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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦
EPSPS基因的研究
孙传波1 李海华1 郭嘉1 陶蕊1 曲文利1 孟凡梅1
张举仁2 刘文国3 袁英1
(1吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春 130033;2山东大学生命科学学院，济南 250100;3吉林省农业科学院玉米所，长春 130033)
摘 要: 以玉米自交系郑 58 的茎尖为受体，通过农杆菌介导法将抗草甘膦 EPSPS基因转入玉米中，研究以茎尖为受体
的农杆菌转化体系的可行性。98 株转化苗，经过 300 ppm的除草剂(农达)筛选，共获得 13 株转基因植株，经 PCR检测，其中
7株表现阳性，转化率达 7． 14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中，以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转
化是可行、高效的。
关键词: 玉米 茎尖 农杆菌介导 EPSPS 基因
Study on Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation of
EPSPS Gene into Shoot Apical Point of Maize
Sun Chuanbo1 Li Haihua1 Guo Jia1 Tao Rui1 Qu Wenli1 Meng Fanmei1
Zhang Juren2 Liu Wenguo3 Yuan Ying1
(1Biotechnology Research Centre，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033;2College of Life Science，
Shandong University，Jinan 250100;3Maize Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033)
Abstract: The EPSPS gene was transferred into the shoot apical point of maize inbred line zheng 58 by Agrobacterium tumefaciens
mediated transformation to study the feasibility of this system． 13 transgenic plants were obtained after selecting with 300 ppm(nong da)
and 7 of them were confirmed positive by PCR amplification． The frequency of transformation reached about 7. 14% ． This study showed
that the foreign gene was integrated into maize genome and the shoot apical point of maize as receptor in transformation was feasible and
high efficient．
Key words: Maize Shoot apical point Agrobacterium tumefaciens mediated EPSPS gene
收稿日期:2010-09-15
基金项目:抗逆转基因玉米新品种培育项目(2009ZX08003-018B)
作者简介:孙传波，男，硕士，研究方向:玉米遗传转化;E-mail:chuanbosun@ 163． com
通讯作者:袁英，女，研究员，研究方向:玉米遗传转化、分子转化和大豆分子育种;E-mail:yuanying2003@ sohu． com
转基因玉米的方法主要有农杆菌介导法、基因
枪法、花粉管通道法和合子转化法［1］。农杆菌介导
法的受体主要是幼胚和胚性愈伤组织，受体的基因
型决定着遗传转化的成功与否;而愈伤组织形成的
再生植株无性系变异大、周期长［2，3］等影响转基因
苗的获得。因此，选择合适的外植体作为农杆菌转
化的受体，建立不受基因型限制快速、高效的遗传转
化体系是转基因生物技术工作者的目标［4］。目前
在棉花［5］、水稻 、高粱、小麦［6］以及玉米［7］中均有以
茎尖作为农杆菌转化受体的报道。
草甘膦是一种广谱的、内吸传导型的优秀除草
剂［8］，其杀草机理是抑制植物必需氨基酸合成途径
中 5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyru-
vyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的活性，
从而导致杂草死亡［9］。杂草危害是造成玉米减产
的重要因素之一，因此，利用基因工程培育抗除草剂
的玉米新品种是解决这一矛盾的有效途径。本试验
通过农杆菌介导法将抗草甘膦 EPSPS 基因转入玉
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
米自交系郑 58 中，研究以玉米茎尖作为遗传转化受
体的可行性，创建高效、可行的农杆菌转化体系，获
得抗除草剂的优良玉米品系。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物材料 玉米自交系郑 58，由吉林省农
业科学院玉米研究中心提供。
1. 1. 2 植物表达载体 植物表达载体为 pC1390-
EPSPS，含抗草甘膦 EPSPS基因(图 1) ，由吉林省农
科院生物技术研究中心提供。
