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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
曼氏无针乌贼 GT微卫星位点的筛选
吴璋 张晓菊 蒋霞敏 薛良义
(宁波大学生命科学与生物工程学院，宁波 315211)
摘 要: 采用链霉亲和素包被的磁珠富集法筛选曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)微卫星位点。试验样品来自舟山六
横岛，提取 4 个样品的 DNA混合成 DNA pool，用限制性内切酶 Sau 3A I酶切。接上接头后构建基因组 PCR文库，用生物素标
记的(GT)15探针筛选。将筛选获得目的片段进行 PCR扩增，连接 pMD18-T载体，转入 DH5α感受态大肠杆菌里，扩大培养后
PCR筛选阳性克隆。总共选取 278 个克隆，对 120 个经过检测含有插入片段的克隆进行测序，发现 102 个克隆含有微卫星序
列，阳性克隆比率为 85%。除去重复测序和侧翼链不足的序列，可以设计引物的微卫星序列有 64 条。
关键词: 曼氏无针乌贼 微卫星 磁珠
Isolation of GT Microsatellite Loci from Sepiella maindroni
Wu Zhang Zhang Xiaoju Jiang Xiamin Xue Liangyi
(Faculty of Life Science and Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211)
Abstract: Microsatellites are now widely applied in genetic studies even though they are relatively difficult to obtain． In this ex-
periment，biotinylated magnetic beads are used to enrich microsatellite loci of Sepiella maindroni． DNA pool，which is mixed from genetic
DNA of 4 different individuals derived from Liuheng island of Zhoushan，was digested by restriction endonuclease Sau 3A I． After liga-
tion of specific adaptor，digested fragments were amplified via PCR to construct a DNA library，from which microsatellites were enriched
using(GT)15 biotin labeled probe and magnetic beads． The captured fragments containing microsatellites were amplified，inserted into
pMD18-T vector，transferred into DH5α and then PCR examined． 120 positive clones in total 278 were sequenced and 102 clones
(85%)showed the existence of microsatellites． Among them，64 microsatellite sequences are available to design primers and conduct
further researches．
Key words: Sepiella maindroni Microsatellite Magnetic beads
收稿日期:2010-09-17
基金项目:浙江省重大专项(2007C12061) ，国家农业成果转化项目(2009GB2C220415)
作者简介:吴璋，男，硕士研究生，研究方向:鱼类分子生物学;E-mail:alexanderwuzhang@ yahoo． cn
通讯作者:薛良义，男，博士，教授，研究方向:水产生物分子生物学;E-mail:xueliangyi@ nbu． edu． cn
曼氏无针乌贼属软体动物门(Mollusca)、头足
纲(Cephalopoda)、鞘亚纲(Coleoidea)、乌贼目(Sepi-
oidea)和乌贼科(Sepiidae) ，在我国沿海有广泛分
布［1］，是一种具有较高经济价值和营养价值的优良
品种。由于对近海渔业资源的过度开发捕捞以及生
态环境的恶化，20 世纪 80 年代后期，特别是 90 年
代以来，曼氏无针乌贼的资源退化十分严重，产量急
剧下降［2］。因此，加强对曼氏无针乌贼资源的保护
和合理开发利用是十分有必要的。
微卫星(microsatellite)作为近年来被广泛利用的
分子标记，有着许多优于其他分子标记的特性。微卫
星标记多态性高［3］和信息量丰富，而且微卫星标记是
共显性标记。因此，它能够用于研究等位基因，区分
二倍体(或多倍体)的纯合体或杂合体，这是 AFLP、
RAPD等显性标记所无法做到的［4］。同时，它被广泛
