex
A50用 0. 85M 的 NaCl溶液溶胀,淘洗出细小颗粒,
加入与凝胶等体积量的 0. 075M 的 NaCl溶液并在
18 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
121 e 灭菌 30min;将准备好的 850g 凝胶灌进圆柱,
经 0. 8Lm 的筒式滤器泵入去冷沉淀的血浆 50L; 搅
拌 25m in,以 2L/ min的速度放出血浆; 用 0. 07M 枸
橼酸钠( PH6. 0)悬浮洗涤 60m in, 洗两次; 然后用
0. 2M 枸橼酸钠( pH6. 0)洗脱 PCC; 其余过程同经
典吸附法。批式吸附法与半流动法的比较见表 2,
可见半流动法优于批式吸附法, 并显著地改进了凝
胶吸附 FII和 FIX的能力。
表 2 制备 PCC的批式吸附法与半流动吸附法比较
过程 批吸附 半流动吸附 备注
吸附 血浆与离子交
换剂在罐内混
合
血浆与离子交
换剂在圆柱体
内连续流动混
合
未吸附血浆去除 采用过滤罐或
离心机
包含在吸附过
程中
洗涤 在圆柱内用缓
冲液洗涤
在同一容器内
洗涤
洗脱 在圆柱内用缓
冲液洗脱
在同一容器内
洗脱
过程控制 困难 简单
FII 活性回收(%) 27. 6 60
FIX活性回收( %) 49. 1 68
FX活性回收(%) 51. 2 57. 1
中国医学科学院输血研究所的余蓉等人 [ 8, 9] 采
用 DEAE-Sephadex A50 和 DEAE-Sepharose CL-
6B凝胶,从人血浆中吸附制备经 S/ D灭活的 PCC
制品,其比活性比传统 PCC 提高 1. 5~ 2. 5倍。其
工艺为新鲜冰冻血浆先经 DEAE-Sephadex A50 凝
胶吸附,洗脱液采用 S/ D病毒灭活处理, 再经 DE-
AE-Sephar ose CL-6B 凝胶吸附, 所得 PCC 半成品
经超滤、脱盐后冻干得 PCC成品。该法的特点是增
加了一步层析操作, 以便去除残留的 S/ D,但该法的
操作同经典批式处理法, 我国有厂家采用此工艺。
我国还有部分厂家采用 Cohn 氏低温乙醇法的组份
III 沉淀为原料, 沉淀溶解后用 10%聚乙二醇沉淀
分离出杂蛋白, 离心后的上清加入 S/ D 进行病毒灭
活,接着用 DEAE-cellulose 或 DEAE-sepharose 凝
胶层析,洗脱液经超滤、冻干得成品。
成都生物制品研究所的蔡俊等[ 10] 进行了用柱
层析法制备高纯度 FIX 的工艺初步研究,工艺路线
为人血浆经 DEAE-Sephadex A50 凝胶吸附, 洗脱
液超滤透析后-20 e 深冻,融化后冷冻离心上清液经
DEAE-Sepharo se FF 凝胶吸附,洗脱后用 Heparin-
Sepharose CL-60亲和凝胶吸附, 洗脱所得 FIX 的
比活为 35 ? 2. 0IU / mg, 回收率为 30 ? 4%, FIX被
纯化了 3500倍。
Octaphama 公司的 Lutz 等[ 11] 采用 Fracto gel
EMD Amino 650M 为凝胶的径向柱层析法捕获
FIX,径向柱高 35mm, 上样量为每升凝胶处理 23L
去冷沉淀的血浆。用 20mM, pH7. 0 的柠檬酸钠含
100mM NaCl的缓冲液清洗未被吸附或吸附较弱的
杂蛋白, 再用 20mM, pH7. 0 的柠檬酸钠含 1M
NaCl的缓冲液进行洗脱, 洗脱流速为 100ml/ min,
经检测洗脱液中 FIX的富集因子达 250。比较采用
DEAE Sephadex A50 批式吸附法, 洗脱液中 FIX
的富集因子仅为 50,并且采用径向柱层析可将批式
吸附法的处理时间由 6h 降为 1h。
我国军事医学科学院野战输血研究所的孙涛
等[ 1 2]利用膜径向离子交换层析法分离纯化了 Kis-
ter l and Nitschmann 组分 FIII 中的凝血酶原复合
物( PCC) ,流动相为 pH7. 5 的 T ris-HCl缓冲液,层
析柱为 XK-16 DEAE- Sepharo se FF ( 0. 8 cm id.
