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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):167-173
收稿日期 ：2015-03-23
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30371091）
作者简介 ：汪强强，男，硕士，研究方向 ：鱼类分子免疫学 ；E-mail ：wqq@whu.edu.cn
通讯作者 ：贾伟章，男，副教授，研究方向 ：水生动物免疫学 ；E-mail ：jiawzh@gdpu.edu.cn
乌鳢（Channa argus）MHC Class I 全长 cDNA 序列的
克隆及表达特征
汪强强1  贾伟章2  黄泽波1，2
（1. 武汉大学药学院，武汉 430071 ；2. 广东药学院生物制药研究所，广州 510006）
摘 要 ： 旨在探究乌鳢（Channa argus）MHC 基因的分子特征、表达方式及多态性。应用抑制差减杂交（SHH）和快速扩增
cDNA 末端（RACE）技术克隆并鉴定了乌鳢全长 MHC I cDNA 序列 Char-Ia-1、Char-Ia-2 和 Char-Ib，推测氨基酸序列与已知硬骨鱼
MHC I 基因同源。Char-Ia-1 和 Char-Ia-2 cDNA 序列包含 1 167 和 1 083 bp 的开放阅读框，分别编码 388 和 360 aa 的膜型Ⅰ类分子 ；
而 Char-Ib cDNA 序列包含 978 bp 的开放阅读框，编码 325 aa，显著截短的羧基末端显示 Char-Ib 为潜在的分泌型Ⅰ类分子。比较
发现 Char-Ia 与 Char-Ib 在 3 非转录区存在显著差异，在细胞外区、跨膜区和细胞质区的氨基酸序列同源性均较低，推测二者来
自不同的 MHC I 基因座。氨基酸序列比对显示乌鳢 MHC I 分子与抗原肽结合的关键氨基酸残基较保守，在 α1 和 α3 结构域均出现
硬骨鱼特征性的氨基酸残基缺失。进化树分析表明 Char-Ia-1 和 Char-Ia-2 聚为一簇，与 Char-Ib 处于不同的进化分支上，进一步证
实 Char-Ia 与 Char-Ib 分别由不同 MHC I 基因座编码。RT-PCR 分析显示乌鳢 MHC I 在组织中呈现组成型表达。设计基因专一性引
物检测乌鳢 Char-Ia 与 Char-Ib 两类 MHC I 基因在组织中的表达水平，结果显示 Char-Ia 以较低的浓度表达于所有被检测组织，而
Char-Ib 主要表达于脾、肠、鳃和外周血，呈现明显的组织表达特异性，提示两类 MHC I 分子在鱼类免疫反应中发挥不同的生理功能。
关键词 ： 主要组织相容性复合物 ；基因座 ；表达特征 ；乌鳢
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.024
The Cloning and Expression Characteristics of A Full-length cDNA of
MHC I from Snakehead Channa argus
Wang Qiangqiang1 Jia Weizhang2 Huang Zebo1，2
（1. School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071 ；2. Institute of Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical
University，Guangzhou 510006）
Abstract: By the methods of suppression subtractive hybridization（SSH）and rapid amplification of cDNA ends（RACE）, 3 full-
length sequences, Char-Ia-1, Char-Ia-2 and Char-Ib of major histocompatibility complex（MHC）I from snakehead（Channa argus）were
cloned and characterized. The sequences of these clones were predicted to be in a high degree of homology with known teleost’s MHC I. Char-
