全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
醋酸钙不动杆菌 PHEA2苯酚降解调控蛋白 MphR
化学信号域的研究
彭子欣1 于海英1, 2 战嵛华 1 陈明 1 林敏 1 张维 1
( 1中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081; 2中国农业大学生物学院,北京 100193)
摘 要: M phR是醋酸钙不动杆菌 PH EA2调控苯酚代谢的激活蛋白。通过分析苯酚羟化酶启动子的 lacZ 融合子
( Pm phK: : lacZ )在 21种苯酚及苯酚衍生物诱导时的 半乳糖苷酶活性, 确定了调控蛋白 M phR化学信号域可以识别苯酚,邻甲
酚, 间甲酚,邻氯苯酚等酚类衍生物。大肠杆菌中逐段截短 M phR化学信号域试验证实, 当化学信号域截短后, MphR受苯酚
诱导激活转录的功能丧失。结果表明,化学信号域对于苯酚激活转录功能极为重要。
关键词: 醋酸钙不动杆菌 PHEA2 M phR 效应物识别谱 半乳糖苷酶活性
The Study of SignalReceiver Domain of Phenol Regulator in
Actnetobacter calcoaceticus PHEA2
Peng Z ix in
1 Yu H aiying1, 2 Zhan Yuhua1 Chen M ing1 L inM in1 ZhangW ei1
(
1
B io techo logy Research Institute, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;
2
College of B iology Science, China A gricultural University, Beijing 100193)
Abstrac:t M phR is a positiv e regulator of pheno l hydroxy lase gene ( mphKLMNOP) o fAcinetobacter calcoaceticus PHEA2. T ran
scriptional ana ly sis us ing PmphK: : lacZ fusions revealed that, of 21 tested compounds, pheno ,l creso ,l m cresol and 2ch lo ropheno l et
a.l stim ulated the transcription o f m phK gene in the presence o f m phR gene as effec tors. De letion ana ly sis the Adoma in o f M phR
show ed tha t no ac tiv ities w ere de tected in anyM phR deletions independent o f the presence or absence of pheno.l The results showed that
the A dom a in ofM phR was essential fo r the transc ription o f phenol hydroxy lase gene.
Key words: A cinetobacter calcoaceticus PHEA2 M phR Inducer spectrum galactosidase activ ity
收稿日期: 20100323
基金项目:国家自然科学基金 ( 30770076 ),国家转基因生物新品种培育重大专项课题 ( 2008ZX08012001)
作者简介:彭子欣,女,博士研究生,研究方向:微生物基因工程; Em ai:l pengzix in1982@ 163. com
通讯作者:张维, Em ai:l zhwmm@ caas. net. cn
苯酚等芳香族化合物通常发现于工业污水中,
