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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
Xfect介导重组质粒 pEGFP-C2 /LAT-ORF3高效
转染 Vero细胞的方法及其条件的优化
薛礼长 1
杨慧兰 2
( 1华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006; 2中国人民解放军广州军区广州总医院,广州 510010)


摘
要:
旨在用 X fect试剂介导重组质粒 pEGFP-C2 /LAT-ORF3转染 V ero细胞, 以期获得转染效率较高的方法, 并检测
目标片段的表达, 从而为进一步研究 HSV-2 LAT基因及其 ORF3片段的生物学功能奠定基础。用 X fect试剂介导重组质粒
pEGFP-C2 /LAT-ORF3转染 Vero细胞, 48 h后观察荧光表达情况,并计算不同转染方法分别在有无血清及质粒与 Xfect Po lym er
比例不同时的转染效率。用 RT-PCR检测 ORF3片段在 Vero细胞中的表达。结果显示, 采用贴壁转染法, 在有血清及质粒与
X fect Po lym er比例为 5
g /2
L时转染效率较高; RT-PCR可以获得目的条带, 证明 ORF3片段在 Vero细胞中得到表达。本试
验获得的优化条件可以显著提高 Xfec t Po lym er对 Vero细胞的转染效率;以绿色荧光蛋白作为标签鉴定目的基因在细胞中表
达的方法切实可行。
关键词:
Xfec t
转染效率
Vero细胞
绿色荧光蛋白
Establishment and Optim ization of Eukaryotic Expression
P lasm id pEGFP-C2 /LAT-ORF3 Transfected into
Vero Cell by Xfect asM ediation
Xue L izhang
1
YangHu ilan2
(
1
School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006;
2
Guangzhou GeneralH osp ital of GuangzhouM ilitary Command, Guangzhou 510010)


Abstrac:t
In order to obta in h ighly transfection e ffic iency and detect the expression o f targ et fragm en t, the recomb inan t plasm id
pEGFP-C2 /LAT-ORF3 was transfected into Vero ce lls by X fect as m ed ia tion. The recom binant plasm id pEGFP-C2 /LAT-ORF3 w as
transfected intoV ero ce lls m ediated by X fect. A fter 48 hours observ ing expression o f the recomb inant plasm id in the ce lls by fluores-
cence m icroscope, the transfec tion efficiencyw as ca lculated by using transfection m ethods w ith yes-no blood serum and different propo r-
tions o f p lasm id and X fect Po lyme r. Then the expression of ORF3 w as de tected by RT-PCR. Resu lts show ed that the h ighest transfection
efficiency w as obta ined when the system had blood serum and the proportion o f p lasm id and X fec t Po lym erw as 5
g /2
L by using ad-
herent transfection. The target band w as obta ined by RT-PCR, wh ich ind icated the expression o f ORF3 in V ero ce lls. It proved that the
optim a l cond ition ob tained by the exper iment cou ld obv iously increase the transfec tion effic iency. It w as feasib le to use green fluorescent
prote in as the m ark to identify the expression o f ta rget DNA in ce l.l
Key words:
X fect
T ransfection effic iency
Vero ce lls
G reen fluorescent prote in
收稿日期: 2010-06-30
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30972666) ,全军医学科学技术研究
十一五
计划资助项目 ( 06J008)
作者简介:薛礼长,男,在读硕士,研究方向:分子生物学; E-m ai:l xu e-l-i zh ang@ 163. com
通讯作者:杨慧兰,教授, E-m ai:l hu ilany@ m edm ai.l com
单纯疱疹病毒
型 ( herpes simplex v irus
,
HSV-2)是一种常见的人类病原体, 主要引起生殖
器疱疹,目前已知的宿主只有人类。H SV-2感染
在世界范围内较普遍, 不但能引起原发性感染, 还
可造成复发性感染和潜伏感染 [ 1]。HSV-2在人的
骶尾神经节内长期潜伏时会造成潜伏感染, 并可
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
伴随各种非特异性刺激活化, 从而导致相关临床
症状的复发, 难以根治。迄今尚不明确 HSV-2的
潜伏复发机制, 这给临床上彻底清除 HSV-2造成
了巨大困难。潜伏相关转录体 ( latency asso ciated
transcrip,t LAT )是 H SV在潜伏感染期间唯一大量
表达并可被检测到的基因组转录产物 [ 2] , 被认为在
HSV潜伏的建立、维持和激活过程中起重要作用 [ 3- 6]。
HSV-1 LAT的开放阅读框 ( open reading frames, ORFs)
可能对 HSV-1在神经节中建立潜伏起有效作用 [ 5, 7] ,但
与之同源性很高的 HSV-2 LAT ORFs则很少被研
究。已有研究表明, HSV-2 LAT含有 3个 ORF[ 8]。
本试验选用已构建的连有 ORF3片段的重组质
粒 pEGFP-C2 /LAT-ORF3为研究对象, 优化其高效
转染 Vero细胞的方法,并检验其在非洲绿猴肾细胞
(V ero)中的表达, 为进一步研究 LAT基因及 ORF3
在 HSV-2潜伏感染中的作用机制奠定基础。本试
验选用的 Vero细胞是一种连续传代的灵长类细胞,
与人类细胞相似, 可以用作研究 ORF3作用机制的
细胞模型。试验中采用最新问世的新型可生物降解
的纳米颗粒 Xfect转染试剂, 该试剂毒性较低且能
让质粒 DNA高效转染进哺乳动物细胞。
1
材料和方法
1
1
材料
1
1
1
试验材料与主要试剂
V ero细胞由本实验
室保存; 重组质粒 pEGFP-C2 /LAT-ORF3由笔者构
建; RPM I-1640细胞培养基,胎牛血清购自 H yC lone;
DL2000 DNA M arker, dNTP 购自 TaK aRa; 高保真
DNA聚合酶 PLAT INUM
PFX DNA POLYMERASE、
Trizo l、无内毒素质粒中提试剂盒购自 Inv itrogen; 胰
酶购自 G iboc; 转染试剂盒 X fectTM购自 C lontech; 逆
转录试剂盒购自 Promega; 卡那霉素购自 MD; 链霉
素、青霉素由广州军区广州总医院医学实验科提供;
其他试剂均为国产分析纯。
1
1
2
仪器
紫外分光光度计: BECKMAN DU