Ia-1 and Char-Ia-2 contained an open reading frame（ORF）of 1 167 and 1 083 bp, and encoded a putative peptide of 388 and 360 amino acid
respectively. However, the cDNA of Char-Ib contained an ORF of 978 bp encoding putative peptide of 325 amino acid, and a significantly shorter
carboxyl terminal indicated that it was a molecule of secreting type I. Comparing Char-Ia and Char-Ib demonstrated significant difference in
3 untranslated region, and low homology of amino acid’s sequences in extracellular domains, transmembrane and cytoplasmic regions. These
suggested that Char-Ia and Char-Ib were encoded by two different loci. Alignment of amino acid sequence indicated that key antigenic peptide-
anchoring residues binding with snakehead’s MHC I were conserved, and there was amino acid deletion in α1 and α3 domains as the same
characteristics of teleost. A phylogenetic analysis indicated that Char-Ia-1 and Char-Ia-2 branched together in the tree, and away from Char-
Ib, this further demonstrated that they were from two different loci. RT-PCR analysis showed that snakehead MHC I gene was constitutively
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12168
主要组织相容性复合体（Major histocompatibility
complex，MHC）是染色体上紧密连锁的基因群组成
具有高度多态性的区域，其编码产物在脊椎动物免
疫系统中发挥重要功能［1］。自 1990 年 Hashimoto 等［2］
首次克隆鲤（Cyprinus carpio）MHC 基因以来，已对
具有重要经济价值的鱼类 MHC 基因及其多态性开
展了广泛研究，其中包括 ：鲤［3，4］、虹鳟（Oncorh-
ynchus mykiss）［5-7］、 斑 点 叉 尾鮰（Letalurus puneta-
us）［8］、真鲷（Chrysophrys major）［9，10］、牙鲆（Pa-
ralichthys olivaceus）［11，12］ 和 海 鲈（Dicentrarchus la-
brax）［13］等。MHC I 类分子基因不仅具有高度的多
态性，而且存在一定程度的剪切异构现象。哺乳动
物具有缺失跨膜区、α3 结构域及同时缺失 α2 和 α3
结构域的不同 MHC I 剪切异构体，可以形成膜型和
分泌型等 MHC I 分子从而执行不同生理功能［14，15］。
选择性剪切异构体是丰富蛋白质多样性的重要途径，
免疫系统的选择性剪切增加了免疫系统调控的复杂
性和多样性。鱼类 MHC 基因的分子结构、组成及多
态性与哺乳动物 MHC 基因具有相似性，但是作为
低等脊椎动物其 MHC I 类分子特征也存在一定的差
异［16-18］。在硬骨鱼大眼鲈（Stizostedion vitreum）克
隆一类 MHC I cDNA 序列，由于二核苷酸序列重复
破坏了跨膜区的疏水性产生潜在分泌型 MHC I 分
子［19］，其在鱼类免疫系统中的功能尚未明确。哺乳
动物膜型和分泌型 MHC I 分子表达形式不同，其功
能差异显著［14］。硬骨鱼 MHC I 基因在多数组织中
均有表达，其中在肾脏、胸腺、脾、心脏和肠中表
达较强，在脑、肝脏和肌肉中表达较弱［5，19］。然而，
硬骨鱼类膜型和分泌型 MHC I 类分子的表达特征及
其生物学功能还有待进一步探索。因此，对鱼类不
同类型优势 MHC I 等位基因组成和功能进行研究，
