全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
24种食蟹猴MHC B座位等位
基因序列特征与进化分析
郑宇凌 蒋琼橙 卓敏 王小宁
(华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006 )
摘 要: 食蟹猴 (Macaca fascicu laris, Mafa )是重要的医学研究动物模型, 被大量用于药物及移植医学试验。为探讨本地
食蟹猴 MHC I类基因 B座位的多态性, 本研究经大量 PCR, 克隆与测序, 从 10只食蟹猴中分离到 24种 M afaB等位基因的
全长序列, 其中 4种为新序列,已递交 NCB I数据库, 并给予系统命名。在每个个体中均获得 6至 11条 M afaB等位基因,显示
食蟹猴的 MHCB座位出现扩增, 食蟹猴 MHCB为重复基因座的特征与恒河猴类似。氨基酸序列比对分析得出, MHCB基因
在抗原肽结合区高度多态。
关键词: 食蟹猴 主要组织相容性复合物 M afaB基因
Identification of 24 MHC B A llies in Local Cynomolgus
M acaque and Ananlysis of Anagenesis
Zheng Yuling Jiang Q iongcheng ZhuoM in W ang X iaon ing
(Sou th China University of T echnology B ioscience and B io technology D epar tment, Guangzhou 510006)
Abstrac:t cynom o lgusm acaque is an im po rtant biom edical research an im a lmode,l and lo ca l cynom o lgusm acaque has been w ide
ly utilized in pharm aceutical and surgery studies. In o rde r to explore the po lymo rph ism ofMH C I gene B lo cus in local cynom o lgusm a
caque, w e obta ined 24MHCB alleles in 10 cynom o lgusm acaque periphera l b lood, mo reover, 4MH CB a lle les w ere new ly discovered in
research, wh ich have been send to NCBI website and been nam ed by Imm uno Polym orph ism DatabaseNonH um an Pr im ate ( NH P ) Se
quences. it was probable thatM afaB genew as duplicated, because each samp le cynomo lgus conta ined average 611 a lleles, wh ich like
theMamuB gene in m acaca m amu la tta.
Key words: Macaca fasciculari (MAFA ) M ajor histo compatib ility com plex (MHC ) B locus
收稿日期: 20100208
基金项目:国家 973!重点基础研究规划项目子项目 ( 2006CB701500 ) ,广东省自然科学基金博士启动基金项目 ( 07300826 )
作者简介:郑宇凌,女,在读硕士研究生,主要从事基因多态性及基因免疫方面研究; Em ai:l yu ling_zh eng@ 163 com
通讯作者:王小宁,男,教授,博士生导师,主要从事免疫识别的基础及应用研究; Em ai:l xnw ang2008@ hotm ail com
非人灵长类动物已经被广泛应用于药效评估和
疾病发病机理的研究。经过研究人员多年探索,恒
河猴已成为一种比较理想的实验动物模型。但随着
1978年印度禁止出口恒河猴法规的出台, 以及器官
移植、病理等科学研究所需恒河猴数量的与日俱增,
科研人员开始转向其它非人灵长类动物的研究。
MHC分子对 T细胞的分化发育起着重要作用, 早期
T细胞必须与 MHC∀抗原接触才能分化成 CD8+ T
细胞 [ 1]。食蟹猴 MHCI类基因与许多疾病有密切
的联系,例如感染性疾病、癌症以及代谢紊乱症,但
是食蟹猴的 MHCI类基因的研究有待深入。目前,
