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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
嗜热土芽孢杆菌 GSEY01及其高温蛋白酶的初步研究
廖艳江 季秀玲 魏云林 林连兵
(昆明理工大学 生物工程技术研究中心，昆明 650224)
摘 要: 从云南腾冲热海热泉中分离出一株产高温蛋白酶的菌株 GSEY01。该菌株最适生长温度为 60℃，16S rRNA基因
序列分析表明，该菌株为土芽孢杆菌属(Geobacillus)的耐热菌株。该菌株所产高温蛋白酶可以通过超滤浓缩，硫酸铵分级沉淀和
强阴离子交换层析获得纯酶。此高温蛋白酶分子量约为 42 kD，最适催化温度为 80℃，最适催化 pH7 5，Mg2 +能增强该酶活力，
Fe3 +，Cd2 +和 Ni2 +对其活性则有抑制作用。PMSF对该酶影响较小，乙二胺四乙酸(EDTA)和十二烷基磺酸钠(SDS)则对其有
强烈的抑制作用，此高温蛋白酶和其他土芽孢杆菌所产蛋白酶有较大差异，可以应用于相关的高温催化环境。
关键词: 土芽孢杆菌 高温蛋白酶 纯化 酶学性质
Study on A Thermophilic Geobacillus sp. GSEY01 and
Its Thermophilic Protease
Liao Yanjiang Ji Xiuling Wei Yunlin Lin Lianbing
(Biotechnology Research Center，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224)
Abstract: A thermostable extracellular protease producing strain GSEY01 was isolated from a hot spring in Rehai，Tengchong，Yun-
nan Province. The optimal growth temperature of strain GSEY01 was 60℃. 16S rRNA gene phylogenetic analysis showed that this strain
belonged to thermophilic Geobacillus sp. Protease secreted by strain GSEY01 was purified to homogeneity by ultra filtration，ammonium sul-
fate precipitation and ion exchange chromatography. Molecular weight of this proteinase was 42 kD. The protease showed the highest activi-
ty at 80℃ and pH7. 5. The activity of the protease could be activated by Mg2 +，but inhibited partially by Fe3 +，Cd2 + and Ni2 + . In addi-
tion，the activity of the enzyme was inhibited by EDTA and SDS strongly，but not by PMSF. Protease from strain GSEY01was greatly differ-
ent from those proteinase isolated from other strains of Geobacillus ，and could be applied in industrial processes that are performed under
high temperature.
Key words: Geobacillus Thermophilic protease Purification Characterization
收稿日期:2009-12-15
基金项目:中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室开放课题(SKLMR-080605) ，国家自然科学基金项目(30660009，
30960022)
作者简介:廖艳江，女，硕士生，研究方向:高温酶学及高温噬菌体;E-mail:liaoyanjiang1105@163. com
通讯作者:林连兵，E-mail:linlb@ sohu. com
嗜热蛋白酶能在高温下保持稳定并有较高的催
化活性，因此成为皮革加工、洗食品加工、涤添加剂及
生物技术等领域的重要工业用酶［1］。蛋白酶来源广
泛，来源于微生物的蛋白酶都是胞外酶，比来源于动
植物的蛋白酶更易于分离、纯化，而高温菌的高温蛋
白酶因其具有良好的热稳定性及耐变性剂和有机溶
剂等优点，在工业上具有重要的应用价值。高温蛋白
酶亦可作为阐明高温蛋白酶耐热机制的理想模型，为