可为了解鱼类免疫系统的组成和免疫应答机制奠定
基础。
乌鳢（Channa argus）属鲈形目（Perciformes）、
鳢科（Channidae）、鳢属（Channa），其肉质细腻、
营养价值颇高，是我国较为重要的淡水养殖鱼类之
一，然而高密度集约化养殖引发的病害成为限制乌
鳢养殖业发展的瓶颈［20］。本研究对乌鳢 MHC I 基
因进行克隆和序列分析，检测 MHC I 在乌鳢组织中
的表达情况，并进一步分析 Char-Ia 和 Char-Ib 两类
MHC I 基因在组织中表达的差异，旨在探究其 MHC
基因的分子特征、表达方式及多态性。
1 材料与方法
1.1 材料
乌鳢购买自湖北武汉水果湖水产市场，个体约
250 g，实验室控温养殖一周。新鲜的组织材料放入
液氮中保存。
1.2 方法
1.2.1 MHC I cDNA 序列 取乌鳢新鲜头肾组织材料
100 mg，Trizol 试剂盒提取组织总 RNA（Invitrogen），
mRNA 纯化试剂盒制备 mRNA（Promega）。以 poly
I ：C 诱导乌鳢为 Tester，对照为 Driver，利用差减
杂交技术构建头肾差减 cDNA 文库（Clontech）。通
过对文库序列的筛选、克隆与测序，得到 834 bp
的 cDNA 序列，经 NCBI 数据库比对显示其与已知
MHC I 基因同源。
1.2.2 RACE-PCR 获得 MHC I 基因全长 5 端 RA-
CE 扩增，按 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification
Kit 合成全长 cDNA（Clontech）。引物设计，见表 1。
RACE-PCR 使用热启动和降落 PCR 程序 ：94℃预变
性 2 min ；94℃变性 30 s，65℃退火 30 s（每轮循环
降 1℃），72℃延伸 1 min，10 个循环；94℃变性 30 s，
55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，25 个循环 ；72℃延
伸 6 min。第二轮巢式 PCR 使用 5 nested primer 和
MHC-I-R2，以 1 μL 第一轮 PCR 产物为模板进行第
二轮 PCR 反应。5 RACE 测序结果显示，获得显著
差异的 MHC I cDNA 序列，在开放阅读框起始位置
expressed in all detected tissues. Moreover, we designed specific primers to determine the expression level of Char-Ia and Char-Ib. The results
illustrated that Char-Ia was ubiquitously expressed at low level, whereas the Char-Ib was predominantly expressed in spleen, intestine, gill and
peripheral blood, suggesting the significant specificity of expression in tissue, which indicated that Char-Ia and Char-Ib played the different
physiological functions in the immune responses of fish.
Key words: major histocompatibility complex ；loci ；expression characteristics ；snakehead Channa argus
2015,31(12) 169汪强强等 ：乌鳢（Channa argus）MHC Class I 全长 cDNA 序列的克隆及表达特征
分别设计引物 MHC-Ia-F 和 MHC-Ib-F。使用接头引
物 3 Adapter 与基因特异性引物 MHC-Ia-F 和 MHC-
Ib-F 分别扩增 MHC I 基因 3 末端，循环原理 ：94℃
变性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 2 min ；72℃延
伸 6 min。
1.2.3 克 隆、 测 序 及 序 列 比 对 分 析 PCR 扩 增
产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离， 目 的 片 段 切 胶 回
收（Omega）。 纯 化 后 PCR 产 物 与 pMD18-T 载 体
（TaKaRa）相连接，转化制备的 DH5α 感受态细胞。