它对人类的身体健康和生态环境都有直接或潜在的
危害。美国环境保护局 ( EPA )将其中的 11种列入
优先污染物, 包括 2氯苯酚、2, 4二氯苯酚、2, 4, 6
三氯苯酚、五氯苯酚、4氯3甲基苯酚、2, 4二甲基
苯酚、2硝基酚、4硝基酚、2, 4二硝基酚和 2甲基
4, 6二硝基酚 [ 1]。我国也将苯酚列入中国环境优先
污染物 黑名单之中 [ 2]。
利用某些微生物把苯酚类污染物降解为水和二
氧化碳是清除苯酚对环境不利影响的有效途径之一。
迄今,已克隆的多组分苯酚羟化酶基因簇有约 10个,
其中包括 P seudomonas sp. CF600的苯酚降解基因簇
dmp
[ 3]
; Comamonas testosteroni TA441的苯酚降解基
因簇 aph[ 4] ; A. calcoaceticus NC IB8250的苯酚羟化酶
基因簇 mop[ 5]和本研究室克隆的 Acinetobacter cal
coaceticus PHEA2的苯酚羟化酶基因簇 mph[ 6]。
苯酚羟化酶基因一般都由调控基因 R和结构
基因 KLMNOP组成,结构基因的转录由调控基因调
控。苯酚羟化酶基因的调控蛋白 R是 XylR /DmpR
型调控蛋白 [ 3- 6]。这种调控蛋白由 4个独立的结构
域组成:位于调控蛋白 N端的化学信号域 ( A域 )负
责感应化学效应物,并且对 ATP活性域 ( C域 )有阻
2010年第 10期 彭子欣等 :醋酸钙不动杆菌 PHEA2苯酚降解调控蛋白 M phR化学信号域的研究
遏作用; B域连接 A域和 C域, 在 A域对 C域的阻
遏和脱阻遏过程中起着重要的作用;位于蛋白 C端
的 D域是 DNA结合域, 含有一个螺旋 -转角 -螺
旋 (H TH )结构, 在调控过程中使调控蛋白结合在
降解基因的启动子上 [ 7]。
Xy lR /DmpR型调控蛋白的结构决定了其调控
芳香族化合物降解的功能。当化学效应物结合 Xy
lR /DmpR型调控蛋白的 A域后, A域对 C域的阻遏
功能被解除, 使 C域的活性面暴露出来,接着 C域
结合和水解 ATP。水解 ATP释放出的能量使调控
蛋白多聚化成六聚体,然后这个六聚体结合于启动
子上游的增强子序列 (UAS)并激活结合于降解基因
启动子 - 24 /- 12序列的 54RNA聚合酶成为转录
活性状态,起始降解基因的转录 (图 1) [ 8]。
图 1 XylR /Dm pR型调控蛋白各个结构域的功能
综上所述, XylR /DmpR型调控蛋白的化学信号
域在调控芳香族化合物降解过程中起着极为重要的
作用: 识别特异的芳香族化合物和使 C域脱阻遏。
研究人员通过突变化学信号域的氨基酸来扩大 Xy
lR /DmpR调控蛋白的效应物识别范围 [ 1]。另外,研
究发现 Xy lR, TouR的 A域缺失突变株在没有效应
物诱导的情况下也可以激活相应启动子的转录,这
为 XylR /DmpR型调控蛋白的 A域对 C域有阻遏功
能提供了直接证据 [ 9]。
本实验室于 2000年从北方某炼油厂排出的废
水中分离到一株高效降解苯酚的菌株醋酸钙不动杆
菌 PHEA2, 徐玉泉等 [ 6]克隆到了苯酚羟化酶基因
(mph)及其调控基因 mphR。在本研究中我们确定
了调控蛋白 MphR的效应物识别谱, 并通过逐段截
短 M phR的化学信号域研究了化学信号域在转录调
控中的作用。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株,质粒与引物 醋酸钙不动杆菌 (Acine
tobacter calcoaceticus PHEA2)为本实验室分离保藏;
大肠杆菌 DH5购自 TaKaR a公司; 质粒 pET28a购
自 N ovagen公司; 启动子检测载体 pPR9TT由陈三
凤教授馈赠。引物由三博远志生物技术公司合成。
1. 1. 2 酶和试剂 限制性核酸内切酶, T4 DNA连
接酶均购自于 NEB (北京 )公司。其它试剂均为国
产分析纯。
1. 1. 3 培养基 大肠杆菌培养基 LB; 限制性培养
