全 文 ：收稿日期:2007-06-29
作者简介:王均华(1964-),男,山东泰安人,高级农艺师,硕士,主要从事组织培养与玉米育种工作
培育耐旱作物品种是利用盐碱地和干旱地的
一条经济而有效的途径。利用传统的方法培育耐
旱、耐盐品种受到限制,耐旱分子机制的研究和生
物技术的日臻完善,为培育高效耐旱植物开辟了新
的道路。目前利用基因工程技术培育抗旱品种主要
有两种策略:1)增加植物渗透性代谢产物的合成能
力,使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物
质(如甘露醇、甜菜碱、海藻糖等),以提高植物的渗
透调节能力,从而增强植物的抗旱性;2)增强植物
对活性氧自由基的清除能力,使植物在水分胁迫下
过度表达一些酶(如 SOD,POD,CAT等),以有效地
排除有害的活性氧自由基,从而提高细胞耐脱水的
能力。由于渗透调节是植物主要的耐旱机制,近年
来人们已利用植物基因工程手段来培育耐旱作物
品种,并在以渗透调节为主的耐旱性转基因植物培
育方面取得了可喜的进展。
1 渗透保护物质生物合成关键酶基因工程
这些基因产物大多为合成小分子相溶性溶质
或渗压剂的关键酶。研究报道,通过基因工程手段
将脯氨酸、甘露醇、果聚糖等小分子相溶性溶质或
渗压剂生物合成的关键酶基因导入植物体内,使它
们过量表达可一定程度地提高植物的抗旱性。
1.1 脯氨酸(Proline)合成酶基因工程
脯氨酸是水溶性很大的氨基酸,它具有偶极性
使其疏水端与蛋白质联结,而亲水端与水分子结
合,从而使蛋白通过脯氨酸束缚更多的水分子,因
此可增加蛋白质的可溶性,使更多的可溶性蛋白加
入到渗透调节的行列中,同时束缚水含量的增加也
能避免或减少因细胞脱水引起的蛋白质变性[1]。因
而增加脯氨酸的合成能力,可提高植物的抗旱性,
在这方面国内外有许多成功的报道。P5CS(Δ1-
pyroline-5-carboxylatesynthetase)是从 Mothbean中
分离得到的,其编码蛋白催化裂解谷氨酸盐转变为
Δ1-pyroline-5-carboxylate,是脯氨酸合成的关键酶
编码基因。Igarashi等从水稻中分离出 P5CS的
cDNA,然后比较盐敏感品种 IR28和耐盐品种
植物抗旱基因工程研究进展
王均华 1 苏波 1 马冲 1 王国胜 1 沈向 2
(1山东省泰安市农科院,泰安 271000;2山东农业大学,泰安 271018)
摘 要: 综述了渗透保护物质生物合成关键酶基因、胚胎后期发生丰富蛋白(Lea)基因或Lea相关基因、编码转录
因子的调节基因、抗氧化胁迫相关的酶等植物抗旱基因工程研究进展,并对其研究中存在的问题及今后的应用前景进行
了讨论。
关键词: 植物 抗旱 基因工程 研究 进展
ProgressonGeneticEngineeringofDroughtResistanceinPlants
WangJunhua1 SuBo1 MaChong1 WangGuosheng1 ShenXiang2
(1TaianAcademyofAgriculturalScience,Taian271000;
2HorticultureDepartment,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018)
Abstract: Thisarticlereviewedtheresearchadvancesonthedrought-resistantgenes.Forinstance,thekeyenzyme
geneofosmoticsubstancesbiosynthesis,thegeneorrelativegene(lea)oflateembryogenesisabundantproteins,the
regulationgeneencodingtranscriptinfactor,andtherelativeenzymeaboutanti-oxidationstres.Moreovertheproblems
intheresearchesandtheapplicationprospectiveinthefuturewasalsoobserved.