x5 cm) 及膜 DEAE 径向层析柱 ( 3. 0cm id. x5. 8
cm)。通过改变不同上样流速及洗脱流速, 研究了
流速对所分离的 PCC 的蛋白质量浓度及凝固活性
的影响,为今后在血浆蛋白分离纯化中进一步推广
使用膜径向层析技术和放大实验提供了依据。
Octapharma 公司的 Buchacher 等 [ 13]应用整体
柱( monolithic column)层析技术纯化 FIX, 初期用
床体积为 0. 34ml的蝶形整体柱( 3 @ 12mm I. D. ) ,
后来放大到床体积为 8. 0ml的环行整体柱( D1. 1 @
D15. 0 @ H45. 0mm) , 分别比较了 QA 型和 DEAE
型聚乙烯凝胶, 其 FIX 的结合能力分别为 1983 ?
120IU/ m l和 1690 ? 64IU/ ml。Gônter 等[ 13]在用环
形整体柱层析法分离纯化 FIX 时, 所用凝胶为 DE-
AE Toyopearl 650M ,先用常规柱层析法建立层析
条件,然后用于环形整体柱层析法。生产试验结果
与常规柱层析法进行了比较,在第一步富集 FIX的
步骤中,其 FIX活性的回收率为优化后的批处理层
析法 89. 1% ,环形整体柱层析法为 67. 5% ,该技术
能否实际用于分离纯化 FIX还有待进一步的试验。
192006年第 2期 邱家山等:人凝血酶原复合物分离纯化工艺的研究进展
生产高纯 FIX 的成熟工艺是利用亲和层析
法[ 15, 16] , 法国 CRT S公司利用亲和层析法生产 FIX
高纯制剂。主要是采用肝素- 琼脂糖 CL-6B 凝胶
亲和层析, 所得 FIX的平均比活达 119 ? 10IU / mg,
平均得率为 320 ? 28IU / L 血浆。也有公司采用鼠
源抗-FIX单克隆抗体纯化 FIX, 其比活可达 204~
273IU / mg。也可用金属鳌合亲和层析纯化 FIX, 通
常将含 FIX的高盐溶液加入 Cu2+ 鳌合琼脂凝胶层
析柱,用低 pH 和低盐的缓冲液洗脱 FX因子, 随后
用含氨基乙酸的缓冲液将 FIX洗脱出来,所得产品
的比活达 160IU/ mg。若增加亲和步骤如: 拟亲和
层析- 亲和层析- 鳌合层析- 羟基磷灰石层析组
合,所得产品的比活可达 240~ 300IU/ mg。
关于 PCC 的质量标准, 我国一直采用 PE 为
PCC综合因子的活性单位,而国外则采用 IU 为各
因子的活性单位。因此, 新颁布的《中国药典》2005
版规定 PCC中 FIX的效价不低于 10IU / ml,且 FIX
的比活性不低于 0. 3IU/ mg 蛋白质。对比《欧洲药
典》2005 版, 所规定 PCC 中 FIX 的效价不低于
20IU/ ml,且 FIX的比活性不低于 0. 6IU/ mg 蛋白
质。可见我国的 PCC质量标准低于欧洲药典,也反
应出我国的 PCC分离纯化工艺有待提高。[ 17, 18]
3 PCC分离纯化的工艺研究方向
由上所述, 现有的 PCC分离纯化方法主要为直
接从血浆中用凝胶吸附法及低温乙醇沉析并经凝胶
吸附法,其中直接从血浆中用凝胶吸附法又分为经
典的批式吸附法和半流动吸附法。由于血浆中抑制
凝血因子活化的一些天然抑制剂会被乙醇所灭活,
从而使凝血因子活化, 所以大多数血液制品生产厂