基的组成是: K2HPO4 1 g /L, ( NH4 ) 2 SO4 1 g /L, M g
SO4 H2O 0. 2 g /L, FeC l3 0. 02 g /L, NaC l 0. 1 g /L,
C aC l2 0. 1 g /L, 5 mmo l/L乳酸钠, pH7. 6, 按试验需
要苯酚的终浓度为 2mmol /L或 0. 25 mmo l/L,苯酚
衍生物的浓度为 0. 25 mmo l/L。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌株总 DNA的分离 挑取单菌落接种于
5mL培养基中, 37 过夜培养。取 1 mL菌液离心沉
淀菌体,沉淀重悬于 550 L 1 TE中;加 17 L溶菌
酶 ( 35mg /mL), 37 温育 30 m in; 加 3 L蛋白酶 K
( 20mg /mL) , 37 温育 30m in;加 30 L 10% SDS,
37 温育 30m in;加 100 L 5mo l/L NaC l充分混匀;
加 80 L CTAB /NaC l溶液,混匀, 65 水浴 10m in;加
等体积苯酚氯仿异戊醇 ( 25241),抽提蛋白两次;
乙醇沉淀回收总 DNA。
1. 2. 2 苯酚降解调控基因 mphR及其 A域逐段截
短的质粒的构建与转化 根据已知苯酚羟化酶调控
基因 mphR的序列设计引物 (表 1) ,两端分别插入
酶切位点 Nde I和 Sal I。以基因组为模板, PCR扩
增出全长 1. 7 kb的苯酚降解调控基因 mphR及 A
87
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
域逐段截短 (从 N端开始分别截去 60, 121, 241,
328, 421, 481, 541, 643个碱基 )的截短突变基因。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收, 用 Nde I和
Sal I双酶切,同时将质粒 pET28a酶切。T4DNA连
接酶将已双酶切的 pET28a和 PCR产物在 4 过夜
连接。连接产物转化大肠杆菌 DH5,涂布在 LB平
板上, 37 培养 16 h, 得到重 组质粒 pEMR,
pEMR20, pEMR40, pEMR80, pEMR109, pEMR140,
pEMR160, pEMR180,和 pEMR214。
表 1 扩增 mphR基因及其 A域逐段截短的突变基因所用引物的序列
引物名称 引物序列 ( 5- 3) 说明
MPHREX1 CCGCATATGGCTCGAGTAAAATACGATAC
MPHREX61 CCGCATATGGATTTGCTGTCTAAATTGTACT
MPHREX121 CCGCATATGCGGATGCTGCTTTTACACA
MPHREX241 CCGCATATGGCAGAAGTTACTACAAAAATGC
MPHREX328 CCGCATATGATGGTGCAAGTACAGGCCAAC
MPHREX421 CCGCATATGGTGCATTTAGAGCATTTTGG
MPHREX481 CCGCATATGGCGTGCGGCTACAGTAGTT
MPHREX541 CCGCATATGAAAGCTTGCGGCGATGAGCA
上游引物
MPHREX1671 GCGTCGACACTCAAAGCTGAAATTTTTTAATTC 下游引物
1. 2. 3 苯酚羟化酶基因启动子 PmphK的重组质粒
pPR9P的构建与转化 PCR获得苯酚羟化酶基因
mphK和 mphR基因之间的 0. 45 kb的区域, 所用引
物是 PXho I1: 5CGCCTCGAGGAGTGATCTGTTT
TAATCC3和 PP st I4: 5CCTTCTGCAGTCGAAT
TCGATAAACTCTG3,分别引入酶切位点 Xho I和
P st I (下划线部分 )。PCR产物回收后,用 Xho I和
P st I双酶切,同时将启动子检测载体 pPR9TT酶切。