有研究推断食蟹猴 MafaB* 7601及 MafaB* 8101
等位基因与猴免疫缺陷病毒 ( SIV )感染特异性密切
相关 [ 2]。根据基因的多态性、在细胞表面表达程度
及序列表现,食蟹猴主要的 MHCI类基因中只存在
类似于人的 MHCA、B、E、F、G基因 [ 3 ]。本试验
采用的本地食蟹猴被大量用于医学研究,但基因背
景不清晰,潜在的医学价值难以估计。由于食蟹猴
MHCB等位基因具有明显的区域群体 ( reg iona l
group)特性,因此对于本地食蟹猴 MHCB基因多态
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
性的研究十分重要。
1 材料与方法
11 材料
111 试验动物 食蟹猴由华南灵长类动物研究
与开发中心提供, 随机选取普通级健康食蟹猴 10
只,编号: B1B10; 分别采血 1 mL, EDTA抗凝。
112 主要仪器 B io- Rad DNA eng ine Terand,
B ioRad电泳及凝胶成像系统
113 主要试剂 TaKaLa LA Taq, DNA ge l purifi
cation试剂盒 ( Q iaGen) , PMD20 T vector( TaKaLa),
TOP 10感受态细胞 (实验室自备 )
114 引物 见表 1。
表 1 引物名称及序列
引物名称 引物序列 ( 5#- 3#) 退火温度 ( ∃ ) 片段长度 ( bp)
扩增引物
MBF TCCTGAGACGCCGAGATG 59 约 2 800
MBR TAGACCCCAAGAATCTCACCT
5#MHC_UTR 1 GGACTCAGAATCTCCCCAGACGCCGAG 58 约 3 000
3#MHC_UTR_B 2 GTCTCTCCACCTCCTCAC
菌液检测引物
Prim er 2 f GGGAGGAATATGGGATCAG 56 约 1 500
Prim er ( 5) r GAGGCAGGGAACACTTCTAC
测序通用引物
M13( 47) forw ard p rim er CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13( 48) reverse p rim er AGCGGATAACAATTTCACAC
12 方法
121 基因组 DNA提取 按照 %分子克隆实验方
法指南 &中酚 氯仿提取 DNA方案,从食蟹猴外周血
及永生化 B淋巴细胞系中提取基因组 DNA。
122 PCR扩增、产物割胶纯化、克隆测序 PCR
扩增采用 TaK aLa LA Taq酶 (宝生物公司 ), PCR产
物回收按 Q iaGen Ge l Purificat ion试剂盒手册说明,
从凝胶中回收目的条带; DNA TA克隆及测序 根据
TakaLa PMD20 T Vector试剂盒说明,采用连接体系
10 L,其中载体 10 nmoL,目的基因 20 nmo ,l ddH2O
补充至 5 L, So lution 1 5 L。16∃ 连接 12 h。阳性
克隆子采用菌液 PCR方法检测, 菌液送 Invitrogen
公司测序。
123 数据分析 所测序列经 Genscan软件预测
和相似性比对分析得到相应的氨基酸序列。经软件
M olecular Evo lu tion Genetics Analysis, V ersion 40
(MEGA 40)采用领位相连法 ( neighbo rjo in ing )对
NCB I下载具有代表性的全长氨基酸序列,与试验获
得的氨基酸序列构建系统进化树。基因进化距离由
Ju lesCan ter方法计算。比对结果中序列空格处的
氨基酸残基在构建进化树的过程中已经由软件自动
删除。进化树的可信度通过 Bootstrap方法验证,
Bootstrap的计算参数分别是 1 000 re lations及64 283
random seeds。
2 结果与分析
21 24种 MafaB等位基因的鉴定
采用引物对 MBF、MBR对十只食蟹猴外周血基
因组 DNA进行扩增, 扩增片段大小为 2 800 bp, 与
预期相符 (图 1)。 PCR产物割胶纯化后分别克隆至
T载体, 从每个样品中挑取了 15- 30个阳性克隆子
进行测序,为排除因 PCR扩增或测序原因所导致的
B1B10.样本食蟹猴编号; M. DL10 000从上至下分别为 10 000、
7 000、4 000、3 000、2 000、1 000、500、250 bp
图 1 食蟹猴MHCB基因的 PCR扩增图
