全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
阳离子脂质体 Lipofectam ine2000对
PC12细胞转染效率的研究
杨云廷 付崇罗
(聊城大学生命科学学院神经生物学研究室,聊城 252059 )
摘 要: 通过改变转染试剂及 DNA用量和转染时间等影响转染效率的重要因素来实现阳离子脂质体 lipofectam ineTM
2000( lipo2000)对 PC12细胞的高效转染。结果表明, lipo2000转染 PC12细胞的最佳转染条件: lipo2000用量为 5 L, DNA 2
g, 转染时间为 6 h,这种条件下的 PC12细胞转染率高达 40% , 且未影响细胞的正常分泌 ,这为应用 PC12细胞进行神经生物
学研究提供了基础资料。
关键词: PC12细胞 pEGFP-C1 L ipofectam ine2000 转染效率 阳离子脂质体
The Study of the Transfection Efficiency of PC12
Cells Transfeced by Cationic Liposomes L ipofectam ine2000
YangYunt ing Fu Chongluo
(N euroscienceB iology Laboratory, College of Life Sciences, L iaocheng University, Liaocheng 252059)
Abstrac:t Fo r the effic ient transfec tion o f PC12 ce lls, lipo fec tam ineTM 2000( lipo2000) w as emp loyed, and the am ount of DNA, ra-
tio o f NDA- transfection reagents and transfec tion tim e was im proved to eva luate the transfection e fficiency. The resu lts ind ica ted that the
optim a l transfection condition of PC12 cells by lipo2000 was: 5 L lipo2000 p lus 2g DNA w ith the transfection tim e o f 6 h, and the
transfected PC12 cells cou ld secrete norm a lly. Our study prov ides the basic da ta for the application of PC12 ce lls in neuroscience study.
Key words: PC12 ce lls pEGFP-C1 L ipofectam ine2000 T ransfection e ffic iency Cation ic liposomes
收稿日期: 2010-11-08
基金项目:山东省中青年科学家科研奖励基金项目 ( 2006BS03057 )
作者简介:杨云廷,男,硕士研究生,研究方向:神经生物学; E-m ai:l yangyun ting860225@ 163. com
通讯作者:付崇罗,男,教授, E-m ai:l fuchonglu o@ lcu. edu. cn
PC12细胞是从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤上
分离来的细胞系,可广泛用于神经元细胞的分化及
其在细胞胞吐分泌和静脉曲张等特殊情况下分泌中
作用的研究 [ 1]。自 G reene和 T isch ler于 1976年发
现 PC12细胞系以来, 该细胞系就被广泛用于研究
胞吐调节、分泌性器官的起源、分泌蛋白的运输、儿
茶酚胺类的新陈代谢和神经营养因子的作用等 [ 2 ]。
PC12细胞内含有大量分泌性颗粒 (也称大而致密的
核心囊泡 ) , 这些颗粒可以储存各种小分子、合成
酶、神经肽及激素类物质等 [ 2 ]。随着细胞转染技术
的广泛应用, PC12细胞越来越广泛地被用于神经生