得到的连接产物即是带有转录融合子 PmphK : : lacZ
的重组质粒 pPR9P。将重组质粒 pPR9P转入醋酸
钙不动杆菌 PHEA2, 构建的菌株命名为 PHEA2
( PmphK: : lacZ ) ; 同时将 pPR9P和 pET28a, pEMR,
pEMR20, pEMR40, pEMR80, pEMR109, pEMR140,
pEMR160, pEMR180, pEMR214分别共转化大肠杆
菌 DH5,得到 10株带有 2个质粒的共转化大肠杆
菌, 分别命名为 PETRP, PEMRP, PEMRP20, PEM
RP40, PEMRP80, PEMRP109, PEMRP140, PEM
RP160, PEMRP180, PEMRP214。
1. 2. 4 半乳糖苷酶活性分析 挑取单菌落,接种
于 LB液体培养基中培养到菌的 OD600值达到 0. 6以
上;加入相应的酚类或酚类化合物继续诱导 2 h,取适
量菌液, 4 , 5 000 g离心 5 m in, 弃上清, 用无菌水
洗两次,弃上清。按需要重新悬浮菌体;菌体悬浮液
与 buffer Z混合,使总体积为 1 mL, 加入 2 - 3滴氯
仿,混匀。开盖于 37 保温 40 m in; 转入 30 保温
5m in,之后加入 200 L( 4. 0 mg /mL)邻硝基苯 D
半乳吡喃糖苷 ( ONPG) ,混匀后 30 继续保温,开始
反应,记录反应起始时间。待样品出现黄色, 再加入
500L 1mo l/L的 N a2CO3终止反应,记录反应终止时
间,样品放冰上待测。用岛津 UV160A型紫外分光
光度计测定 OD420, OD550和 OD600值。
按以下公式计算 半乳糖苷酶的活性:
酶活 = 1 000 OD 420 - 1. 75 OD550
T V OD600
其中, T为反应时间, V为反应中菌体体积。
2 结果与分析
2. 1 苯酚降解调控蛋白 M phR的结构域分析
苯酚降解调控基因 mphR长 1 671 bp,编码 556
个氨基酸,蛋白分子量 63 kD。将MphR的碱基序列
和氨基酸序列分别在 GenBank数据库中比对, 发现
MphR和 Xy lR /DmpR细菌转录激活蛋白 ( EBR )有
很高的相似性,与 MopR同源性最高, 碱基序列同源
性达到 68. 45% , 氨基酸同源性达到 78. 75%。将
MphR和其它 14种 Xy lR /DmpR家族的调控蛋白的
88
2010年第 10期 彭子欣等 :醋酸钙不动杆菌 PHEA2苯酚降解调控蛋白 M phR化学信号域的研究
氨基酸序列进行多序列比对,根据 XylR /DmpR调控
蛋白的结构域特点, 可将 MphR蛋白的氨基酸序列
分为 4个结构域 (图 2) [ 10 ]。A域, B域, C域和 D域
分别有 214, 28, 240和 43个氨基酸。这 4个结构域
与 M opR的 4个结构域的同源性分别为 70% , 61% ,
79% , 52%。已有的研究显示, 不同的 XylR /DmpR
调控蛋白 A域之间的同源性最低, C域最为保守,同
源性最高 [ 7]。我们的研究发现 MphR和 MopR之间
C域同源性最高, DNA结合域 ( D域 )的同源性最为
保守,而 A域同源性较高。
图 2 M phR的 4个结构域的示意图
2. 2 苯酚降解调控蛋白 MphR化学信号域 ( A域 )
效应物识别谱的鉴定
调控蛋白的效应物识别谱是调控蛋白的重要特
性之一。被调控蛋白识别的效应物可以是其代谢底
物、代谢中间产物、代谢底物或中间产物的结构类似
物等 [ 7]。调控蛋白可以识别的效应物的种类取决
于效应物芳香环上的取代基的性质、取代位置和取
代个数 [ 1]。
本研究中, 我们将含有苯酚羟化酶基因启动子
和 半乳糖苷酶基因的融合子 PmphK: : lacZ的质粒
pPR9P转入醋酸钙不动杆菌 PHEA2中, 构建了
PHEA2( PmphK: : lacZ )菌株。效应物诱导时, M phR
可以激活 PmphK : : lacZ的转录,通过测定 半乳糖苷
酶的酶活确定 M phR的效应物识别谱。本研究鉴定