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2010年第 5期 郑宇凌等 : 24种食蟹猴MHC B座位等位基因序列特征与进化分析
序列变化,只有那些重复测出 2次以上的序列才认
为是样品本身的序列。本研究从 207个克隆子中共
得到 24种等位基因序列, 经 B lastn比对分析,其中
4条为新的MafaB等位基因序列,已递交 NCB I数
据 库, GenBank 收录号为 GQ411543、GQ411545、
GQ411546、GQ 41155。由国际非人 灵长类 动物
MHC命名委员会 ( IPDNHP)命名为MafaB* 01702、
MafaB* 12801、MafaB* 0380302、MafaB* 13001。
试验所得 24条序列在样品中分布如图 2所示。
其中,MafaB* 7701、MafaB* 5601、MafaB* 8301、
MafaB* 12801、MafaB* 13001在至少 4个个体中
出现,暗示这 5种等位基因在本地自繁猴群中的分
布频率可能较高。
B1B10为样品食蟹猴编号, ∋标记的等位基因为试验所得的新等位基因
图 2 样本食蟹猴 B1B10含有的 MHCB等位基因
22 MafaB氨基酸序列比对及同源性分析
MHCI类基因产物为组成抗原结合肽的 1、
2、3、跨膜链及胞内肽链, 通过 C lustal X软件对
MafaB基因产物进行比对, 可以得到以下几点:
MHCI中位于跨膜链及胞内肽链的氨基酸序列基
本相似,但是在抗原肽结合区 1、2的氨基酸残基
呈现出较高的多态性, 说明氨基酸序列的多态性是
1、2区域能结合多种抗原肽的一个重要原因。
MHC多态性形成的机制多为碱基突变, 有一些碱基
突变发生在三联密码子的第 3位, 往往造成同义突
变,也就是氨基酸不发生变化; 而有一些碱基突变则
为错义突变, 会造成氨基酸的改变, 可能会引起
MHC分子结构和功能也将发生相应的改变。试验
所得 4条新等位基因中, MafaB* 01702与MafaB
* 600101呈现高度相似,两者所推测的氨基酸序列
仅存在两处差异,分别位于 2结构域的第 138和第
140位残基,MafaB* 600101为酪氨酸和天冬氨酸,
MafaB* 01702为组氨酸和丝氨酸。根据 HLAB
蛋白质结构推测, 这两个突变的氨基酸并不位于
MHC分子与抗原肽结合槽位置, 因此推测 MafaB
* 01702可能具有与 MafaB* 600101相似的免疫
功能, 比对结果如图 3所示。新基因 MafaB*
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
12801与其最相近的 MafaB* 05506相比, 在第 61
位精氨酸 (谷氨酰胺; 在第 119位谷氨酸 (天冬氨
酸;在第 134位赖氨酸(组氨酸;MafaB* 0380302与
其最相近的恒河猴MamuB* 9301相比,在第 134位
精氨酸 (谷氨酰胺; MafaB* 13001与其最相近的
恒河猴 MamuB* 13相比, 在第 113位谷氨酸 (谷
氨酰胺;第 207位天冬氨酸(谷氨酸。
∋表示新基因
图 3 部分MafaB氨基酸序列与本研究中 4条新序列的比对结果
23 MafaB基因、MamuB基因及 HLAB基因同
源性分析
食蟹猴已经被广泛用于生物医学试验, 最为常见
的是药物试验和器官移植试验,这些试验的结果被用
于判断药物及移植方式的有效性,而其有效性受试验
动物的 MHC基因影响。与 DNA相比,氨基酸序列较
为保守,通过分析比较与疾病相关的食蟹猴、恒河猴
及人 MHCB氨基酸序列的同源性来研究食蟹猴的
MHCB基因与人 HLAB基因之间的进化关系, 从而
推测食蟹猴作为试验动物的可靠性。
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2010年第 5期 郑宇凌等 : 24种食蟹猴MHC B座位等位基因序列特征与进化分析
从 NCB I数据库下载的MafaB,MamuB及HLA
B的全长氨基酸序列,其中所选择的恒河猴、人及食
蟹猴 MHCB氨基酸序列均与 SIV病毒感染相关。试
验所得的 24条MafaB氨基酸序列与下载的MafaB、
MamuB及 HLAB氨基酸序列根据领位相连法
(Ne ighborJo in ing)被进一步构建成为系统进化树 (图
4),在构建系统进化树过程中,如果两条氨基酸序列
之间的差异性 ( d< 0025),那么认为这两条氨基酸序
列是来自于同一个等位基因。
图 4 由部分MafaB,MamuB及 HLAB
氨基酸序列构建的系统进化树
通过进化树分析, MafaB* 8301、HLAB*
5701、Mamu B* 08、MamuB* 17氨基酸序列的遗