挑选单克隆进行菌落 PCR 鉴定，阳性克隆测序。
通 过 NCBI 网 站（http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast）
BLAST 程 序 进 行 序 列 相 似 性 比 对，ExPASy 网 站
（http://au.expasy.org）翻译软件获得氨基酸序列。由
Cluatal W 1.8 程序完成氨基酸序列的同源性比较分
析，并通过 MEGA 5.1 构建系统进化树。
1.2.4 MHC I 组织表达分析 取乌鳢头肾、后肾、
肠、肌肉、心脏、脾、肝脏、脑、鳃和外周血等组
织材料，液氮研磨，提取组织总 RNA，经过 DNase
I 消化（TaKaRa）后，使用逆转录酶合成 cDNA 一
链（TaKaRa）。设计 3 对特异性引物 MHC-I-TF/TR、
MHC-Ia-F/MHC-I-R2 和 MHC-Ib-F/MHC-I-R2 分 别
扩 增 203 bp MHC I、648 bp Char-Ia 和 651 bp Char-
Ib。选择 β-actin 为内参。用上述 4 对引物分别进行
PCR 反应 ：94℃ 2 min ；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃
Char-Ia 和 Char-Ib 延伸 1 min，MHC I 和 β-actin 延伸
30 s，26 个循环 ；最后 72℃ 6 min。
2 结果
2.1 MHC I基因克隆
根据筛选获得的 MHC I cDNA 序列，通过基因
专一性引物及接头引物进行 5 端 RACE-PCR 和 3
端 RACE-PCR，3 条 全 长 MHC I cDNA 序 列（Char-
Ia-1、Char-Ia-2 和 Char-Ib）被分别克隆、鉴定（Gen-
Bank 登录号 ：EU864508、EU864509 和 EU864510）。
Char-Ia-1 cDNA 全 长 为 1 826 bp， 包 含 1 167 bp 的
开放阅读框，编码 388 aa。3 端非编码区具有多
个 mRNA 不稳定信号（ATTTA）和一个加尾信号
（AATAAA）。Char-Ia-2 cDNA 全长为 1 868 bp，包含
1 083 bp 的开放阅读框，编码 360 aa。3 非编码区存
在 6 个 mRNA 不稳定信号和一个加尾信号。分子特
征表明 Char-Ia-1 和 Char-Ia-2 编码 MHC I 包含跨膜
去，是一类膜型 MHC I 分子。Char-Ib cDNA 全长为
1 179 bp，包含 978 bp 的开放阅读框，编码 325 aa，
显著截短的羧基末端显示 Char-Ib 为潜在的分泌型Ⅰ
类分子。
2.2 MHC I蛋白质序列分析
根据 MHC I cDNA 全长序列及由此推测的蛋白
质序列，乌鳢 MHC I 蛋白质序列与已知同源的蛋白
质均具有较高的相似性，在多个位点均具有保守的
氨基酸残基（图 1）。一个潜在的 N 糖基化位点位于
胞外结构域 α1 区，参与二硫键形成的 4 个保守半胱
氨酸分布于胞外结构域 α2 和 α3。Char-Ia-1、Char-
Ia-2 和 Char-Ib 推测的氨基酸序列均具有保守的多肽
表 1 乌鳢 MHC I 基因克隆与表达引物
名称 引物序列（5-3） 使用
MHC-I-R1 TCCTGTCCATCTTTCCTCCA 5 RACE PCR
MHC-I-R2 TGACTGGAGAGGACGGAGAC 5 RACE PCR 和表达研究
MHC-Ia-F GACTCGTGAAAATGAGGGGT 3 RACE PCR 和表达研究
MHC-Ib-F ATGACACAATGGACACCTTG 3 RACE PCR 和表达研究
MHC-I-TF CTCCGTCCTCTCCAGTCAGC 表达研究
MHC-I-TR CACACAGTCGTATCTCCTCCA 表达研究
5 UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCTAATACGACTCACTATAGGGC 5 RACE PCR
5 Nested Primer AACGCAGAGTACGCGGG 5 RACE PCR
3 Adaptor GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3 RACE PCR
Oligo dT adapter GGCCACGCGTCGACTAGTACT17 一链 cDNA 合成
β-actin-F CACTGTGCCCATCTACGAG RT-PCR 对照
β-actin-R CCATCTCCTGCTCGAAGTC RT-PCR 对照