了包括苯酚在内的 21种苯酚衍生物对调控蛋白
MphR的诱导作用,酶活测定结果见表 2。表 2中结
果显示,除 MphR的代谢底物苯酚外, 邻苯二酚、邻
氯苯酚、间氯苯酚、对氯苯酚、邻氨基酚、间氨基酚、
邻甲酚和间甲酚也可激活 MphR。此外,苯酚、邻氯
苯酚、邻甲酚和间甲酚具有相对较高的激活能力,邻
苯二酚、间氯苯酚、对氯苯酚、邻氨基酚、间氨基酚具
有相对较弱的激活能力。
表 2 MphR蛋白对苯酚及苯酚衍生物的酶活
苯酚及其衍生物 酶活 (U ) 苯酚及其衍生物 酶活 ( U)
CK 3. 4 0. 4 对硝基酚 4. 1 0. 6
邻苯二酚 47. 8 2. 9 2, 4二硝基酚 2. 0 0. 2
间苯二酚 1. 9 0. 9 对硝基邻苯二酚 2. 6 0. 3
对苯二酚 2. 8 0. 7 邻氨基酚 51. 6 6. 3
邻氯苯酚 107. 5 11. 1 间氨基酚 21. 0 6. 2
间氯苯酚 32. 1 15. 4 对氨基酚 4. 4 0. 3
对氯苯酚 73. 1 14. 4 邻甲酚 208. 2 23. 4
2, 4二氯苯酚 3. 4 1. 3 间甲酚 138. 4 14. 8
2, 4, 6三氯苯酚 2. 5 0. 8 对甲酚 4. 7 0. 8
邻硝基酚 2. 2 0. 2 间苯三酚 2. 1 0. 0
间硝基酚 2. 1 0. 2 苯酚 259. 2 33. 4
89
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
2. 3 MphR可以在大肠杆菌中激活苯酚羟化酶启
动子 Pm phK转录
将构建的含有 mphR完整基因的质粒 pEMR,
含有苯酚羟化酶启动子和 半乳糖苷酶基因融合
子 PmphK : : lacZ的质粒 pPR9P同时转化大肠杆菌
DH5,得到共转化菌 PEMRP。在 2mmol /L苯酚诱
导下, PEMRP的 半乳糖苷酶活性是 220. 5 U, 无
苯酚诱导时, 半乳糖苷酶活性仅为 2. 7 U。空载
体 pET28a和质粒 pPR9P共转化大肠杆菌 DH5,
得到 PEMRP的阴性对照菌 PETRP, 无论有没有苯
酚诱导,对照菌株 PETRP均没有 半乳糖苷酶活性
(小于 2. 0 U )。结果表明,苯酚降解调控蛋白 MphR
在苯酚存在时可以在大肠杆菌中激活苯酚羟化酶启
动子 PmphK的转录活性。
2. 4 N端截短分析 MphR调控蛋白
从 MphR A域的 N末端开始分别截短 20, 40,
80, 109, 140, 160, 180, 214个氨基酸, 获得阳性对照
菌株 PEMRP一系列的 A域逐段截短突变株, 其中
PEMRP214是 A域全部截短的突变株 (图 3)。通过
测定 MphR的 A域截短突变株的 半乳糖苷酶活
性, 我们发现这些突变株的酶活完全消失 (表 3), 没
有出现像 Xy lR, TouR的 A域缺失突变株在没有效
应物诱导的情况下也可以激活相应启动子转录的现
象。我们推测 MphR的 A域截短突变蛋白在细胞
质中不稳定或 MphR的 A域不能对 C域起抑制
作用。
图 3 MphR蛋白的 A域截短示意图
表 3 A域截短 MphR突变体的 半乳糖苷酶活值
M phR蛋白
半乳糖苷酶酶活 (U )
有苯酚诱导 无苯酚诱导
pEMR 220. 5 10. 5 2. 7 0. 5
pEMR20 3. 5 0. 7 2. 8 0. 4
pEMR40 4. 1 0. 6 3. 9 0. 7
pEMR80 3. 5 0. 9 3. 2 0. 6
pEMR109 4. 0 0. 8 3. 3 0. 4
pEMR140 3. 1 0. 4 3. 5 0. 7
pEMR160 3. 8 0. 7 2. 9 0. 3
pEMR180 3. 4 0. 5 3. 2 0. 7
pEMR214 3. 0 0. 4 2. 7 0. 8
3 讨论
调控蛋白 MphR是调控苯酚代谢的激活蛋白,
它控制苯酚羟化酶基因 mphKLMNOP的转录,表达
产物苯酚羟化酶可以转化苯酚为邻苯二酚, 邻苯二