人们利用蛋白质工程技术改造天然酶，从而提高其稳
定性提供一定的理论依据。
已有许多从嗜热细菌中分离到高温蛋白酶的报
道，如利用于嗜热解朊芽孢杆菌生产嗜热蛋白酶，并
且此酶已在工业上用来生产二肽甜味剂(Aspar-
tame)［2］;从超级嗜热古菌 Pyrococcus horikoshii 中分
离到的最佳活性温度为 80℃，兼具羧肽酶和氨肽酶
活性的双功能蛋白酶［3］;从嗜热菌 Bacillus sp. strain
MO-1菌株中分离出可降解胶原蛋白和明胶的蛋白
酶［4］等。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010年第 6期
本研究从腾冲热海热泉中分离到一株土芽孢杆
菌属的产高温蛋白酶的菌株 GSEY01，通过发酵、超滤
浓缩、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析等方法纯化
其蛋白酶，并对该蛋白酶的酶学性质进行了初步
研究。
1. 材料与方法
1 1 培养基
1 1 1 DSM88 液体培养基(g /L) Proteose Peptone
1 0;Yeast Extract 1 0;(NH4)2 SO4 1 3;KH2PO4 0 276;
MgSO4·7H2O 0 25;Na2MoO4·2H2O 0 000025;CuSO4
0 000016;MnSO4·H2 O 0 0022;H3 BO3 0 0005;ZnSO4·
7H2O0 0005;CoCl2·6H2O 0 000046;CaSO4·H2O 0 06;
FeSO4 0 099;pH7 5。
1 1 2 DSM88 固体培养基 在 DSM88 液体培养基
中添加 2%的琼脂。
1 1 3 2%酪蛋白琼脂培养基 称取酪蛋白琼脂
(广东环凯微生物科技有限公司)2 g，用适量的水加
热溶解，再定容到 100 mL。
1 2 菌株的分离及筛选
采集温度为 60℃、pH6 5 的腾冲热海热泉水
样，于常温运输至实验室。取 0 5 mL热泉水样与 5
mL DSM88 液体培养基均匀混合后，取 100 μL 涂布
在 DSM88 固体培养基上，55℃恒温培养 24 h，挑出
单菌落划线纯化 3 次后，用灭菌牙签接种于 2%酪
蛋白琼脂培养基上，55℃继续培养 24 h，通过观察比
较水解圈直径与菌落直径比值的大小筛选产蛋白酶
活性较高的菌株。
1 3 菌株生长温度范围测定
将处于对数生长期早期(OD600≈0 4)的菌株培
养液 0 5 mL接种到 5 mL的 DSM88 液体培养基中，
分别置于37℃、45℃、55℃、60℃、70℃和80℃ 180 r /min
培养 3 d，通过测定培养液中的 OD600来确定其生长
温度范围及最适生长温度。
1 4 16S rRNA基因扩增及测序
细菌基因组 DNA采用博大泰克 DNA提取试剂
盒提取，16S rRNA基因采用细菌 16S rRNA 通用引
物(由上海生工合成)扩增。其中正向引物(Forward
Primer)序列为 5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-
3′;反向引物(Reverse Primer)序列为 5′ ACGGC
TACCT TGTTA CGACT T-3′。
PCR 扩增体系(25 μL) :ddH2O 16 25 μL，10 ×
PCR Buffer 2 5 μL，MgCl2 2 μL，dNTPs 1 5 μL，Taq
0 75 μL，Forward Primer 0 5 μL，Reverse Primer
0 5 μL，模板 DNA 1 5 μL。
PCR扩增条件为 94℃预变性 4 min;94℃变性
45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，进行 30 个循环;
72℃延伸 10 min。PCR 产物经胶回收后，克隆到
pMD18-T载体(购买于宝生物(TaKaRa)工程(大
连)有限公司)上，利用 CaCl2转化法转化 E. coli
DH5α菌株，挑取阳性克隆由上海生工测序。
1 5 菌株系统进化树的构建与分析
在 GenBank 中用 Blastn 程序进行相似性比
较［5］，选取相似性较大的序列用 Mega 4 0 进行系统
发育分析［6］，用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统
进化树，用于检验支持率的重复抽样次数为 100
次［7］。
1 6 酶活力的测定方法
采用福林-酚法测定蛋白酶活力［8］。取 50 μL
样品加入预热至 80℃的装有 50 μL 2%酪蛋白溶液
(pH7 5 的 Tris-HCl缓冲液配置)的离心管中，80℃
水浴 15 min，之后迅速加入 100 μL 0 4 mol /L 三氯
乙酸终止反应，13 000 r /min 离心 2 min，离心后取
上清 100 μL，加入 500 μL 0 4 mol /L 碳酸钠溶液及
100 μL福林酚溶液，混匀后于 37℃保温 10 min，测