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12170
Leader peptide Alpha 1
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Char-Ia-2
Char-Ib
Stvi-C1a2
Stvi-C1-3
Auha-705
Auha-706
Onmy-UBA*501
Onmy-UBA*4201
HLA-A
Char-Ia-1
Char-Ia-2
Char-Ib
Stvi-C1a2
Stvi-C1-3
Auha-705
Auha-706
Onmy-UBA*501
Onmy-UBA*4201
HLA-A
Char-Ia-1
Char-Ia-2
Char-Ib
Stvi-C1a2
Stvi-C1*3
Auha-705
Auha-706
Onmy-UBA*501
Onmy-UBA*4201
HLA-A
Char-Ia-1
Char-Ia-2
Char-Ib
Stvi-C1a2
Stvi-C1-3
Auha-705
Auha-706
Onmy-UBA*501
Onmy-UBA*4201
HLA-A ,9*,$*///$,7*$ü$$9 :5566 5**6<74$$66$4*696/7$&.9
基于 char-Ia-1 编码的氨基酸序列比对。“*”表示缺失，保守的氨基酸残基分别为 ：与抗原肽结合的关键氨基酸（▼），盐桥（+），潜在
的 N 糖基化位点（☼），β2- 微球蛋白结合氨基酸（◙），二硫键（■），CD8 连接位点（♦），其他保守的氨基酸残基（●）。CP/TM 表示
连接肽和跨膜区 ；CT 表示细胞质区。粗体显示跨膜区肽段。其他氨基酸序列及登录号 ：Stvi-C1a2（AY057457），Stvi-C1-3（AY057456），
Auha-705（AF038551），Auha-706（AF038552），Onmy-UBA*501（AF287488），Onmy-UBA*4201（AY278454），HLA-A（NM_002116）
图 1 乌鳢 Char-Ia-1、Char-Ia-2 和 Char-Ib 与其他脊椎动物 MHC I 基因编码的氨基酸序列比较
2015,31(12) 171汪强强等 ：乌鳢（Channa argus）MHC Class I 全长 cDNA 序列的克隆及表达特征
结合区和 B2m 结合位点。虽然硬骨鱼类位于胞外结
构域 α3 区的 CD8 作用位点不完全保守，但是 Char-
Ia-1、Char-Ia-2 和 Char-Ib CD8 作用位点富含酸性氨
基酸，其中 8 个氨基酸中有 4 个为酸性氨基酸。与
HLA-A 氨基酸序列相比，乌鳢与其他硬骨鱼 MHC I
在 α1（54-55）区和 α3（189-190）存在明显的氨基
酸序列缺失。Char-Ia-1 与 Char-Ia-2 的氨基酸相似性
75%，但是 Char-Ia-1 和 Char-Ia-2 具有完全不同的细
胞质区。Char-Ib 与 Char-Ia-1 和 Char-Ia-2 的相似性
较低，其中羧基末端差异显著。
系 统 进 化 树 分 析（ 图 2） 显 示，Char-Ia-1、
Char-Ia-2 和 Char-Ib 处 于 进 化 树 上 不 同 的 分 支。
Char-Ia-1 和 Char-Ia-2 集成一簇，其亲缘关系较近。
Char-Ib 单 独 形 成 一 个 进 化 分 支， 与 Char-Ia-1 和
Char-Ia-2 关系较远。
Stvi-C1a2AY057457
Stvi-C1-3AY057456
Stvi-C1-1AY057455
Stvi-C1a49AY057459
Paol-UA1AB126917
Furu-I1AF001215
Char-Ib
Spau-UAA*01DQ211540
Orla-UAA*0201BAB83849
Auha-706AF038552
Auha-517AF038550
Auha-705AF038551
Char-Ia-1
Char-Ia-2
Gamr-UF-6AF414205
Onmy-UBA*501AF287488
Atsa-UBA*0301AF504022
Onmy-UBA*4201AY278454
Cyca-UA1*01Z46777
Dare-UBA*01Z46777
Gaga-B-FIVNM_001031338
HLA-ANM_002116100
100
95
99
99
82
100
72
63
99
99
73
26
63
61
16
26
31
40
0.05
图 2 脊椎动物 MHC I 氨基酸序列构建的系统进化树
M HK Pk Sp Li In He Gi Br Mu PB
β-actin
MHC I