采用直接从血浆或去冷沉淀的血浆中用凝胶吸附法
制备 PCC。因为 PCC制剂中含有部分杂蛋白,尤其
是被激活的因子 Xa、IXa、VIIa等,临床输注偶可诱
发弥散性血管内凝血( DIC)和血栓并发症。为避免
这一问题,应改进和提高分离纯化工艺,以尽可能在
保留 PCC 制剂原有生物活性的基础上尽量除去可
诱发血栓的杂蛋白。国外的研究重点是耦合多种层
析分离技术,制备各种含单一凝血因子如: IX、VII、
XI等浓缩制剂。我国的血浆蛋白分离纯化主要是
低温乙醇沉淀分离纯化技术, 层析分离纯化技术仅
在部分小制品的分离中采用。PCC 是血浆中的微
量蛋白组份,目前仅有部分厂家采用经典吸附法生
产,存在处理量小,产量低, 因子活性损失大等缺陷。
随着现代生物分离纯化技术的发展, 目前出现
了一些新型单元分离技术[ 19~ 21] , 如亲和膜层析法、
逆胶束法、扩张床吸附技术( Expanded Bed Adsorp-
t ion, 以下简称 EBA)、双水相分配技术等,其中最为
成功的是扩张床吸附技术,并已应用于工业规模的
生产。相信这些新型的生物分离纯化技术应用于人
血浆蛋白的分离纯化是未来发展的方向。EBA 技
术[ 2 2]作为一项新型分离技术,一改早期的分离过程
设计中往往围绕杂质的去除来进行的思路,采用从
组份复杂的料液中直接获得目标产物的设计思路,
朱自强把这种观念上的改变形象地称为由/竭泽而
渔0到/金钩钓鱼0。这种概念上的转变符合现代分
离技术发展的趋势。中科院过程工程研究所的路秀
玲等[ 23]人报道了用扩张床吸附高效纯化牛血红蛋
白的研究, 采用 STREAMLINE SP 吸附剂直接从
牛血红细胞破碎液中纯化血红蛋白。所确定的优化
吸附条件为: 吸附过程选用离子强度为 10mmo l/ L
的磷酸盐缓冲系统, 进料线速度为 198cm/ h, 进料
pH 6. 6, 改变缓冲液pH 为7. 2进行洗脱,操作温度
4 e 。实验结果表明, 动态吸附容量达 70~ 75mg/
m l,只经一步操作产品纯度达电泳纯。丹麦的 Up-
front Chromato graphy A/ S 公司利用该项技术直接
从人血浆中分离纯化出白蛋白、丙种球蛋白、A1-抗
胰蛋白酶、纤维蛋白原和凝血因子。由于 EBA 技术
适合处理组份复杂, 料液粘度大, 洗涤困难的物料,
笔者所在的项目组正致力于利用 EBA 技术分离纯
化 PCC的新型工艺研究。
参 考 文 献
1 卢金汉,章以浩,等.医学生物制品学. 北京:人民出版社, 1995,
823~ 828.
2 王鸿利.血浆和血浆蛋白制品的临床应用.上海:上海科学技术文
献出版社, 2002, 80~ 88.
3 李芳.中华临床与卫生, 2002, 1( 3) : 28~ 31.
4 Burnouf T. J ou rnal of Ch romatography B, 1995, ( 664) : 3~ 13.
5 Curlin g JM . MET HODS of PLASMA PROT EIN FRACT IONA-
TION, New York : ACADEMIC PRESS , 1980, 117~ 126.
6 H eystek J, Brummelhuis HGJ, Kri jnen HW. Vox Sang, 1973,
( 25) : 113~ 121.
