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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
廉立慧 高丽君 王德才 张显忠 李艳玲
(泰山医学院生物科学系，泰安 271000)
摘 要: 从徂徕山温泉附近土样中分离到 9 株产高温蛋白酶菌株，选取一株碱性蛋白酶高产菌株 L7 为出发菌株，进行
显微形态、16S rRNA 基因序列分析，将其初步鉴定为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp．)。研究该菌株发酵条件，确定产酶的最佳
培养基组成为葡萄糖 40 g /L，蛋白胨 20 g /L，磷酸氢二钠 1． 4 g /L，氯化钙 0． 6 g /L，硫酸镁 0． 4 g /L，通过培养基优化，酶活达到
103． 08 U /mL。最佳培养条件为 250 mL 三角烧瓶中装液量 50 mL、pH8． 0、培养温度为 55℃、培养时间为 24 h。对该菌株酶学
性质研究，L7 菌株所产高温蛋白酶的最适温度为 55℃，最适 pH 为 10，并且具有良好的温度稳定性和 pH 稳定性，酶活性受
PMSF强烈抑制。
关键词: 短芽孢杆菌 高温蛋白酶 发酵条件 酶学性质
Screening of Thermostable Protease-producing Bacterium and
Analysis of Fermentation Conditions and Protease Properties
Lian Lihui Gao Lijun Wang Decai Zhang Xianzhong Li Yanling
(Department of Biological Sciences，Taishan Medical College，Taian 271000)
Abstract: Nine thermophilic bacterial strains with thermophilic protease activity were collected from the soil around a hot spring
in Mountain Culai． The strain which showed high protease activity was selected for protease assay and named as L7． Based on morpho-
logical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis，strain L7 was identified as Brevibacillus sp． ． The optimal medium com-
ponents were glucose 40 g /L，peptone 20 g /L，Na2HPO4 1． 4 g /L，CaCl2 0． 6 g /L，MgCl2 0． 4 g /L． The protease activity can achieve
103． 08 U /mL through the medium optimization． The optimal culture conditions were 50 mL medium in 250 mL Erlenmeyer flask，ini-
tial pH8． 0，at 55℃ for 24 h． Enzymatic properties showed that the enzyme optimal temperature is 55℃，optimum pH10. 0． The en-
zyme exhibited high thermal stability and stable at a wide range of pH，and its activity is intensively const rained by PMSF．
Key words: Brevibacillus sp． Thermophilic protease Fermentation condition Enzymatic properties
收稿日期:2010-08-24
基金项目:泰山医学院青年基金项目
作者简介:廉立慧，女，硕士，讲师，研究方向:微生物学;E-mail:lianlihui@ yahoo． com． cn