酚进入邻位开环裂解途径降解为水和二氧化碳等无
机物, 因此苯酚羟化酶是苯酚降解的第一个重要的
降解酶 [ 6]。将 MphR的氨基酸序列在 GenBank数据
库中比对,发现 MphR和 Xy lR /DmpR细菌转录激活
蛋白有很高的相似性。Xy lR /DmpR细菌转录激活
蛋白有 4个结构域,不同调控蛋白的化学信号域 ( A
域 )同源性最低, 在激活启动子转录中起着识别化
学效应物和阻遏 /脱阻遏 C域的功能 [ 7]。因此研究
调控蛋白的化学信号域对于认识调控蛋白的功能和
特点具有重要的意义。
通过对 MphR的效应物识别谱的鉴定, 可以看
出邻位取代基化合物相对于间位、对位取代基化合
物对 MphR有更高的识别活性, 这说明 MphR A域
的化学效应物活性中心对于苯酚的邻位取代基更为
敏感。而硝基类苯酚不能激活 MphR,这说明 MphR
化学信号域的活性中心的氨基酸残基对于硝基不敏
90
2010年第 10期 彭子欣等 :醋酸钙不动杆菌 PHEA2苯酚降解调控蛋白 M phR化学信号域的研究
感。M phR对于多取代基苯酚 2, 4二氯苯酚、对硝
基邻苯二酚、2, 4, 6三氯苯酚、2, 4二硝基酚, 对硝
基邻苯二酚、间苯三酚都没有感应活性,我们推测多
取代基酚类衍生物的结构较大, 使之不能进入
M phR化学信号域的活性中心。
M phR可以识别的邻苯二酚,邻氯苯酚, 间氯苯
酚,对氯苯酚,邻氨基酚,间氨基酚,邻甲酚,间甲酚,
苯酚等化合物都对环境和生物体有毒害作用, 特别
是邻甲酚和间甲酚是农药的中间体, 对环境有很大
的污染。邻氯苯酚是美国环境保护局 ( EPA )优先污
染物黑名单中的化学物质 [ 1]。
M phR的 A域和另外两株苯酚降解菌醋酸钙不
动杆菌 NC IB8250的 MopR, 斯氏假单胞菌的 DmpR
的 A域的同源性分别是 70%和 41% ,但是它们的效
应物识别谱却不同, M opR可以识别苯酚, 间氯苯
酚,邻甲酚, 间甲酚 [ 5] ; DmpR可以识别苯酚, 邻甲
酚,间甲酚, 对甲酚, 3, 4二甲酚 [ 11 ]。因此, M phR在
对于邻苯二酚,邻氯苯酚,邻氨基酚, 间氨基酚的识
别上具有优势。
Xy lR /DmpR型调控蛋白识别特异的芳香族化
合物, 激活降解基因启动子转录的特性,常被用来构
建可以检测环境中的污染物的全细胞生物感应
器 [ 1]。全细胞生物感应器是一种快捷、简便、便宜、
高效的检测环境中有害物质的方法。迄今为止已有
多种全细胞生物感应器被发明出来, 可以用来检测
环境中的芳香族化合物、重金属等有害物质 [ 1 ]。这
种检测方法是利用细菌产生的信号来检测环境中存
在的污染物的。全细胞生物感应器的构建是将报告
基因放在可诱导的启动子之下,当调控蛋白识别到
诱导物时,报告基因可以提供一个可测的信号来检
测样品中有害物质的存在。全细胞生物反应器中调
控蛋白的效应物识别谱决定了生物反应器对芳香族
化合物的识别范围 [ 6]。
研究人员发现通过突变 XylR /DmpR型调控蛋
白的化学信号域可以使蛋白的效应物识别谱改变,
使调控蛋白扩展了野生型不能识别的效应物。W ise
等利用易错 PCR突变改变 DmpR的化学信号域产
生的 7个突变株可以检测 2氯酚、2, 4二氯酚、4氯
三甲基酚、2, 4二甲酚、2硝基酚和 4硝基酚 [ 1 ]。因
此,我们在以后的研究中也可以将 MphR蛋白的 A
域突变,使其可以识别更多的酚类污染物。
截去 XylR, DmpR, M opR, TouR的 A域发现, A
域缺失的这些突变的调控蛋白可以组成型的激活相
应启动子的转录, 并且这些突变的调控蛋白表达的
酶活性和野生型几乎一致 [ 5, 9, 12, 13]。逐段截短 Xy lR
的 A域发现, 160- 210亚域可以在没有诱导物时有
效地阻遏 XylR蛋白的调控活性 [ 9]。过量表达 Mo
pR蛋白的 A域发现野生型 MopR的诱导活性被完
全抑制。逐段截短 M opR的 A域发现,当截去 110
个氨基酸时,突变的 A域对野生型 MopR还存在阻
遏功能, 当截去 150个氨基酸时, 这种阻遏功能消