Series 500;超净工作台:苏州净化设备有限公司;倒
置荧光显微镜: O lympus
70; CO 2恒温培养箱:
N aPCO公司。
1
2
V ero细胞的培养
用含 10%胎牛血清的 RPM I-1640培养基在 37
,
5% CO2,一定湿度的条件下常规培养 Vero细胞, 2- 3
d传代 1次。
1
3
质粒的制备
将成功转化了重组质粒 pEGFP-C2 /LAT-ORF3
或空白载体 pEGFP-C2的大肠杆菌 TOP10菌液分别
用 LB液体培养基 (卡那霉素终浓度 60
g /mL )扩
大培养。重组质粒和空白载体分别使用 Inv itrogen
无内毒素质粒中提试剂盒提取。提取的质粒 A 260 /
A280比值在 1
8- 2
0之间, 紫外分光光度计测定空
白载体和重组质粒的浓度分别是 0
659
g /
L和
0
597
g /
L。
1
4
细胞转染
1
4
1
贴壁细胞转染法
胰蛋白酶液 ( 0
25%胰
蛋白酶 + 0
02% EDTA )消化 Vero细胞, 按常规方
法制备细胞悬液, 并向 6孔细胞培养板每孔中接
种 8
0
104个细胞, 37
, 5% CO 2, 一定湿度下培
养。6孔板中的细胞汇合度达到 80%左右时, 转
染重组质粒。将 6孔板中的其中 3个孔更换为无
血清培养基, 另 3个孔更换为含 10%胎牛血清的
培养基, 每孔均为 2 mL。用 X fect Po lymer转染细
胞,参照 X fectTM说明书制备重组质粒与 X fect Po ly-
mer形成的纳米状颗粒, 其中质粒与 X fect Polym er
用量比分别为 5
g /1
L, 5
g /2
L, 5
g /3
L。
将各组制备好的 200
L纳米状颗粒溶液加入到
对应孔板的细胞中, 37
, 5% CO2, 一定湿度下温
育。温育 4 h后, 将 6孔板中的培养基更换为 2 mL
新鲜的含 10%胎牛血清的培养基 (双抗溶液终浓
度为 100 U /mL) , 37
, 5% CO 2, 一定湿度下培养
细胞。
1
4
2
悬浮细胞转染法
将胰蛋白酶液消化下来
的细胞均等分配到 6支 15 mL离心管中并离心, 弃
上清。向其中的 3支加 2 mL含 10%胎牛血清的细
胞培养基, 另外 3支加 2 mL不含血清的细胞培养
基,反复吹打重悬细胞。纳米状溶液的制备方法与
贴壁转染法相同。分别将各组 200
L纳米状颗粒
溶液加入到对应的离心管细胞中, 37
, 5% CO2, 一
定湿度下温育。温育 4 h后, 将各组离心管中的细
胞悬液 1 000 r/m in离心 5m in,弃上清, 分别加 2mL
含 10%胎牛血清的细胞培养基, 充分吹打, 重悬细
胞沉淀。将离心管中的细胞转移到对应的孔板中,
并向 6孔板中加入双抗溶液 (终浓度为 100 U /
198
2011年第 1期