MHC Ib
MHC Ia
2
kb
1
0.75
0.5
M ：DNA Marker ；HK ：头肾 ；Pk ：后肾 ；Sp ：脾 ；Li ：肝 ；In ：肠 ；He ：心脏 ；
Gi ：鳃 ；Br ：脑 ；Mu ：肌肉 ；PB ：外周血
图 3 乌鳢 MHC I 在组织中的表达情况
外周血，呈现明显的组织表达特异性。
3 讨论
应用抑制差减杂交（SHH）和快速扩增 cDNA
末 端（RACE） 技 术 克 隆 并 鉴 定 了 乌 鳢 3 条 全 长
MHC I cDNA 序 列 Char-Ia-1、Char-Ia-2 和 Char-Ib，
编码的 MHC I 分子均包括导肽、胞外结构域（α1、
α2 和 α3）、跨膜区和细胞质区。Char-Ia-1 和 Char-
Ia-2 在 α1 结构域呈现高度的序列相似性，然而在跨
膜区和细胞质区的显著差异表明二者应来源于 MHC
I 基因的重组［17］。Char-Ia 和 Char-Ib 在 3 UTR 呈现
较小的序列相似性，在胞外结构域、跨膜区和细胞
质区同源性均较低 ；系统进化树分析显示 Char-Ia-1
和 Char-Ia-2 聚为一类，与 Char-Ib 处于不同的进化
分支上，因此当前的数据支持 Char-Ia 和 Char-Ib 分
别由不同 MHC I 基因座编码。氨基酸序列比对显示
乌鳢 MHC I 分子与抗原肽结合的关键氨基酸残基较
保守，与其他硬骨鱼 MHC I 分子一样在 α1 和 α3 结
构域均出现明显的氨基酸残基缺失［19］。MHC I 细
胞质区存在丝氨酸磷酸化位点［4］，然而乌鳢 Char-
Ia-1 和 Char-Ia-2 编码 MHC I 的细胞质区分别包含 4
个和 9 个丝氨酸残基，氨基酸序列的相似性尚不能
确定发挥磷酸化作用的丝氨酸残基。与 Char-Ia-1 和
Char-Ia-2 相比，Char-Ib 具有较短的跨膜区和细胞质
区，显著截短的羧基末端推测 Char-Ib 为一类潜在的
分泌型 MHC I 分子。在大眼鲈中发现由于二核苷酸
序列多次重复插入 MHC I α3 结构域末端，破坏了跨
膜区阅读框从而产生分泌型 MHC I 分子［19］。虽然乌
鳢 Char-Ib 多肽的羧基末端存在 3 个丝氨酸残基，然
2.3 MHC I组织表达分析
RT-PCR 检测乌鳢 MHC I mRNA 在头肾、后肾、
肠、肌肉、心脏、脾、肝脏、脑、鳃和外周血组织
中的表达水平。结果（图 3）显示，乌鳢 MHC I 组
成型表达于所有组织中，Char-Ia 则以较低的浓度表
达于所有组织，而 Char-Ib 主要表达于脾、肠、鳃和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12172
而分泌型与膜型 MHC I 分子的丝氨酸残基可能执行
不同的生理功能。
对虹鳟和大眼狮鲈的 Northern blot 检测结果显
示，MHC I 基因主要表达于肾脏、胸腺、脾、心脏
和肠［5，19］。通过半定量 RT-PCR 检测显示乌鳢 MHC
I 基因组成型表达于被检测组织，其中在肠、鳃和心
脏的表达量略高。值得注意的是 Char-Ia 和 Char-Ib
在检测组织中的表达水平存在显著差异。Char-Ia 以
较低的浓度表达于所有被检测组织，而 Char-Ib 主要
表达于脾、肠、鳃和外周血，提示 Char-Ib 的表达具
有组织特异性。在硬骨鱼类，检测斑点叉尾鮰 MHC
I 基因也发现差异表达的现象［8］。哺乳类 H-2 mRNA
在肝脏限制性表达，其翻译的 MHC I 分子仅具有细
胞外区域，推测为一类分泌型 MHC I 分子［21，22］。
组织特异性表达与蛋白质序列特征表明乌鳢 Char-Ib
编码多肽具备分泌型 MHC I 分子特征。这类 MHC
分子在调控 T 细胞与抗原呈递细胞相互作用以及控
制自然杀伤细胞的功能中发挥重要作用［15，22］。乌鳢
MHC I 的克隆与表达研究有助于探讨鱼类 MHC I 基
因的多态性。
4 结论
利用 RACE 技术从乌鳢中克隆并鉴定了 MHC
I cDNA 序 列 Char-Ia-1、Char-Ia-2 和 Char-Ib， 并 对
蛋白质序列进行了详细的位点分析和结构域预测。
其中，Char-Ib 具有显著截短的羧基末端呈现分泌
型 MHC I 类分子特征。进化树分析表明 Char-Ia 与
Char-Ib 处于不同的进化分支上，应由不同 MHC I 基
因 座 编 码。RT-PCR 分 析 显 示 Char-Ia 与 Char-Ib 组
织表达差异显著，提示两类 MHC I 分子在鱼类免疫
反应中发挥不同的生理作用。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）