失,研究人员推测当截去 150个氨基酸后, 截短的 A
域在细胞质中变得不稳定, 或对 C域的阻遏功能
消失 [ 5]。
MphR的 A域截短试验结果表明,当截短 A域
后, M phR的调控活性完全丧失,甚至 N端只截去 20
个氨基酸时 M phR对苯酚的调控活性就已完全消
失。我们推测,截短的调控蛋白在细胞中的表达可
能不稳定,或前 20个氨基酸中就有识别苯酚的关键
位点。在以后的试验中我们将一步点突变 MphR的
A域,进一步研究 A域在转录调控中的功能。
Xy lR /DmpR型调控蛋白的识别化学效应物和
阻遏 /脱阻遏 C域的功能可以使细菌的降解基因
经济有效 的表达, 即没有效应物时, A域对 C域
起阻遏作用, 这样 C域不能结合和水解 ATP, 调控
蛋白处于无活性状态,不能激活苯酚羟化酶基因的
转录; 而在周围环境有效应物存在时, A域结合苯
酚, 接着对 C域的阻遏功能解除, 这样 C域可以结
合和水解 ATP,使调控蛋白从无活性形式变成活性
形式,激活苯酚羟化酶基因的转录。本研究确定了
醋酸钙不动杆菌 PHEA2苯酚降解调控蛋白 MphR
的化学效应物诱导谱, 逐段截短 MphR的化学信号
域, 为进一步研究 MphR的功能奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1 ] W ise AA, Ku ske CR. Generat ion of novel b acterial regu latory p ro
teins that detect p riority po llutan t pheno ls. App lE nvironM icrob io,l
2000, 66( 1 ): 163169.
[ 2] 金相灿,等.有机化台物污染化学:有毒有机物污染化学 [M ].北
京:清华大学出版社, 1990: 250.
[ 3 ] Pow low sk i J, Sh ing lerV. In vitro analys is ofpo lypep tide requ irem ents
91
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
ofm ult icomponent phen ol hydroxylase from P seudom ona s sp. strain
CF600. J Bacterio,l 1990, 172( 12 ) : 68346840.
[ 4] AraiH, Oh ish iT, ChangMY, Kudo T. Arrangem ent and regu lat ion of
the genes form e tapathw ay enzym es requ ired for d egradation of phe
nol in C omam onas testosteron i TA441. M icrob iology, 2000, 146 ( Pt
7) : 17071715.
[ 5] Sch irm er F, Eh rt S, H il lenW. Exp ression, inducer spectrum, dom ain
stru cture, and function ofM opR, the regu lator of pheno l degradat ion
inA cin etobac ter calcoace ticusNC IB 8250. JB acterio,l 1997, 179( 4) :
13291336.
[ 6] Xu Y, C henM, ZhangW, L inM. Gen et ic organ izat ion of genes enco
d ing ph enol hydroxylase, benzoate 1, 2d ioxygenase alpha subun it
and its regulatory p roteins in Ac ine tobacter ca lcoa ce ticu s PHEA2.