传距离较远, 虽然 MafaB* 8301、HLAB* 5701、
MamuB* 08、MamuB* 17均被认为能延缓血液中
SIV病毒复制,抑制 SIV疾病发展 [ 4 ] ,但是这 4个基
因可能经过不同的遗传进化途径突变产生, 其延缓
SIV病毒复制的功能也可能通过不同的机制表现。
试验获得的 24条序列中,MafaB* 06302与 Mamu
B* 3901属于同一个进化分枝,MafaB* 06302是
印尼食蟹猴群所特有的等位基因 [ 5] , 暗示印尼食蟹
猴可能是本地食蟹猴群的祖先之一。
3 讨论
多数研究基于从食蟹猴 cDNA样品入手, 从每
只食蟹猴中获得大约 3- 6条 MHCB表达序列, 从
而推测食蟹猴的 MHCB基因是一个重复基因座。
我们的实验结果表明,在单个食蟹猴外周血 DNA样
品中能获得至少 6至 11条 MHCB等位基因序列,
这点不仅有力地证明食蟹猴 MHCB基因是重复基
因座。同时也暗示每只食蟹猴至少有 3个以上的
MHCB基因座,并不是所有的 MHCB基因座都表
达。这与此前关于恒河猴 MHC基因的研究结果
类似 [ 6 ]。基因位点的数目及 MHC基因共显性表
达的特点使得 MHCI分子具有高度的多态性并能
针对多种病原多肽产生免疫效应。我们研究发
现,食蟹猴 MHCB基因多态性主要集中在 1和
2抗原肽结合位点附近, 表明氨基酸水平的多态
性是 MHC分子能识别大量不同病原多肽的重要
基础。
研究文献表明, 少数的 MHCB基因在食蟹猴、
恒河猴及猪尾猕猴之间共享 [ 7]。例如, 食蟹猴中
MafaB* 7901与印度恒河猴 MamuB* 05一致, 而
MafaB* 5601则可能来源于猪尾猕猴ManeB* 03,
两者只有一个碱基的区别。本研究数据显示,Mafa
B* 380301与MamuB* 3002所预测的氨基酸序列
只有一个氨基酸不同, 而 MafaB* 8301与 MamuB
* 9301所编码的氨基酸序列则完全一致。这些能
够在不同猴群中共享的序列有可能说明这些序列在
进化过程中来自于同一个祖先。但仍有大量的序列
为食蟹猴特有,说明 MHCI B序列具有明显的种群
特异性,导致这一特异性的一个重要的可能原因是
病原物衍生平衡选择作用。另一方面可能是由于食
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
蟹猴MHCB基因的地域特征, 例如大部分菲律宾食
蟹猴和毛里求斯食蟹猴具有延缓 S IV感染的 MHC
B基因, 而马来尼西亚和印度尼西亚的食蟹猴却比
较少 [ 8]。引起基因地域特征的原因较为多样, 而进
化作用只是其中的一个比较主要的原因。
本试验共获得 24条MafaB等位基因,其中 20
条为已知序列, 4条为新等位基因。已为 NCBI收
录,收录号分别为 GQ411543、GQ411545、GQ411546、
GQ41155。由国际非人灵长类动物 MHC命名委员
会 ( IPD)命名为 MafaB* 01702、MafaB* 12801、
MafaB* 0380302、MafaB* 13001[ 9]。在每个试验
个体中均获得 6至 11条等位基因, 显示食蟹猴的
MHCB基因为重复基因座。通过比对所获得的
MafaB基因, 发现在 1和 2的多态性位点较多,
这与 MHC功能是一致的。抗原结合部位的多态性
可使得 MHCI分子识别大量的抗原肽。通过比较
食蟹猴、恒河猴及人中与 S IV 病毒感染相关的
MHCB基因的同源性, 虽然 MafaB* 8301、HLAB
* 5701、MamuB* 08、MamuB* 17被认为能延缓
血液中 S IV病毒复制,抑制 SIV疾病发展,但是彼此
之间的遗传进化关系较远,因此推测这些基因产生相
同免疫功能的作用机制可能大相径庭。而用食蟹猴
作为 S IV研究的动物模型,其试验数据的可靠性还需
要在病毒水平和细胞水平进行深入研究和验证。
参 考 文 献
[ 1] Campbell JK, Detm er MA, Karl AJ, et a.l Characterization of 47
MHC class I sequences in Fil ip ino cynom olgu sm acaqu es. Imm uno
genet ics, 2009, 61: 177187.
[ 2] Bontrop ER. C om parative gen et ics ofMHC polym orph ism s in d iffer
ent prim ate species: dup lications and deletions. H um an Immunolo
gy, 2006, 67: 388397.