薛礼长等: X fect介导重组质粒 pEGFP-C2/LAT-ORF3高效转染 Vero细胞的方法及其条件的优化
mL), 37
, 5% CO2,一定湿度下培养细胞。
1
4
3
空白载体转染 V ero细胞
按照转染试剂盒
Xfect
TM标准操作步骤,用贴壁转染法转染空白载体
pEGFP-C2作为对照组。
1
5
融合蛋白表达的检测及转染效率的评价
转染 48 h后倒置荧光显微镜下计算转染效率,
在 100倍视野下随机选取 5个视野并计录下每个视
野中表达绿色荧光蛋白的细胞数和总细胞数。两种
转染法的转染方式如图 1。转染效率 (% ) = (表达
绿色荧光蛋白的细胞数 /总细胞数 )
100%。所有
试验数据取其平均值 ( x )
标准差 ( s)。采用 Excel
完成数据处理。
A
有血清; B.无血清; 1 - 3. 质粒与 Xfect Po lym er比分
别为 5
g/1
L, 5
g /2
L, 5
g /3
L
图 1
转染方式
1
6
RT-PCR检测重组质粒在 V ero细胞中的表达
转染 48 h后, 分别收集 3孔转染重组质粒或
空白载体的 V ero细胞, 使用 Tr izo l试剂分别提取
各组细胞总 RNA,并进行逆转录, 具体操作步骤参
照试剂说明书进行。以获得的 cDNA为模板,分别
扩增 ORF3片段和内参
-actin基因, RT-PCR检测
细胞中 ORF3在 mRNA水平上的表达。ORF3片
段上游引物为 5
-CCGGAATTCATGCTGGTGTGT-
GTTGCTGTTCGG-3
, 下游引物为 5
-CGGGGTAC-
CACAAGACGGTCACGGGGGACT GCCT-3
; 内参
-
actin上游引物为 5
-CGTACCACTGGCATCGTGAT-
3
, 下游引物为 5
-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-
3
,引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
ORF3和
-actin的 PCR反应体系如下: 10
pfx扩增
缓冲液 2
5
L, 10 mmol /L dNTP混合液 0
5
L, 50
mmo l/L M gSO4 0
5
L, 上游引物 ( 10
mol/L ) 0
5

L, 下游引物 ( 10
mol/L ) 0
5
L, cDNA 模板
( ORF3或
-actin) 1
L, pfx DNA聚合酶 0
3
L,
10
PCRX加强缓冲液 5
L, 补灭菌蒸馏水至 25

L,瞬时离心混匀。 PCR反应程序: 94
5 m in;
94
30 s, 55
30 s, 68
1 m in, 40个循环; 72

10 m in, 4
保存。 PCR产物经 0
8% 琼脂糖凝胶
电泳检测。
2
结果与分析
2
1
转染方法对转染效率的影响
悬浮转染法的转染效率显著低于贴壁转染法。
血清含量对悬浮转染法影响很大 (表 1,图 2), 但对
贴壁转染法无显著差异 (表 2,图 3)。
2
2
质粒与 X fect Po lymer比例对转染效率的影响
质粒和 X fect Po lymer比例对转染效率的影响较
大, 在悬浮转染法中, 转染效率从高到低分别是
5
g /3
L、5
g /2
L和 5
g /1
L(表 1); 在贴壁
转染法中,转染效率从高到低分别是 5
g /2
L、5