(下转第 24页)
20 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
4. 2 改进生产工艺,国内企业有望超过合资厂家
国内环孢菌素 A 生产厂家的环孢菌素发酵单
位和有效组分含量普遍较低 ( 发酵单位约在
1 500Lg / ml左右,有效成分含量在 70%左右) , 而根
据国外有关文献报道, 用 T olypocladium inf latum
发酵生产环孢菌素 A 的发酵单位在 1994年就达到
了 1 500Lg / m l, 近年来也有生产水平达到和超过
3 000Lg / ml,有效成分在 85% 以上的例子。所以,
国内外生产水平还有一定的差距。但是, 环孢菌素
A市场潜力巨大,与环孢菌素 A 相关的研究也是药
物研发领域的热点。通过筛选高产菌株和优化生产
工艺,相信环孢菌素 A 生产水平会不断提高, 同时
也创造巨大的经济和社会效益。
参 考 文 献
1 陈强.中国药学杂志, 1995, 30 ( 11) : 646.
2 A Law en, R T raber, D Geyl. J of Ant ibiot ics, 1989, XLⅡ ( 8 ) :
1283~ 1289.
3 A M argarit ies , PS Chahal . elopBiotechnology L et ters, 1989, Ⅱ
( 11) : 756~ 768
4 K Balakris hnan , A Pandey. Appl M icrobial Biotechnol, 1996, 45:
800~ 803
5 陈代杰.微生物药物学,上海:华东理工大学出版社, 1999, 135~
137.
6 方金瑞.国外医药抗生素分册, 1997, 18( 1) : 47~ 49.
7 吴萍,吴晖,吴飞,等.山东医药工业, 2000, 19( 5) : 13~ 14.
8 方东升,谢阳,陈勇,等.中国抗生素杂志, 2005, 30( 1) : 48~ 51.
9 张茂宏. 中华血液学杂志, 1999, 20( 4) : 208.
10 李学旺, 杨军. 中华内科杂志, 1997, 36 ( 4) : 273.
11 刘辅仁. 实用皮肤科学, 第 2 版. 北京: 人民卫生出版社,
1996. 12.
12 曾庆馀. 中华内科杂志, 1997, 36( 40) : 273.
(上接第 20页)
7 Th arakan JP, Gee DM, C lar k DB. Vox Sang, 1989, ( 57) : 233~
242.
8 余蓉,赵青蓉,等.中国生化药物杂志, 1997, 18( 3) : 112~ 117.
9 余蓉,刘文芳,等.中国输血杂志, 1997, 10( 2) : 63~ 68.
10 蔡俊,张捷,等.药物生物技术, 1999, 6( 22) : 107~ 112.
11 Lu tz H offer, H orst Schwin n, Djuro J os iÕ. Jou rnal of Chroma-
tography A, 1999, ( 844) : 119~ 125.
12 孙涛,刘一平,等.色谱, 2000, 18( 4) : 350~ 361.
13 BranoviK, Bu chacher A, Barutc M , et al. Journal of Chroma-
tography A, 2000, ( 903) : 21~ 34.
14 Gônter I, H orst S , Djuro J. et al. Journal of Ch romatography
A, 2002, ( 972) : 115~ 123.
15 Dju ro J, Lutz H , Andrea B. Journ al of Ch romatography B,
2003, ( 790) : 183~ 189.
16 Burnouf T, Radosevich M, Journal of Bioch emical and biophys-
ical methods, 2001, ( 49) : 575~ 583.
17 沈琦,郝杰,盛凤仙,等.中国生化药物杂志, 2004, 25( 3) : 150~
153.
18 国家药典委员会.中华人民共和国药典 2005年版第三部.北京:
化学工业出版社, 2005, 193~ 196.
19 梅乐和,姚善泾,等.化工学报, 1999, 27( 5) : 38~ 44.
20 陈浩,陈于红,等.中国生物工程杂志, 2002, 22( 5) : 88~ 95.
21 金晓霞,罗坚,等.中国生物工程杂志, 2004, 24( 7) : 74~ 80.
22 刘坐镇,陈士安,等.离子交换与吸附, 1999, 13( 15) : 279~ 285.
23 路秀玲,赵东旭,等.化工学报, 2003, 54( 9) : 1257~ 1264.
24 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期