图 1 pC1390-EPSPS载体结构简图
1. 1. 3 培养基 培养基种类及其成分(表 1)。
表 1 培养基成分
培养基 成分 pH
侵染培养基 1 /2MS盐 + 1 /2MS 维生素 + 100 mg /L 肌醇 +
水解酪蛋白 500 mg /L + 36 g /L 蔗糖 + 68 g /L
葡萄糖 + AS 100 μmol /L + 0. 05% Silweet
5. 2
萌发培养基 1 /2MS + 3%蔗糖 + 0. 7%琼脂 5. 8
YEP培养基 酵母提取物 10 g /L +蛋白胨 10 g /L +NaCl 5 g /L 7. 0
1. 2 方法
1. 2. 1 工程菌的制备 将附有质粒 pC1390-EPSPS
的农杆菌 EHA105 在含利福平 50 mg /L和卡那霉素
50 mg /L的 YEP液体培养基中 28℃震荡培养，培养
至 OD600 = 0. 6，8 000 r /min 离心 5 min 收集农杆菌
菌体，用侵染培养基悬浮至 OD600 = 0. 5 左右，在农
杆菌转化前向重悬液中加入乙酰丁香酮(AS)100
μmol /L和 0. 05% 的表面活性剂 Silweet。
1. 2. 2 玉米茎尖农杆菌转化 挑选整齐饱满的郑
58 种子 110 颗，用 70%的乙醇浸泡 2 － 5 min，然后
用 0. 1% HgCl2浸泡 10 － 15 min，再用无菌水冲洗 4
次。将灭菌种子放在无菌的三角瓶中，加适量无菌
水在培养箱中 25℃黑暗条件下萌发，种子发芽后转
到萌发培养基上继续生长，待苗长至 4 cm时剥离胚
芽鞘和幼叶，暴露出茎尖生长点，用手术刀轻微挫伤
用于转化。将茎尖浸泡在重悬液中并置于真空干燥
器中，在 50 kPa 压力下侵染 7 min。侵染结束后用
无菌滤纸吸净种子上多余的菌液，然后放在萌发培
养基上，25℃黑暗条件下继续培养，直至重新长出新
叶片。
1. 2. 3 转化苗的移栽和筛选 将长出新叶片的转
化苗用清水洗掉菌体后移栽到花盆中，花盆下部为
土壤，上部为 6 － 8 cm厚的蛭石。2 － 3 周后转化苗
长至三叶期，用 300 ppm的除草剂(农达)喷洒在玉
米叶片上进行转化植株的筛选，经过筛选后将存活
的植株移栽到温室中。
1. 2. 4 转化植株的 PCR检测 用 CTAB 法提取玉
米叶片 DNA［10］，然后进行 PCR 检测。根据 EPSPS
基因序列设计合成引物:P1:5-CTCCCACAGGTC-
CTTCATGT-3;P2:5-CTCAGGAGCAAGGAGTCCAC-
3。PCR产物大约 183 bp。扩增程序:94℃，预变性
5 min;94℃变性 1 min，58℃退火 30 s，72℃延伸
30 s，40 个循环;72℃延伸 10 min。
2 结果与分析
2. 1 玉米茎尖农杆菌转化
110 颗种子获得 98 颗萌发苗，在无菌工作台上
剥离胚芽鞘及幼叶，暴露出茎尖生长点，用手术刀轻
微挫伤，然后浸泡在农杆菌侵染液中(OD600 = 0. 5) ，
在 50 kPa压力下侵染 7 min，侵染结束后用无菌滤
纸吸净种子上多余的菌液，放在萌发培养基上，25℃
黑暗条件下继续培养，共获得 98 株转化苗(图 2)。
图 2 转化苗
2. 2 转化苗的除草剂筛选
98 株转化苗，用清水洗掉菌体，移栽到花盆中，
2 周后长至三叶期，经过 300 ppm 的除草剂(农达)
筛选后，共有 13 株幼苗存活(图 3，图 4)。
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2011 年第 3 期 孙传波等:农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦 EPSPS基因的研究
图 3 移栽到花盆中的转化苗
图 4 除草剂筛选
2. 3 转基因植株的分子生物学检测
提取抗性植株叶片的基因组 DNA，进行 PCR 扩
增检测，其中 7 株检测呈现阳性(图 5)。
M． DL2000 Marker;+ ．阳性对照;－ ．阴性对照;1－7．转基因植株
图 5 转基因植株 PCR分析
3 讨论
以玉米茎尖为受体的农杆菌介导的遗传转化，
不需经过繁琐的组织培养过程，也不受基因型限制，
为玉米的遗传转化拓宽了受体材料的类型。与本实
验室以传统的幼胚及其胚性愈伤组织为受体遗传转
化体系相比，此种方法具有简便、快速、工作效率高
和试验周期短等优点，与基因枪法相比更经济实用，
与合子转化相比取材不受季节限制。以茎尖为受体
的缺点是获得的转基因后代嵌合体较多，得到纯和
稳定的转基因品系困难较大。
本试验以玉米自交系郑 58 的茎尖分生组织为
受体，通过农杆菌介导法将 EPSPS 基因转入其中。
相比较本实验室用于愈伤诱导的自交系 H99，郑 58
萌发芽率高、发苗整齐、幼苗比较健壮、容易剥离胚
芽鞘及幼叶获得茎尖分生组织。试验中 110 颗郑
58 的种子经过农杆菌转化后得到 98 株转化苗，得
到的转化苗用 300 ppm的除草剂(农达)筛选后获得
13株抗性植株，经过 PCR 分子检测后，其中 7株表现
为阳性，抗性植株的阳性率高达 53. 85%，该体系的转
化率(阳性植株 /转化苗)为 7. 14%，高于本实验室的
以愈伤组织为受体的传统转化体系，这可能得益于以
茎尖为受体。在整个试验中从种子萌发到转基因植
株的获得所需时间大约 1个月，明显少于通过组织培
养体系获得转基因苗的时间;而且在整个试验中不需
要分化、再生阶段，更没有抗生素对受体带来的伤害，
转基因植株结实率和郑 58 相比没有差别，这较有利
于转基因后代的遗传分析。影响整个转化体系的因
素很多，我们还要对该系进行优化，并对转基因后代
的分析具体化，得到相关的分子试验和田间试验证
据，建立一套完善的芽尖遗传转化体系。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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