Keywords: PlantsDroughtresistance Geneticengineering Research Advances
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
2008年第1期
DGWG在高盐条件下 P5CSmRNA的积累水平,发
现处理 10h后开始有 P5CS的转录表达,然后不断
增强,到 48h后形成高峰,耐盐品种的转录水平比
盐敏感品种高[2]。脯氨酸积累水平也是耐盐品种比
敏感品种高,说明水稻的耐盐性与其 P5CS的表达
及脯氨酸的积累有关。Kavikishor等[3]将 P5CS基因
导入烟草,转基因植株脯氨酸含量比对照高 10～18
倍;在盐胁迫条件下,与对照相比转基因植株根的
长度和干重增加,植株生物产量提高,花发育得更
好,果荚数目和每荚的种子数也增加。Zhu等[4]将同
一基因转入水稻,使用 ABA或逆境诱导的特异启
动子,在逆境胁迫下转基因植株脯氨酸含量是对照
的 2.5倍,初步的研究结果表明,在盐或水分胁迫
下转 P5CS基因水稻第二代根和茎的鲜重增加,生
物产量也增加。Pilonsmitse等将豇豆的 P5CS的
cDNA在 35S启动子的驱动下转化烟草,结果酶活
性提高并使转基因植株脯氨酸积累比对照提高了
10到 18倍,脯氨酸的过量产生,提高了转基因植
物在干旱条件下的生物量并且促进花的发育,从而
提高植株对渗透胁迫的耐性[5];Ray等以组成型启动
子(Act1)和干旱诱导启动子驱动 P5CS转化水稻,
水分胁迫处理后 72h,脯氨酸积累提高了 7倍,随后
根系的生长量也不一样,组成型转化的比对照提高
44%,诱导型启动子转化的比对照提高 124%[6]。
1.2 甜菜碱合成酶基因工程
甜菜碱作为植物的渗透调节物质,其化学性质
与脯氨酸相似,它也属于小分子量化合物,也具有
强的溶解度,在生理 pH范围内也不带净电荷,对
植物无毒害作用,也局限分布在细胞溶质内[7]。一
般认为甜菜碱也是通过与蛋白的相互作用,保护生
物大分子在高电解质浓度下不变性,同时,作为渗
透平衡物维持细胞的膨压。体外试验发现甜菜碱在
环境胁迫时具有稳定蛋白质的四级结构和膜的高
度有序性,并阻止光合系统中的 Rubisco和 PSI
复合体解联成亚基而失活[8]。近年来人们又发现甜
菜碱在体外试验中具有稳定双螺旋 DNA和降低
DNA退火温度的作用,因而认为甜菜碱可能在水
分胁迫条件下促进转录和复制[9]。Alia等认为碱菜
碱在解除胁迫后的恢复期间具有加速蛋白质合成
的作用[10]。
在高等植物的某些种属中,如菊科、藜科等均以
甜菜碱作为主要的渗透调节剂,但很多主要的农作
物如水稻、马铃薯和番茄等却没有碱菜碱积累[11]。由
于甜菜碱的合成过程较简单,不涉及复杂的发育和
结构层次,被认为是基因工程抗旱良好的调控途
径。与甜菜碱合成有关的重要基因有:①BADH:甜
菜碱醛脱氢酶 (betainealdehydedehydrogenase)基
因;②CMO:胆碱加氧酶(cholinemonooxgenase)基
因。李银心等将山菠菜的 BADH基因转入豆瓣菜,
获得了耐盐的转基因植株;发现转基因植株 BADH
酶活性明显高于对照,在盐胁迫下膜结构所受损伤
小于对照,在 0.5%NaCl培养基上正常生长,而对照
生根困难,生长缓慢[12]。
1.3 甘露醇(Mannitol)生物合成的相关基因
1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD)基因,是从大肠杆
菌 中 分 离 的 甘 露 醇 合 成 的 关 键 酶 编 码 基 因 。
Tarczynski等[13]报道转mtlD烟草耐盐性提高。Thomas