定 660 nm吸光度。以在 0 05 mol /L pH7 5 的 Tris-
HCl为缓冲体系，反应温度为 80℃时，每分钟水解
酪蛋白产生 1 μg 酪氦酸所需酶量定义为一个酶活
力单位(U)。
1 7 蛋白酶的分离与纯化［9］
将菌株接种于 50 mL DSM88 液体培养基中，
55℃ 170 r /min 培养 12 h，后转接至 2 000 mL
DSM88 液体培养基中，55℃ 170 r /min 培养 48 h。
发酵液 6 000 r /min 离心 10 min，收集发酵液上清，
用0 22 μm的滤膜抽滤以去除细胞碎片，滤液用
10 000 MWCO膜包超滤浓缩至 100 mL，于 4℃缓慢
搅拌下加入(NH4)2 SO4固体，使之达 40%饱和度，
持续搅拌 6 h。冷冻离心机 13 000 r /min 离心 30
min，弃沉淀，上清继续加入(NH4)2 SO4固体，使之达
65%饱和度，并持续搅拌过夜。冷冻离心机 13 000
r /min离心 30 min，沉淀部分用 10 mL 0 05 mol /L
091
2010年第 6期 廖艳江等:嗜热土芽孢杆菌 GSEY01及其高温蛋白酶的初步研究
pH 7 5 的 Tris-HCl缓冲液溶解，并于缓冲液中透析
24 h，再用 10 000 MWCO 浓缩截流管(Sartorius)浓
缩至10 mL，获得粗酶液。
粗酶液经 Q SepHarose Fast Flow 强阴离子柱纯
化，采用 AKTA Purifer10 蛋白纯化系统，层析条件
为:先用 50 mmol /L(pH7 5)的 Tris-HCl 缓冲液以
0 4 mL /min 流速平衡柱子，平衡后以 0 2 mL /min
流速上样，采用 NaCl 梯度洗脱，浓度分别为 0 1，
0 15，0 2，0 25，1 0 mol /L 洗脱，流速为 0 3 mL /
min。收集各吸收峰，进行蛋白酶的活性检测及
SDS-PAGE电泳分析。
1 8 SDS-PAGE电泳
采用不连续 SDS-PAGE垂直平板电泳［10］，浓缩
胶 5%，分离胶 12%。起始电压 80 V，待样品进入分
离胶后加压至 120 V，对蛋白样品进行电泳。
1 9 蛋白酶最适催化温度
将 50 μL酶液加入 50 μL含有 2%的酪蛋白的
0 05 mol /L pH7 5 的 Tris-HCl 的缓冲液中，分别置
于 28℃、37℃、45℃、55℃、65℃、70℃、75℃、80℃、
85℃、90℃和 100℃测定酶活力。
1 10 最适催化 pH
制备以下不同 pH 值的缓冲液:0 1 mol /L 柠
檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5 0 － 6 6) ;0 05 mol /L
Tirs-HCl缓冲液(pH7 1 － 9 0) ，0 05 mol /L 甘氨
酸-氢氧化钠缓冲液(pH9 0 － 10 0)。取不同 pH
含 2%的酪蛋白的缓冲液 50 μL，加入 50 μL 用
相同 pH 的缓冲液稀释的酶液，在 80℃测定酶活
力。
1 11 金属离子对酶活性的影响
分别将含有 0 1 M Cu2 +、Mn2 +、K +、Ca2 +、
Ba2 +、Pb2 +、Zn2 +、Fe3 +、Ni2 +、Cd2 +、Co2 +、Mg2 + 的
0 05 mol /L pH7 5 的 Tirs-HCl缓冲液 10 μL加入到
90 μL酶液中(使反应体系中金属离子的浓度达到
10 mmol /L) ，在室温下保温 10 min 后测定酶活力，
并计算酶的相对活力。
1 12 酶抑制剂和有机溶剂对酶活性的影响
将 1%十二烷基磺酸钠(SDS)、1 mmol /L 乙二
胺四乙酸 (EDTA)、1 mmol /L 苯甲基磺酰氟
(PMSF)、1%乙腈和 1%丙酮溶液分别加入到纯化
的蛋白酶溶液中，在室温下保温 10 min 后测定酶活
力，并计算酶的剩余活力。
2 结果
2 1 产酶菌株 GSEY01 生长特性
从腾冲热海热泉水样中分离得到能在高温环境
下产蛋白酶的菌株 GSEY01，其中菌株在 2%酪蛋白
琼脂固体培养基上产生明显的蛋白水解圈，其水解
圈直径 /菌落直径比为 0 6。
GSEY01 菌株在 DSM88 固体培养基上可形成
直径为 2 mm 的白色菌落，菌落表面干燥，边缘粗
糙、不规则。对 GSEY01 菌株进行革兰氏染色结果
表明，该细菌为革兰氏阳性细菌，菌体呈杆状，有端
生芽孢。菌株 GSEY01 在 DSM88 液体培养基中生
长良好，生长范围为 45 － 80℃;最适生长温度为 55
－ 60℃。
2 2 菌株的系统进化分析
菌株 GSEY01 的 16S rRNA 基因长度为1 499
bp，GenBank序列号为 GU084158。序列同源性分
析比较表明，GSEY01 与 Geobacillus 属的菌株同源
性较高，综合其形态、生长温度特征及 16S rRNA
基因序列分析结果，鉴定其为土芽孢杆菌属(Geo-
bacillus)中的嗜热菌株，菌株的系统进化分析如图
1 所示。
2 3 蛋白酶的分离与纯化