蛋白酶作为一类广泛用于工业生产和研究用
酶，在洗涤剂、制革脱毛、生丝脱胶、有机合成、酒类
澄清、明胶及蛋白胨生产、肉质嫩化和医药等方面应
用广泛，占酶制剂市场 65%的份额［1］。高温蛋白酶
具有耐热、耐变性剂和耐有机溶剂等优点，在蛋白酶
应用的各个领域显示出极大的潜力［2］。20 世纪 50、
60 年代，国外学者已开始了高温菌产高温蛋白酶的
研究，至今有许多这方面的报道［3，4］。国内对高温
菌的研究起步较晚，所筛选到的菌株产高温蛋白酶
的能力也不高［5，6］。
本研究从温泉样品中筛选得到一株活性较高
的产高温蛋白酶的高温短芽孢杆菌，命名为 Brevi-
bacillus sp． strain L7，对其产酶条件及一些酶性质
进行研究。
1 材料与方法
1． 1 材料
采集土壤来自徂徕山温泉周围。在温泉周围
16 个方位采集土样，－ 20℃冷冻保存［7］。
1． 2 主要培养基
分离培养基(1 L) :酵母膏 1 g，蛋白胨 2 g，硫
酸铵 3 g，硫酸钾 0. 5 g，氯化钾 0. 1 g，甘氨酸 0. 7
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
g，氯化锰 0. 05 g，硫酸锌 0. 03 g，硫酸铜 0. 02 g，钼酸
钠 0. 015 g，硫酸钒0. 02 g，硫酸镍0. 02 g，氯化镁0. 03
g，硫酸铁 0. 02 g，琼脂 20 g，pH7. 0。选择培养基(1
L) :蛋白胨 10 g，葡萄糖 1 g，氯化钠 5 g，氯化钙 0. 1
g，酪氨酸 0. 1 g，酪素 5 g，琼脂 22 g，pH7. 0。种子培
养基(1 L) :蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，
pH7. 0。基础发酵培养基(1 L) :葡萄糖40 g，蛋白胨
20 g，磷酸氢二钠 1. 4 g，氯化钙 0. 6 g，硫酸镁 0. 4
g，pH7. 0
1. 3 菌株的分离
将采样来的土壤用无菌水配成 1 ∶ 10(g /L) ，
55℃，110 r /min摇瓶温育过夜。将温育好的土壤
悬液静置，上清液用 55℃恒温好的无菌水依次从
10 倍稀释至 105倍。涂布在倒置的平板上，于 55℃
培养。
1． 3． 1 初筛 挑取分离平板上高温菌菌落，接种于
固体选择培养基上，在 55℃条件下恒温培养 48 h，
菌落周围有透明圈的即为产高温蛋白酶菌，挑取透
明圈较大的作为初筛菌株。
1． 3． 2 复筛 将初筛得到的菌株接种于发酵培养基
中进行复筛。在 55℃，200 r /min的条件下，振荡培养
48 h后，离心后取上清进行蛋白酶活力的测定。
1． 4 酶活力测定
采用 Folin 试剂显色法［8］。pH10． 0，55℃条件
下，每分钟水解酪蛋白产生 1 μg酪氨酸所需酶量定
义为一个酶活力单位(U)。
1． 5 扩增 16S rRNA与系统进化分析
根据 Lane(1991)扩增的上游引物(GGTTACCT-
TGTTACGACTT)和下游引物(AGAGTTTGATCCTG-
GCTCAG)使用 PCR 仪扩增 16S rRNA，PCR 反应程
序:94℃预变性 5 min，95℃变性 40 s，50℃退火 1
min，72℃延伸 2 min，共循环 30 次;然后 72℃保持
10 min。用凝胶回收纯化试剂盒回收扩增到的目的
片段，连接到 pMD18-T 载体上，挑取转化子测序。
测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。将菌株的
16S rRNA 基因序列与从 GenBank 数据库中获得的
短芽孢杆菌属和其他相关属细菌的 16S rRNA 基因
序列，用系统发生推断软件包 MEGA3． 0 进行统计
和聚类分析。采用邻接法(neighbor-joining method)
获得分支系统树，并通过自举分析(bootstrap)进行
置信度检测，自举数据集为 1 000 次。
2 结果与分析
2． 1 菌种的筛选
用稀释平板法从土壤中分离得到 154 株菌，点
种于酪蛋白底物平板，筛选到 63 株有较大水解圈的
产高温蛋白酶的菌株。随机挑选 9 株产蛋白酶高温
菌株测得酶活如表 1。由表 1 可见，筛选到的大部
分高温细菌属于芽孢杆菌。确定一株产酶稳定，且
其产物高温蛋白酶具有较高活性的菌株 L7 作为出
发菌株。