等[14]将 mtlD导入拟南芥,转基因植株的种子因积
累甘露醇在高盐下能萌发,而对照植株的种子则不
能萌发。Karakas等[15,16]报道,与对照相比转 mtlD
烟草在盐胁迫下干重略有增加,而在干旱胁迫下则
无差异;甘露醇的积累对渗透调节还有负反馈作
用。进一步研究发现,使 mtlD在叶绿体中定向表
达,转基因烟草叶片的叶绿体中甘露醇的浓度可达
10mM,植株对 Methylviologen(MV)诱导的氧化胁迫
的耐性提高,保护叶绿素。
1.4 海藻糖合成酶基因工程
利用海藻糖的特性,通过基因工程技术把海藻
糖合酶基因导入植物,以改良植物的抗旱性,这方
面已有一些成功的报道。Holmstrom等把来自大肠
杆菌的海藻糖合酶基因 OtsBA导入甜菜、马铃薯
中,使转基因植物的抗旱性和耐寒性得到了增强[17];
B.Karakas等把来源于酵母菌的海藻糖-6-磷酸合
酶基因 TPS1转入烟草,并初步获得具抗旱性的转
基因植株[18];BoShen等把来源于酵母菌的海藻糖-
6-磷酸合酶基因 TPS1导入烟草中也初步获得了抗
旱的转基因植株[19]。这些均充分说明把来源于微生
物的海藻糖合酶基因转入植物中使其在体内表达
可提高植物的抗旱性。
1.5 果聚糖(Fructan)生物合成相关的基因
王均华等:植物抗旱基因工程研究进展 21
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
果聚糖是果糖的多聚分子,由于其高可溶性使植物
的渗透调节能力提高。sacB是从细菌中分离出的果
聚糖合酶基因,是合成果聚糖的关键酶编码基因。
Pilon-Smits等[20]将 sacB导入烟草,在非胁迫条件下
果聚糖积累对植株生长和产量无影响。在 PEG介
导的渗透胁迫下转基因植株的耐受性明显提高,耐
逆性强弱与果聚糖积累量呈正相关。
1.6 肌醇甲酯(D-ononitol)生物合成相关基因
转肌醇甲基转移酶基因(IMT1)烟草积累肌醇
甲酯,耐盐性和耐旱性提高[21]。由于细胞溶质中肌
醇甲酯的含量高达 600mM,它不能进入液泡,作为
一种渗压剂对 Na+起渗透平衡作用。
1.7 多胺(Polyamine)
多胺是小分子、广泛存在的氮素类细胞组分,
植物在干旱、高盐等逆境条件下会积累多胺,耐盐
性高的栽培物种多胺含量也高[22],外施多胺能提高
燕麦叶片的渗透调节能力[23]。与多胺生物合成有关
的重要基因有:1)Odc:小鼠鸟氨酸脱羧酶编码基
因,鸟氨酸脱羧酶催化鸟氨酸向腐二胺转变;2)
Adc:燕麦精氨酸脱羧酶编码基因。Minocha等[24]研
究表明,转 Odc胡萝卜细胞系过量表达 Odc,转基
因细胞能够耐 0～40hr的盐胁迫和渗透胁迫。Capel
等[25]报道利用 CaMV35S启动子在水稻中过量表达
Adc,在干旱胁迫下抑制了叶绿素的降解,提高了抗
旱性,但也严重影响植株的发育。
2 胚胎后期发生丰富蛋白(Lea)基因或 Lea
相关基因
在种子的后期发育过程中,大麦类群第三组
Lea蛋白-HVA1在糊粉层和胚中特异表达,与种子
的耐脱水性有关。ABA和几种逆境(脱水、高盐、高
温)能快速诱导 HVA1在大麦幼苗中表达 [26]。
BaochengZhu等[27]用水稻 actin1启动子将大麦HVA1
基因导入水稻,转基因植株在叶片和根中均积累
HVA1蛋白,其第二代的耐水分亏缺和耐盐能力明
显提高。
3 编码转录因子的调节基因
通过转化调节基因来提高植物脱水胁迫的耐
性是一条十分诱人的途径。由于在逆境条件下这些
逆境相关的转录因子能够调节功能基因的表达和
信号转导,它们在转基因植物中的过量表达会激活
许多抗逆功能基因同时表达。CBF1和 DREB1A的