GSEY01 在 55℃培养 48 h 后，发酵液依次经过
离心，超滤浓缩，硫酸铵沉淀，透析，强阴离子交换柱
层析进行分离纯化。纯化蛋白酶经 SDS-PAGE 电泳
(分离胶 12%，浓缩胶 5%) ，考马斯亮蓝染色后，为
单条带，如图 2 所示，此高温蛋白酶为单体蛋白，分
子量约为 42 0 kD。
2 4 蛋白酶最适温度和 pH
菌株 GSEY01 所产蛋白酶在不同温度下的催化
活力如图 3 所示，蛋白酶在 55 － 90℃范围内均有较
高的催化活性，在 80℃时，其酶活达到最高。蛋白
酶在 98℃下处理 30 min仍然有 17%左右的剩余活
性，说明菌株 GSEY01 所产生的蛋白酶为高温耐热
蛋白酶。菌株 GSEY01 所产蛋白酶在 pH 值在6 － 9
之间酶活相对较高，当 pH 为 7 5 时，蛋白酶活力最
高，如图 4 所示。
191
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010年第 6期
图 1 GSEY01 菌株的系统发育分析
图 2 蛋白酶的 SDS-PAGE电泳分析
图 3 温度对酶活力的影响
2 5 金属离子对酶活性的影响
在温度为 80℃，pH7 5，金属离子浓度为 10
mmd /L的条件下，不同金属离子对酶活力影响结果
见表 1。结果表明，Mg2 + 能增强该酶活力，Fe3 +、
Cd2 +、Ni2 +等金属离子对其活性则有明显抑制作用，
金属离子浓度高达 10 mmol /L 时，可能对酶活有一
定抑制作用。
2 6 酶抑制剂和有机溶剂对酶活性的影响
在温度为 80℃，pH7 5 的条件下，酶抑制剂、
有机溶剂对酶活力的影响结果见表 2。乙腈、
PMSF、丙酮对该酶影响不大，而乙二胺四乙酸
(EDTA)和十二烷基磺酸钠(SDS)对其有强烈的
抑制作用，1 mmol /L EDTA 即可将其酶活完全
抑制。
图 4 pH对酶活力的影响
3 讨论
蛋白酶是一类很重要的水解酶，由于其用途广
泛，已成为当前国内外研究的热点。目前，国外学者
291
2010年第 6期 廖艳江等:嗜热土芽孢杆菌 GSEY01及其高温蛋白酶的初步研究
已从 Thermoactinomyces vulgaris［11］，Thermus aquat-
ics［12］，Sulfolobus solfataricus［13］，Bacillus hermoproteo-
lyticus［14］，Pyrococus furiosus［15］，B. stearothwemophi-
lus［16］等高温菌中获得各种类型的高温蛋白酶，国内
学者则多集中在泥土芽孢杆菌属(Geobacillus)产蛋
白酶的研究上。腾冲热海具有丰富的栖热菌资
源［17］，张燕新等［18］从云南温泉的淤泥中分离到形
态差别很大的三株产蛋白酶土芽孢杆菌属菌株。祝
伟等［19］也从腾冲热海温泉水样中筛选到一株泥土
芽孢杆菌属菌株 YM1049 产蛋白酶。本研究分离到
的 GSEY01 高温菌也来自于云南腾冲热海。
表 1 金属离子对酶活力的影响
金属离子 Pb2 + Ca2 + Mg2 + Ba2 + Co2 + Ni2 + Mn2 + Fe3 + Zn2 + Cd + Cu2 + 对照
相对酶活力(%) 69 1 98 4 109 5 90 38 6 11 2 90 9 6 3 21 6 19 3 25 8 100
表 2 酶抑制剂 /有机溶剂对酶活力的影响
抑制剂 /有机溶剂 EDTA SDS 乙腈 PMSF 丙酮 对照
相对酶活力(%) 1 36 13 86 93 03 89 68 84 6 100
纯化的 GSEY01 蛋白酶与 YMTC1049 菌株所产
蛋白酶［20］有明显的差别。就其大小而言，YMTC1049
蛋白酶的大小为 59 2 kD，而 GSEY01 蛋白酶大小为
42 kD。就其最适温度而言，YMTC1049 蛋白酶的最
是反应温度为 85℃，GSEY01 蛋白反应温度为 80℃，
但它们的最适 pH都为 7 5。
PMSF修饰蛋白酶的丝氨酸残基，但是 PMSF对
GSEY01 蛋白酶活性影响不大，这可能是 PMSF与酶
活性中心以外其他相应的氨基酸残基作用而引起酶
空间结构发生一定程度改变而影响了酶活力，因此
丝氨酸残基不是该酶的活性中心基团。与此相比
PMSF能抑制 YMTC1049 蛋白酶。
Mg2 +使 GSEY01 蛋白酶活性增加，这与 Aeropy-
rum pernix K1［21］，Streptomyces sp. ［22］所产高温蛋白
酶相似。金属螯合剂 EDTA 使其失活，所以该酶是
金属蛋白酶［23］，金属蛋白酶具有许多生理功能，目
前引起科学家们的广泛关注，但这类蛋白酶多来源
于海洋细菌［24］，此外 GSEY01 蛋白酶在 55 － 90℃酶
活较大，其最适温度为 80℃，适合在高温下发挥其
催化作用，在 pH7 1 － 9 之间酶活性较大，当 pH 达
到 9 时，其酶活性达 40%。具有一定的应用前景，
值得进一步研究。
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