物学领域的研究, 然而, 如何提高 PC12细胞的转染
效率一直都是广大科研工作者关心的重要问题。
细胞转染技术是研究特定的基因表达调控及基
因治疗的重要技术之一, 选择合适的细胞转染方法
对提高细胞转染率至关重要 [ 3]。目前常用的细胞
转染技术主要有物理介导法、生物介导法和化学介
导法 3种。物理介导方法中最常用的是电穿孔法,
该方法适用于所有的细胞,但需要特殊的电转仪器,
且细胞致死率很高, DNA和细胞用量很大, 不同的
细胞转染所需要的电转参数也不同 [ 3]。生物介导
方法中最常用的是病毒感染, 这种方法适用于包括
神经元细胞在内的大多数细胞类型, 且转染率一般
都很高,但该方法对操作的安全性要求较高,且质粒
构建及病毒的包装、收集和浓缩等过程比较繁琐。
化学介导法中最常用的是脂质体转染法,常用的脂
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质体转染试剂主要有 4种: 带负电荷脂质体、免疫脂
质体、配体脂质体和阳离子脂质体。其中阳离子脂
质体是现今研究最为详尽的一种转染脂质体 [ 4 ] ,阳
离子脂质体属于无反应活性的立体稳定脂质体,它
被免疫系统识别和摄取的几率低, DNA /脂质体复合
物的形成不受 DNA大小的限制, 对高电荷的 DNA
有较高的转运能力, 还能转运 RNA、核糖体及其他
大电荷分子和大分子物质进入细胞等特点, 而且转
染效率也较高,因此被广泛应用于各种原代细胞及
细胞系的转染 [ 5, 6 ]。然而, 转染效率的影响因素非
常多, 不同细胞类型或不同细胞系所需要考虑的因
素也不一样,且不同培养条件下的转染方法也有一
定的差异。为了更有效地研究神经细胞分化过程中
的调控基因及神经信号的传导机制及其调控, 尽可
能提高 PC12细胞的转染效率就显得非常必要。为
此,以现有转染试剂中对神经元细胞最有效的转染
试剂 lipo fectam ine2000为媒介, 通过调整不同的转
染参数来优化 lipo2000对 PC12细胞的转染方法,以
期待获得相对较高的转染效率。
1 材料与方法
11 材料
Opt-iM EM、FBS( Fetal bov ine serum )和 HS(Horse
Serum )购自 G ibco公司 (USA),阳离子转染试剂 lipo-
fectam ine2000和 F12-K培养基购于 Inv itrogen公司
(USA) , pEGFP-C1购自 C lonetech公司 (USA)。
12 方法
121 PC12细胞培养 PC12细胞为本实验室培
养和保种,接种于 125 cm2培养瓶中培养,培养环境
为 37 , 体积分数 5%的 CO2培养箱。细胞培养基
为加有 125% HS和 25% FBS的 F12-K培养基,
每 2- 3 d换液 1次。细胞密度至 80% - 90%时进
行传代,基本步骤为弃除原有培养基, 加入 3 mL新
鲜培养基,用玻璃吸管轻轻吹打将细胞从瓶底吹散
下来,再将细胞悬液移至 15 mL离心管中, 800 r/m in
离心 3 m in,吸去上清,加入 1mL新鲜培养基后吹散
沉淀,由于 PC12细胞容易聚团生长,所以吹打时尽量
将细胞吹散。细胞传代一般按照 16的比例传代,加
入适量培养基后轻轻前后左右晃动使细胞均匀分布
于整个瓶底,瓶盖半松放于培养箱中培养。
122 细胞转染 将 PC12细胞以 12 105每孔
接种于 6孔板中,加入 2 mL培养基, 置于 37 , 体
积分数 5%的 CO 2培养箱中培养, 细胞密度达 70%
时用于转染。转染前 4 h将细胞培养基换成不含血
清的新鲜培养基。转染的基本步骤: 先将 lipo2000
转染试剂加入 200 L的 Opt-iM EM中混匀室温静
置 5m in,同时将适量质粒 pEGFP-C1( 1- 5 g)加入
200 L Opt-iMEM中混匀, 孵育 5m in后将两溶液混
匀, 室温静置 25 m in, 将 DNA-lipo复合体逐滴均匀
地加入细胞培养液中, 3- 24 h后用新鲜培养基, 终
止转染。转染 24 h后在 IX-70倒置荧光显微镜下进
行观察和分析。
123 转染效率及统计 细胞转染 24 h后, 在倒
置荧光显微镜 ( O lympus 1 70 )物镜 10 和目镜