g /3
L和 5
g /1
L(表 2)。
表 1
血清含量及质粒与 Xfect Polym er比例对悬浮
转染法转染效率的影响 ( 48 h )
血清含量
(% )
质粒 /X fect Polym er(
g/
L)
5 /1 5 /2 5 /3
10 4
613
0
782 6
618
0
653 13
882
1
047
0 2
652
0
405 3
800
0
397 5
363
0
541
2
3
RT-PCR结果
转染空白载体的 Vero细胞与转染重组质粒的
V ero细胞的 RT-PCR均能检测到 452 bp的
-act in
内参条带; 转染重组质粒的 V ero细胞 RT-PCR能
检测到约 560 bp左右的条带, 与 ORF3片段大小
(加酶切位点和保护碱基共 559 bp)一致, 转染空
白载体的 V ero细胞 RT-PCR则检测不到该片段
(图 4)。
3
讨论
本试验从转染方法、转染时有无血清及质粒和
X fect Po lymer的比例等方面探讨重组质粒 pEGFP-
C2 /LAT-ORF3转染 V ero细胞的效率, 并通过 RT-
PCR的方法鉴定了 ORF3在 V ero细胞中的表达, 得
到了高效的该重组质粒转染 V ero细胞的方法,且验
证了用绿色荧光蛋白标签检验目的片段表达的可行
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
性。通过本试验确定的利用 X fect转染试剂转染
V ero细胞的最佳转染方法及其条件,为进一步研究
LAT ORF3在 Vero细胞中表达及其所起的生物学功
能提供技术手段。试验中的重组质粒 pEGFP-C2/
LAT-ORF3上连有可以表达绿色荧光蛋白的报告基
因 EGFP,该基因可以在真核细胞中表达。绿色荧
光蛋白检测方便、荧光稳定、对宿主细胞无任何毒害
且不影响目的蛋白的生物活性 [ 9]。通过在荧光倒
置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达量来计算转染
效率也是切实可行的 [ 10, 11]。
A.有血清; B.无血清; 1 - 3.质粒与 X fect Po lym er比分别为 5
g /1
L, 5
g/2
L, 5
g /3
L
图 2
悬浮转染法转染质粒 48 h后 Vero细胞中绿色荧光蛋白的表达情况 ( 100
)
表 2
血清含量及质粒与 X fec t Po lym er比例对贴壁转染法转染效率的影响 ( 48 h )
血清含量 (% ) 质粒 /X fect Polym er(
g/
L)
5 /1 5 /2 5 /3
10 29
401
1
475 58
721
1
807 43
698
1
522
0 28
380
1
845 59
167
3
501 44
381
2
214
A.有血清; B.无血清; 1 - 3.质粒与 X fect Po lym er比分别为 5
g /1
L, 5
g/2
L, 5
g /3
L
图 3
贴壁转染法转染质粒 48 h后 Vero细胞中绿色荧光蛋白的表达情况 ( 100
)
本试验与已有报道显示的在其他细胞中悬浮转
染法转染效率显著高于贴壁转染法结论不同, 可能
由选用的细胞系、转染介质等造成 [ 12 ] , 但对质粒转
染 V ero细胞来说,与已有的研究相比较,该方法及
条件可以获得更高的转染效率 [ 13, 14 ]。本试验的研
究结论显示,在悬浮转染法转染的过程中需要用胰
蛋白酶液消化细胞,且反复吹打重悬细胞,这大大影
响了 V ero细胞的状态,若此时转染过程没有血清存
在, 会进一步影响细胞状态, 从而导致部分细胞在 6
孔板中不能贴壁,造成转染效率不高。试验结果还
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薛礼长等: X fect介导重组质粒 pEGFP-C2/LAT-ORF3高效转染 Vero细胞的方法及其条件的优化
显示,质粒和 X fect Po lymer比例对转染效率的影响
较大, 原因可能是纳米状颗粒对细胞有一定的毒性,
浓度过高对细胞伤害严重而影响转染效率, 但浓度
过低时质粒转染进细胞的几率降低, 同样影响效率。
M
M arker DL2000; 1. 转染重组质粒 V ero细胞组的
ORF3片段; 2.转染重组质粒 Vero细胞组的
-act in内参
条带; 3.转染空白载体 V ero细胞组无目的片段; 4. 转染
空白载体 Vero细胞组的
-act in内参条带
图 4
转染重组质粒或空白载体的 V ero
细胞 RT-PCR产物鉴定
国内尚未报道过 Xfect转染试剂对 Vero细胞转
染效率的研究。本试验优化的重组质粒 pEGFP-C2/
LAT-ORF3在 X fect转染试剂介导下转染 Vero细胞的
方法和条件分别是贴壁转染法,有血清或无血清, 质
粒与 X fect Po lymer比例为 5
g /2
L。本试验优化的
转染方法及其条件为进一步筛选稳定表达 HSV-2
LAT ORF3的 Vero细胞,及下一步研究 ORF3的生物
学功能打下基础。
参 考 文 献
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(责任编辑
李楠 )
201