表 1 九株产蛋白酶高温菌株酶活力与芽孢染色
菌株编号 蛋白酶活力(U /mL) 芽孢染色
L1 4． 514 有芽孢
L2 12． 787 有芽孢
L3 8． 743 有芽孢
L4 4． 374 有芽孢
L5 8． 779 有芽孢
L6 4． 783 有芽孢
L7 28． 896 有芽孢
L8 12． 189 有芽孢
L9 8． 590 无芽孢
2． 2 菌株鉴定结果
菌株 L7 为革兰氏染色反应为阳性，菌体呈短杆
状。测定了菌株 L7 的 16S rRNA 基因序列长度
1 063 bp，将结果提交 GenBank，序列号为 HM011262。
将序列用 ClustalX 1． 8． 3 进行多重序列对比，用软
件 MEGA3． 0 按 Neighbor-joining 法以 16S rRNA 同
源性为基础，构建了包括 15 株相关种属的细菌系统
发育树(图 1)。分离菌株 L7 与嗜热短芽孢杆菌
(Brevibacillus thermoruber)在同一分支，两者序列相
似性超过 99%。
根据 16S rRNA 同源性比较，结合菌株的形态
学观察，可基本将分离的菌株归属为短芽孢杆菌，命
名为 Brevibacillus sp． strain L7。
2． 3 产酶条件
2． 3． 1 碳源对产酶活力的影响 改变基础发酵培
养基中碳源的种类。取种子液分别接种到以可溶性
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2011 年第 3 期 廉立慧等:高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
图 1 以 L7 菌株 16S rRNA序列为基础的系统发育树
淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉和麦芽糖为碳源的基础
发酵培养基，比较发酵酶活力，结果如表 2。由表
2 可以看到，以蛋白胨作为唯一氮源的基础发酵培
养基，在 55℃，200 r /min的条件下发酵 24 h，葡萄
糖作为唯一碳源的条件下，菌株产酶活力最大，为
38. 080 U /mL。
表 2 碳源对产酶影响
碳源 酶活(U /mL)
可溶性淀粉 19． 656
葡萄糖 38． 080
蔗糖 4． 800
玉米粉 9． 908
麦芽糖 10． 300
2． 3． 2 氮源对产酶活力的影响 取种子液分别接
种到以酪素、蛋白胨、玉米粉、黄豆粉、牛肉膏为氮源
的基础发酵培养基，比较产酶活力，结果如表 3。由
表 3 可以看到，在以葡萄糖唯一碳源，55℃，200 r /
min，发酵 24 h条件下，以蛋白胨作为唯一氮源的 L7
产蛋白酶能力高于其他 4 组氮源对照组，酶活力为
36． 360 U /mL。
2． 3． 3 金属离子对产酶活力的影响 取种子液分
别接种到 3 种含有不同金属离子的基础发酵培养
基，比较产酶活力，结果如表 4。由表 4 可以看出，
在同样条件下，再以钙离子为金属离子的基础发酵
培养基，55℃，200 r /min 的条件下，发酵 24 h，产酶
活力最大，酶活为 35． 680 U /mL。
表 3 氮源对产酶影响
氮源 酶活(U /mL)
酪素 10． 868
蛋白胨 36． 360
玉米粉 23． 588
黄豆粉 32． 78
牛肉膏 14． 472
表 4 金属离子对产酶影响
金属离子 酶活(U /mL)
钙离子 35． 680
镁离子 32． 364
亚铁离子 5． 760
2． 3． 4 碳源、氮源和金属离子的配比对产酶的影响
选取葡萄糖作碳源，蛋白胨作氮源，钙离子作金属
离子，pH7． 0 的基础发酵培养基，进行正交试验，确
定最佳培养基，结果如表 5。由表 5 可以看出，55℃，
200 r /min的条件下，发酵 24 h，葡萄糖40 g /L，蛋白
胨 40 g /L，钙离子 0． 6 g /L 的基础发酵培养基为最
优发酵培养基。
表 5 培养基优化正交试验表
编号
葡萄糖
(g /L)
蛋白胨
(g /L)
钙离子
(g /L)
酶活
(U /mL)
1 20 20 0． 2 29． 872
2 20 40 0． 4 35． 304
3 20 60 0． 6 33． 624
4 40 20 0． 4 36． 288
5 40 40 0． 6 43． 080
6 40 60 0． 2 38． 488
7 60 20 0． 6 33． 840
8 60 40 0． 2 38． 068