产物均为转录因子,它们与顺式作用重复元件
(CRT)/(DRE)结合,引起一组含顺式作用重复元件
(CRT)/(DRE)的功能基因表达。Jaglo-Otosen等[28]
将 CBF1导入拟南芥,该基因的过量表达明显提高
了耐寒性。Kasuga等[29]利用 CaMV35S启动子和逆
境诱导特异启动子 rd29A,将 DREB1A的 cDNA导
入拟南芥,DREB1A的过量表达激活许多耐逆境功
能基因的表达,如 rd29A(LEA蛋白类似物)、Kin1、
Cor6.6、Cor15a、rd17和 P5CS等,转基因植株耐旱
性、耐盐性和耐冻性提高。
4 抗氧化胁迫相关的酶
20世纪 80年代以来,人们对干旱胁迫下植物
体内抗氧化防御系统进行了大量研究。现已确定它
是由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成,
如超氧歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化
氢酶(CAT)和抗坏血酸(AsA)等。它们协同抵抗干
旱胁迫诱导的氧化伤害,而单一的抗氧化酶或抗氧
化物不足以防御这种氧化胁迫。如 SOD催化两个
超氧自由基发生歧化反应形成 O2和 H2O2,H2O2再
被 POD和 CAT催化除掉。在整个氧化防御系统中,
SOD是所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧
化酶。根据其结合金属离子的不同,SOD可分为
Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和 Fe-SOD三种类型。Cu/Zn-
SOD主要在叶绿体和细胞质中,Mn-SOD主要存在
于线粒体中,Fe-SOD则主要位于叶绿体中。一般来
讲,干旱胁迫下植物体内 SOD等酶的活性与植物
抗氧化胁迫能力呈正相关。抗旱性强的植物,在干
旱胁迫下,SOD、POD、CAT的活性较高,因而能有
效地清除活性氧,阻抑膜脂过氧化。
由于 SOD是植物体内第 1个清除活性氧的关
键抗氧化酶,因此近年来通过 SOD基因工程改良
植物耐旱性的研究也已有若干报道。现已从植物中
克隆出来几种 SODcDNA并在转基因植株中验证
了 SOD活性。通过使用两种不同的转运肽,来源于
烟草上的 Mn-SOD既可在苜蓿的叶绿体中又可在
线粒体中表达。Mckersie等[30,31]将烟草中的 Mn-SOD
的 cDNA导入苜蓿后,发现转基因苜蓿的抗旱性明
显提高。经过 3年的大田试验研究表明,抗氧化胁
迫对适应大田环境是很重要的,并证明转基因苜蓿
22
2008年第1期
中 Mn-SOD的表达能通过调控叶绿素荧光、电解质
渗漏和茎尖再生来减弱水分亏缺的伤害,从而增强
了苜蓿的抗旱性。VanCamp等[32]将 Mn-SOD基因定
位到烟草的叶绿体和线粒体上,发现也能表达其基
因。进一步研究发现,在叶绿体中 Mn-SOD的过量
表达使烟草受干旱所引起的氧化伤害程度比对照
明显减轻,但线粒体中增加的 Mn-SOD活性对烟草
耐氧化胁迫能力没多大影响。另外,表达拟南芥
Fe-SOD的转基因烟草、表达番茄 Cu/Zn-SOD的转
基因烟草、过量表达豌豆 Cu/Zn-SOD的转基因烟草
均能增强抵抗干旱引起的氧化胁迫能力。Yoshiko
Miyagawa[33]利用转基因技术将分解活性氧能力很强
的大肠杆菌过氧化氢酶转入烟草叶绿体中获得转
基因植株。实验表明,这些转基因植株在接近沙漠
阳光的强光照射下,5d后叶片仍不枯黄,而普通烟
草 2d后叶片变为枯黄。这种转基因烟草可在沙漠
中存活 30d。这是由于过氧化氢酶分解活性氧的能
力比烟草本身的分解酶强的多,能消除强光下产生