4 放大倍数下拍照, 每个视野分别在可见光和
488 nm激发光激发下拍照,绿色荧光蛋白阳性的细
胞占细胞总数的百分比即为转染效率 [ 7 ]。图像处
理工具为 Image J,每个试验条件进行 2次独立的试
验,每次试验随机选取 4个视野用于转染率的统计,
以平均值 均方差来表示 (x s)。
124 PC12细胞分泌的检测 利用碳纤维电极
( carbon fiber electrode, CFE )检测 PC12细胞分泌
物。基本原理是, 在电压钳模式下给 CFE上施加
780 mV的电压,当给细胞去极化刺激 (常用的刺激
模式是给细胞以 70mmol /L KC l溶液引起细胞去极
化 )时,细胞膜上的钙通道会打开, 外液中的钙离子
内流进入细胞内可触发囊泡的分泌, PC12细胞囊泡
的分泌物主要是可被氧化的单胺类物质,其分泌出
来的可氧化物质在接触到 CFE表面时被氧化,进而
以电流的形式表现出来 [ 8]。
2 结果与分析
21 PC12细胞转染 EGFP
绿色荧光蛋白 ( GFP)来源于水母, 它在紫外或
蓝光激发下发射出绿色荧光 [ 9]。首先按 lipo2000建
议的试验条件进行转染, 即 lipo2000为 5 L, pEG-
FP-C1为 3 g, 转染后 3 h更换为新的培养基。转
染 24 h后,在倒置荧光显微镜下以目镜 4倍 物镜
10倍的放大倍数在 488 nmo l/L激发光下观察,可见
转染上的细胞发出绿色荧光 (图 1 ), 表明 lipo2000
可用于 PC12细胞的转染, 且在当前转染条件下的
转染效率相对较高,同时细胞状态保持良好。
232
2011年第 5期 杨云廷等:阳离子脂质体 L ipofectam ine2000对 PC12细胞转染效率的研究
图 1 阳离子脂质体转染试剂 lipofec tam ine 2000诱导 PC12细胞转染 pEGFP-C1质粒
22 L ipo fectam ine 2000用量
为了获得最佳的转染条件, 首先探索了转染试
剂 lipo2000的用量对转染效率的影响。结果如图 2
所示, 当质粒 pEGFP-C1的用量为 3 g,转染时间为
3 h时, 转染效率与 lipo2000的用量呈幂次相关,其
相关系数 R 2为 0867。当转染试剂用量相对较低
时,转染效率与 lipo2000用量呈正相关, 但随着 l-i
po2000用量的增加, lipo-DNA复合体的氮磷比逐渐
失衡, 且其毒副作用逐渐明显, 导致转染效率逐步降
低,且绿色荧光蛋白阳性细胞的致死率增加,本研究
结果表明, 对于 2mL培养体系的细胞转染, lipo2000
的用量应控制在 5 L以内。
图 2 转染试剂 lipofectam ine 2000用量对
PC12细胞转染效率的影响
23 转染时间
转染时间也是影响细胞转染效率的重要因素,
同时也对转染后细胞状态有影响。本组试验设定了
不同的换液时间 ( 3、6、12和 24 h)来优化最佳的 l-i
po2000转染时间。结果 (图 3)表明, 在转染试剂 l-i
po2000用量和质粒 pEGFP-C1用量相同的条件下,
转染时间为 6 h时 PC12细胞的转染效率最高, 约为
30%。在未达到最佳转染时间前,转染效率随转染
时间的延长有显著的增加, 但在超过最佳转染时间
后, 转染效率则会缓慢降低, 这可能是因为转染试剂
的毒副作用导致了受体细胞死亡率的增加。
图 3 转染时间对 PC12细胞转染效率的影响
24 DNA用量
在确定了转染试剂用量和转染后换液时间两个
因素的最佳条件,对 DNA用量这一因素进行了最优
化筛选,本组试验设定了 4个 DNA用量, 即 1、2、3
和 5 g。结果 (图 4)表明, DNA量为 2 g时即可达
到最高的转染效率, 约为 35%。而当 DNA用量增
加至 3 g时,其转染效率反而有所降低,这可能是
因为 DNA自身的毒副作用导致了受体细胞死亡率
的增加, 同时过多的 DNA用量会导致 DNA-脂质体
复合体氮磷比失衡,也可能是转染效率降低的重要
影响因素。在本试验条件下, 2 g DNA和 5 L的
转染试剂,即 DNA和转染试剂比为 125时可得到
最高的转染效率, 暗示这种条件既可有效提高细胞
的转染效率又可尽量避免 DNA及转染试剂的毒副
作用,这也为其他转染试剂或其它类型细胞转染条