C urrM icrob io,l 2003, 46( 4 ) : 235240.
[ 7 ] D iaz E. B acterial degradat ion of arom atic pol lutan ts: a parad igm of
m etabo lic versat ility. In tM icrob io,l 2004, 7( 3 ) : 173180.
[ 8] Tropel D, van der M eer JR. Bacterial tran scrip tional regu lators for
degradat ion pathw ays of arom atic com pounds. M icrob iol M ol B iol
Rev, 2004, 68 ( 3) : 474500.
[ 9] PrezM artn J, De LorenzoV. The am inoterm ina ldom ain of the p ro
karyotic enhancerb ind ing p rotein XylR is a specific in tram olecu lar
rep ressor. Proc NatlA cad SciUSA, 1995, 92 ( 20) : 93929396.
[ 10] JaspersMC, Su ske WA, S chm id A, et a.l H bpR, a n ew m ember of
th e XylR /DmpR subclassw ith in the N trC fam ily of b acterial tran
scrip tional act ivators, regu lates exp ress ion of 2hydroxyb iphenylm e
tabolism in P seudomona s azelaica HBP1. J Bacterio,l 2000, 182
( 2) : 405417.
[ 11 ] PavelH, Forsm an M, Shingler V. An arom at ic effector specif icity
m utan t of the transcript ional regu lator Dm pR overcom es th e grow th
con strain ts of P seudom onas sp. strain CF600 on parasub stituted
m ethy lphenols. J Bacterio,l 1994, 176( 24 ): 75507557.
[ 12] Ng LC, ON eill E, Sh ingler V. Genetic ev idence for interdom ain
regu lation of the phenolrespon sive f inal s igm a54depend ent activa
tor Dm pR. J B iolC hem, 1996, 271( 29 ): 1728117286.
[ 13] A rengh iFL, Barb ieri P, Berton iG, de Loren zo V. New ins igh ts in to
th e activation of oxylene b iodegradat ion in P seudom onas stu tzeri
OX1 by pathw ay substrates. EMBO Rep, 2001, 2( 5 ) : 409 414.
(上接第 85页 )
[ 31 ] C elik erMY, W ang M, A ts idaftos E, et a.l Inh ib it ion ofW i lm s tum or
grow th by intram uscu lar adm in istrat ion of tissue inh ib itor ofm etallo
proteinases4 p lasm id DNA. On cogene, 2001, 20: 43374343.
[ 32 ] Lee SC, W uC J, Wu PY, et a.l Inh ib it ion of estab lish ed subcu tan eous
and m etastat ic mu rine tum ors by intram uscu lar electroporat ion of the
in terleuk in12 gene. B iom ed S c,i 2003, 10 ( 1) : 7386.
[ 33 ] H eller LC, Ingram SF, LucasML, et a.l E ffect of electrically m ed ia
ted in tratum or and intramu scu lar delivery of a plasm id en cod ing IFN
alpha on vis ib le B16m ou sem elanom as. T echnol Can cer ResT reat,
2002, 1 ( 3) : 205209.
[ 34 ] Kh an AS, Anscom be IW, C umm ings KK, et a.l E f fects of p lasm id
m ed iated grow th horm on ereleasing horm one supp lem entation on LL
2 adenocarcinom a in m ice. M olTh er, 2003, 8: 459466.
[ 35 ] Jazow ieckaRakus J, Jarosz M, S zala S. Com b ination of vasostat in
gene therapy w ith cyclophospham ide inhibits grow th of B16 ( F10 )
m elanoma tum ou rs. Acta B ioch im Po,l 2006, 53( 1 ) : 199202.
[ 36 ] Ogris M, Wagner E. Target ing tumors w ith nonviral gene delivery
system s. Drug D iscov T oday, 2002, 7( 8) : 479485.
[ 37 ] Lu casML, H eller R. Imm unom odu lat ion by electrical ly enhan ced de
livery of p lasm id DNA en cod ing IL12 to mu rine skeletal muscle.
M ol Th er, 2001, 3: 4753.
92