9 60 60 0． 4 40． 664
2． 3． 5 培养基初始 pH对产酶的影响 初始 pH值
对产酶影响如图 2。在初始 pH 为 5 － 11 的最优发
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
酵培养基，55℃，200 r /min，发酵 24 h，菌株产酶曲
线呈钟罩型，在 pH为 8． 0 时产酶活力最大，过酸或
者过碱都会明显抑制酶活。
图 2 初始 pH对产酶的影响
2． 3． 6 发酵时间对产酶的影响 于 55℃，200 r /
min的条件下最优发酵培养基(pH8． 0)培养。分别
取 6、12、18、24、30 和 36 h 的培养物，然后测定酶
活，以及菌体密度，其结果见图 3。产酶高峰期出现
在 24 h，时间超过 24 h，产酶量出现下降趋势。对于
菌体生长而言，24 h 之后基本处于稳定期。由图 3
可见，产酶的高峰期处于菌体生长刚刚进入稳定期
的时候。
图 3 L7 菌株生长曲线和产酶曲线
2． 3． 7 通气量对产酶的影响 在 250 mL 三角瓶中
分别装入 40、50 、60 、70、80 、90 和 100 mL 上述优
化发酵培养基(pH8． 0) ，55℃、200 r /min 振荡培养
24 h后测定酶活，结果(图 4)显示，50 mL 培养基的
通气量在本试验条件下产酶最佳，说明该菌株对通
气量的要求较高。
图 4 通气量对产酶的影响
2． 4 粗酶酶学性质初步研究
2． 4． 1 酶的最适温度和温度稳定性 以酪蛋白为
底物，分别在不同温度下测定粗酶液的活力，从图 5
可知，酶作用的最适温度为 55℃，在 40 － 60℃之间
均有较高酶活力。将粗酶液在不同温度下保温 30
min，然后与酪蛋白反应测定酶的温度稳定性。以该
酶的 4℃下保存的蛋白酶活性作为标准，试验结果
表明，35 － 55℃之间随着保温温度的升高，保留的酶
活性升高，酶活性保留 80%以上;保温时间不变，
60 － 80℃酶活性快速的下降;75℃保温 30 min 后，
活性基本上全部丧失(图 5)。
图 5 酶的最适反应温度和温度稳定性曲线
2． 4． 2 酶的最适 pH和 pH 稳定性 用不同 pH 值
的缓冲液配制 1 %的酪蛋白为底物，测定在不同 pH
值下粗酶液的催化活性，结果如图 6 所示。酶作用
最适 pH 为 10，且在 pH8 － 11 范围内均有较高酶
活。将粗酶液在不同 pH 条件下保温 30 min，调节
酶液至中性 pH，然后与酪蛋白反应测定酶的 pH 稳
定性。酶在 pH8 － 11 的缓冲液中保存 30 min 后仍
能保留 80%以上的活性。
图 6 酶的最适反应 pH和 pH稳定性曲线
2． 4． 3 抑制剂对酶活力的影响 将酶液与酪蛋
白混合，然后加入抑制剂，使 PMSF 和 EDTA 的浓
度分别达到 1． 0 mmol /L，在 55℃保温 20 min ，测
定剩余酶活力，比较两种抑制剂对其酶活性的影
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2011 年第 3 期 廉立慧等:高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
响，以进一步确定 L7 产生酶的性质，结果见表 6。
可以看出，PMSF 强烈抑制此酶活性，而金属离子
鏊合剂 EDTA对其影响不大，因此该酶属于丝氨酸
蛋白酶类。
表 6 抑制剂对酶活的影响
抑制剂 浓度(mmol /L) 相对酶活
PMSF 1． 0 0． 4
EDTA 1． 0 106． 3
3 结论
高温微生物具有独特的基因类型、特殊的生理
机制及特殊的代谢产物，具有很高的研究价值［9，10］。
本研究从温泉附近土壤中筛选得到的 L7 是一株高
温菌，它在 55℃，pH 为 8. 0 的优化培养基中振荡培
养 24 h，产生的蛋白酶到达高峰，是一株具有应用价
值的野生菌株。
目前国内报道的高温产蛋白酶的菌株，多集中
于芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和脂肪芽孢杆菌，对于短
芽孢杆菌的报道还是首次。国外关于短芽孢杆菌属
产高温蛋白酶的文献鲜有报道。该菌采用最优培养
基:葡萄糖 40 g /L，蛋白胨 40 g /L，钙离子 0． 6 g /L，
硫酸镁 0． 4 g /L，55℃培养 24 h，初始 pH8． 0，250 mL