件的优化提供了依据和参考。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
图 4 不同 pEGFP-C1用量对 PC12细胞转染效率的影响
25 转染后 PC12细胞状态的检测
为了进一步研究 lipo2000转染方法对细胞状态
是否有影响, 用 CFE记录方法分别记录未转染的
PC12细胞和转染后的 PC12细胞分泌情况, 结果
(图 5)表明,转染后的细胞状态与未转染的对照组
细胞状态没有差异, 说明阳离子脂质体 lipo2000转
染方法对转染后细胞状态没有影响。
A.未转染的 PC12细胞在 70 mm ol /L KC l去极化引起分
泌的 CFE记录结果; B.用 lipo2000转染后的 PC12细胞
在相同刺激模式下分泌的记录结果
图 5 PC12细胞分泌的检测
3 讨论
PC12细胞株来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,是
研究神经内分泌、神经药理、神经毒理和神经发育
等常用的试验模型 [ 10]。而细胞转染技术在生物学
研究中的应用越来越广泛, PC12细胞作为神经生物
研究的模式细胞之一, 它的转染效率一直是困扰科
学研究的重大重要问题。本研究通过最优化筛选影
响转染效率的 3个最主要因素: 转染试剂用量、DNA
用量和转染后换液时间。研究表明, lipo fectam ine
2000对 PC12细胞的最佳转染条件为转染试剂 lipo-
fectam ine 2000用量为 5 L, 质粒 pEGFP-C1用量为
2 g,转染 6 h后换液, 这种条件下的 PC12细胞转
染效率最高, 可达 40%, 且该转染条件并未影响
GFP阳性细胞的正常分泌。
阳离子脂质体转染方法的原理是阳离子脂质体
表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用,将
DNA分子包裹入内,形成 DNA-脂复合体, 也能被表
面带负电荷的细胞膜吸附, 再通过融合或细胞内吞
作用进入溶酶体。内吞后的 DNA-脂复合体在细胞
内形成的包涵体,在 DOPE作用下, 细胞膜上的阴离
子脂质因膜的不稳定而失去原有的平衡扩散进入复
合体,与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对,使
原来与脂质体结合的 DNA游离出来, 进入细胞质,
进而通过核孔进入细胞核, 最终进行转录并表达。
辅助脂质体 DOPE含乙酰胺头部,在溶液中形成六
角形引起脂质高度弯曲,对脂双层具有去稳定作用,
可使细胞膜和包涵体膜去稳定,在 DNA-脂复合体的
内吞和 DNA从包涵体的释放两个关键步骤中起作
用。像其他转染方法一样, 这种方法的转染效率也
受到多种因素的影响, 如转染试剂与 DNA量的比
例、细胞密度、转染后换液时间以及表达时间等。本
研究结果表明,转染效率与转染试剂或 DNA用量并
不是线性正相关的关系,转染试剂与 DNA用量的比
例对细胞的转染效率显得更为重要。在本试验条件
下, 当 DNA量与转染试剂量比例为 125时, PC12
细胞的转染效率达到最高, 可达 40%。此外, 转染
时间也是影响转染效率的重要因素,转染后,因为转
染试剂本身的毒性会对细胞的状态有影响, 所以
一般在转染后需要用新的培养基替换原来的培养
基以减少其毒副作用。换液时间过早, DNA-脂复
合体因不能有效被内吞至胞体内而导致转染率相
对较低, 而换液时间过晚则会因为转染试剂的毒
副作用影响细胞状态, 甚至会导致受体细胞大量
死亡, 转染效率也会降低, 且细胞活性普遍降低。
在本试验条件下, 当转染后 6 h换液可获得相对较
高的转染效率。
本试验经过最优化选择,在目前的转染条件下,
利用阳离子脂质体 lipo2000转染 PC12细胞的转染
效率最高可达 40%,能够满足当前大部分的试验需
求, 这为 PC12细胞作为模式细胞在神经生物学研
究中的作用提供了更好的支持。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠 )
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