的对植物细胞有损伤的活性氧,使转基因烟草在缺
水强光下仍能进行光合作用。
5 存在问题与解决方法
单基因转移能提高植物的抗旱性,这为植物抗
旱分子育种带来了曙光。但人们在通过基因工程方
法进行抗旱分子育种的过程中发现存在一些问题:
(1)由于人们对植物抗旱的分子机制缺乏了解,抗
旱分子育种还有很大的盲目性;(2)采用单基因策
略提高植物的抗旱性对有的基因和植物有效,对有
的基因和植物却无效;(3)利用 35S启动子与抗旱
基因组合在提高植物抗旱性的同时也造成植物畸
形发育;(4)外源基因表达水平不稳定。
上述问题可以采取如下解决办法:(1)加强植
物抗旱分子机制的研究,这是提高抗旱分子育种针
对性和有效性的基础;(2)采用多功能基因、主效功
能基因和调节基因策略。由于植物的抗旱性是由多
个功能基因控制的,如果采用单基因策略,只有导
入主效功能基因或调节基因,作用才可能明显。否
则只有采用多功能基因策略;(3)利用特异启动子。
根是植物与外界环境进行信息和物质交换的主要
器官,干旱时常常也是最先受到影响的器官,故可
将根部特异启动子应用于抗旱基因工程中,使抗旱
基因在根中特异表达;另外逆境诱导特异启动子的
应用也非常重要,从而使得抗逆境基因在遇到逆境
时才表达。上述两类特异启动子的应用可大大降低
能量消耗,使转基因植物在获得干旱抗性的同时,
又不影响正常的生长发育,从而可解决因使用 35S
启动子引起植物畸形发育的问题;对以抗旱为目的
转基因体系而言,采用干旱诱导的启动子是非常必
要的。如使用组成型启动子,在转基因植株中抗旱
基因恒定而持续的表达,不仅会造成植株内部资源
的浪费,且还会影响到植株的正常代谢活动,不利
于产量和品质的提高;如果抗旱基因受干旱诱导,
该基因只在干旱的情况下才被诱导表达,而在正常
的条件下并不表达,这样既不会造成植株内部资源
的浪费,也不至于影响植株正常的代谢而致经济性
状变劣,从而能更好地提高植物的抗旱性;(4)提高
外源基因的表达水平。外源基因插入的位置效应和
拷贝数将影响转基因株系基因的表达水平,有时还
会因转化基因的低水平表达得出错误的结论,因此
提高外源基因的表达水平十分必要。要使导入植物
体内的外源基因高水平表达可采取如下策略:使用
强启动子、组织特异性启动子和逆境诱导特异启动
子,使用 MAR序列(matrixatachmentregion),使用
单拷贝的转基因株系以便减少基因沉默;(5)检测
转基因植物的第 4～5代以便验证导入基因是否稳
定高水平表达;(6)使用纯合的转基因株系进行温
室和田间的耐旱性鉴定。尽管目前抗旱分子育种面
临不少问题,但随着抗旱分子生物学研究的深入和
生物技术的进步,相信在不久的将来会有大量的抗
旱转基因作物应用到生产实践中来。
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研究所陈宏等 7位水生动物细胞与分子生物学研究专家采用 PCR方法对草鱼 MyoD成肌分化抗原(myogenic
diferentiationantigen)基因开放阅读框进行了改造扩增,构建了草鱼MyoD基因原核表达载体pBV220-MyoD,并
进行了初步原核表达研究。其结果指出:构造的原核表达载体pBV220-MyoD含有草鱼MyoD基因完整的开放阅
读框,其原核表达载体的表达产物相对分子质量为34ku,它的表达产物占全菌蛋白的10.8%,表达量较低。还提示
大肠杆菌对密码子的偏性可能是造成草鱼MyoD基因在大肠杆菌中表达量较低的主要因素。因此,草鱼MyoD
基因的高效表达需要应用真核表达载体或进行稀有密码子进行改造。本研究以我国特有主要池塘养殖品种草鱼
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