[ 3] Uda A, T anabayash i K, Fu jita O, et a l. Iden tification of the MHC
class I B locus in cynom olgusm onkeys. Imm un ogenet ics, 2005, 57:
189197.
[ 4] K rebs CK, J in ZY, Rudersdorf R, et a.l Unu sually h igh frequen cy
MHC class I alleles in m au rit ian orig in cynom olgu sm acaques. The
Journal of Immunology, 2005, 175: 52305239.
[ 5] O tt ing N, Doxiad is GG, Bon trop RE. Defin it ion of M afaA andB
hap lotypes in ped igreed cynom olgus m acaques (M acaca fa scicu
laris) . Imm unogenetics, 2009, 61( 1112) : 74553.
[ 6] Ot ting N, H eijm an sMCC, NoortCR, et a.l U nparalleled com plexity of
theMHC class I region in rh esus macaques. PNAS, 2005, 102:
16261631.
[ 7] Ku lsk iKJ, AnzaiT, Sh iina T, et a.l Rhesusm acaque class I dup licon
structu res, organ izat ion, and evolut ion w ith in th e alpha b lock of the
m ajor h istocompat ib ility com p lex. M ol B iol Evo,l 2004, 21 ( 11 ):
20792091.
[ 8 ] Pend ley JC, B ecker AE, KarlA J, et al. MHC class I characterization
of Indones ian cynom olgus m acaques. Imm unogenetics, 2008, 60:
339351.
[ 9] Rob inson J, WallerM J, Parham P, et a.l M arsh SGE IMGT /H LA and
IMGT /MHC: sequen ce databases for the study of them ajor h istocom
pat ib ility comp lex. Nucleic Acids Research, 2003, 31: 311314.
(上接第 165页 )
[ 6] 马志科, 王倩. 牛乳中掺豆浆的鉴别试验. 黄牛杂志, 1997, 23
( 3) : 3233.
[ 7] LopezC alleja I, GonzalezA lon so V, FajardoMA, et a.l Appl icat ion of
a po lym erase ch ain reaction to detect adu lterat ion of ovin e cheeses
w ith caprine m ilk . Eur Food Res Techno,l 2007, 225: 345349.
[ 8 ] 徐仙,陈沁,雍克兰,韩奕奕. PCR方法在区分牛奶牧场来源中的
应用.食品科技, 2008, 12: 258261.
[ 9 ] 田雨,从牛奶中分离 DNA方法的建立. 乳业科学与技术, 2006,
118( 3 ): 112113.
[ 10 ] M arabol iA, C attaneo T. M. P, G iang iacom o R. D etect ion of vegeta
b le p roteins from soy, pea and wh eat isolates inm ilk pow der by near
in frared sp ectroscopy. Journ alofN ear Infrared Spectroscopy, 2002,
10( 1 ): 6369.
[ 11] G arciaM C, TorreM, M arinaM L, et a.l C ompos it ion and ch aracter
ization of soyabean and related produ cts. C rit ical Review s in Food
Science andNu trition, 1997, 37: 361391.
[ 12 ] Lusas EW, Riaz MN. S oy Protein Products: Processing and U se.
The Journal of Nutrition, 1995, 125( 3S) : 573580.
[ 13 ] H aasnootW, O liem an K, Cazem ierG, et a.l Direct b iosensor immu
noassays for the detection of nonm ilk proteins in m ilk pow der. Jour
nal ofA gricu ltu ral and Food Ch em istry, 2001, 49( 11) : 52015206.
[ 14 ] 张东送,庞广昌,高法国,等. 毛细管电泳在牛乳中酪蛋白含量测定
及掺假检测方面的应用. 食品与发酵工业, 2005, 31(1) : 130132.
[ 15 ] Luykx DMAM, Cordew en er JHG, et a.l Iden tif icat ion of p lant p ro
tein s in adu lterated sk imm ed m ilk pow der by h ighp erform ance liq
u id ch rom atographym ass spectrom etry. Journal of Ch rom atography
A, 2007, 164: 189197.
[ 16 ] 徐亚丹,王俊,赵国军. 检测掺假牛奶的电子鼻传感器阵列的优
化. 传感技术学报, 2006, 19 ( 4) : 957962.
178