三角烧瓶中装液量 50 mL、发酵液酶产量最高可达
到 50． 932 U /mL。其中 pH 值和通气量对产酶的影
响较明显，有关这方面的研究尚待深入。
对于酶活性质初步测定，可以看出此高温菌产
碱性高温蛋白酶，酶的最适温度为 55℃，碱性蛋白
酶酶活随反应温度升高而增加，已报道的从芽孢杆
菌中分离得到的大量碱性蛋白酶都有较高的酶作用
温度，这是用于洗涤添加剂的蛋白酶的一个重要性
质。另外，酶的最适 pH10，而且可以被 PMSF 强烈
抑制，说明此酶属于一种丝氨酸碱性蛋白酶。酶活
的稳定性研究显示，在 60℃保温 30 min酶活能保持
80%以上，超过 60℃稳定性明显下降。目前国内
已报道的高温菌株分泌碱性蛋白酶中，舒丹等［11］报
道的高温芽孢杆菌所产碱性蛋白酶60℃保温 30 min
剩余 50%酶活;李宏等［12］报道的高温菌株所产碱
性蛋白酶 60℃保温 30 min 酶活剩余 53． 4 %，也有
报道高温碱性蛋白酶最适酶活 65℃，70℃时半衰期
为 2. 5 h［13］。可见，L7 所产丝氨酸碱性蛋白酶的温
度稳定性较好。
综上所述，高温菌 L7 能成为生产上使用的极具
潜力的优良菌株。
参 考 文 献
［1］Rao MB，Tankasale AM，Ghatge MS，et al． Molecular and biotechno-
logical aspects of microbial proteases． Microbiol Mol Biol Rev，1998，
62:597-634．
［2］Kembhavi AA，Kulkarni A，Pant A． Salt-tolerant and thermostable al-
kaline protease from Bacillus subtilis NCIM no． 64． Appl Biochem
Biotechnol，1993，38(1-2) :83-92．
［3］Ohta Y． Thermostable protease from thermophilic bacteria． II． Studies
on the stability of the protease． J Biol Chem，1967，242 (3) :
509-515．
［4］Cowan DA ，Daniel RM． Purification and some properties of an extra-
cellular protease(Caldolysin)from an extreme thermophile． Biochim
Biophys Acta，1982，27:293-305．
［5］金城，杨寿钧，刘宏迪，等．耐热中性蛋白酶产生条件及酶的亲和
层析纯化．微生物学报，1994，34(4) :285-292．
［6］张云峰，李有志，莫天砚． 嗜热蛋白酶生产菌 Bacillus sp． DPE7
的产酶条件研究．广西大学学报，2004，29(3) :231-235．
［7］高朝辉，孟庆繁，逯家辉，等．长白山温泉中一株新高温菌的筛选
及其特征．吉林大学学报:理学版，2005，43(4) :527-532．
［8］黄红英，方海红，刘爱民，等．一株地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研
究Ⅰ．微生物学通报，2001，28(5) :20-24．
［9］齐春梅，张小平，姚昕．嗜热微生物酶的嗜热机制及应用研究进
展．微生物学杂志，2004，24(4) :39-55．
［10］郭春雷，成妮妮，刘明河，等．高温菌 16S rRNA与耐热性关系的
初步研究．微生物学通报，2005，32(5) :114-117．
［11］舒丹，李宏，严建华，等．高温芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵条件及
酶性质研究． 四川大学学报:自然科学版，2004，41(4) :
856-860．
［12］李宏，刘成君，王兰． 高温碱性蛋白酶菌株的选育及酶性质研
究．食品与发酵工业，2005，31(4) :29-32．
［13］翁海波，敬蔚然，杨丹丽，等．产高温碱性蛋白酶菌株筛选及酶
学性质研究．郑州大学学报:工学版，2010，31(1) :70-73．
(责任编辑 李楠)
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