应用到群体多态性检测［5，6］和遗传连锁图谱的构
建［7 － 9］。受限于侧翼序列的分离，微卫星的获得一直
是研究过程中的一个难点。获得微卫星标记的方法
有如下几个:从数据库中查找已知微卫星序列，如
Cho［10］通过查找数据库获得了水稻基因组的 194 个
微卫星标记，徐鹏等［11］在中国对虾 ESTs数据库发现
微卫星序列 229 条;从其他物种获得微卫星引物，如
2011 年第 3 期 吴璋等:曼氏无针乌贼 GT微卫星位点的筛选
林凯东［12］用鲤鱼(Cyprinus carpio)的 20 对微卫星引
物对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)基因组进行扩
增，发现扩增出特异性条带的有 7 对;从基因组 DNA
中筛选微卫星位点。由于曼氏无针乌贼的遗传学背
景几乎为空白，因此在数据库中无法找到有关曼氏无
针乌贼微卫星序列的信息。本研究利用磁珠法获得
曼氏无针乌贼的微卫星，供以后的遗传学研究之用。
1 材料与方法
1． 1 曼氏无针乌贼基因组 DNA的提取
试验所需曼氏无针乌贼样本采自舟山六横岛野
生群体。取 4只乌贼个体，分别剪取肌肉组织 0． 1 g
放入 1． 5 mL离心管，加入 500 μL裂解液(10 mmol /L
Tris-HCl，100 mmol /L EDTA，10 mmol /L NaCl，1%
SDS，调节 pH值到 8． 0) ，将肌肉组织于离心管中充分
剪碎，加入 25 mg /mL 蛋白酶 K 5 μL，65℃水浴直到
肌肉完全溶解。稍微冷却后，加入等体积的饱和酚，
充分混合均匀，于 4℃，10 000 r /min 离心 10 min;小
心移取上清液于新灭菌的离心管中，再次加入等体积
饱和酚抽提 1 次。取上清，加入等体积的饱和酚∶氯
仿∶异戊醇(25∶ 24∶ 1) ，充分混匀，于 4℃，10 000 r /min
离心 10 min;取上清，加入氯仿:异戊醇(24 ∶ 1) ，于
4℃，10 000 r /min离心 10 min;取上清，加入 2倍体积
的 －20℃冰乙醇和1 /10体积的 3 mol /L的NaAc沉淀
过夜。12 000 r /min离心 20 min后用75%乙醇清洗2
次，室温晾干后溶于 30 μL TE或 ddH2O，－20℃保存。
1． 2 寡聚核苷酸链的合成和接头的制备
试验所需 4种寡聚核苷酸链由上海英骏生物技
术有限公司合成，分别为制作接头所需的 Adapter A
和 Adapter B，杂交探针 ProbeGT，PCR 筛选所需引物
PrimerGT，见表 1。用 Adapter A和 Adapter B 制作所
需要的接头。将两种接头等比例混合，95℃ 10 min，
然后 1 h 缓慢冷却到 10℃，这个过程可以通过梯度
PCR程序来完成。最后 －20℃保存备用。
表 1 试验所需接头和引物
接头 引物序列(5 － 3)
Adapter A GATCGTCGACGGTACCGAATTCT
Adapter B GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC
ProbeGT biotinylated(GT)15
PrimerGT (GT)15
1． 3 基因组 DNA的酶切，连接与回收
将提取的 4个乌贼个体的基因组 DNA混合在一
起制成 DNA pool［13］，加入 Sau 3A I于 37℃酶切 3 h，
然后 65℃10 min将内切酶灭活。在酶切反应液中，
加入预先制备好的 Sau 3A I 特异性接头，T4连接酶
16℃过夜连接。1． 2%琼脂糖电泳，然后割胶回收
400 － 1 000 bp的片段。
1． 4 基因组 PCR文库的构建
用 Adaptor B作为引物，回收的带有接头序列的
酶切片段作为模板，建立 25 μL 体系的 PCR，构建
PCR文库。程序如下:94℃预变性 5 min;然后 94℃
1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循环;最后 72℃
延伸 10 min。反应完成后，利用 UNIQ-10 柱式 DNA
胶回收试剂盒对 PCR产物进行纯化，去除杂质，1%
琼脂糖凝胶电泳检测。如果在 400 － 1 000 bp 处呈
现弥散条带，说明接头连接成功，该文库可以用来进
行磁珠杂交。
1． 5 Dynal磁珠与文库杂交、筛选
杂交体系为 50 μL，体系各反应组份如下:约 600
ng PCR纯化产物，50 pmol Adaptor B，15 μL 20 × SSC，
5 μL生物素标记的(GT)15探针(ProbeGT) ，0． 5 μL
10%SDS，然后用 ddH2O 补足至 50 μL。反应程序:
95℃ 5 min，60℃ 1 h。
在杂交过程中可以进行磁珠的清洗和平衡，取
100 μL链霉亲和素包被的 Dynal 磁珠(Invitrogen)
于离心管中，放于磁力架(上海柏汇申生物科技有
限公司)上。加入 100 μL W/B洗液(1 mol /L NaCl，
10 mmol /L Tris-HCl pH7． 5，1 mmol /L EDTA)清洗
两次，然后再用 200 μL 洗液 I(6 × SSC 和 0． 1%
SDS)反复洗涤平衡磁珠，最后加入 200 μL洗液 I悬
浮已平衡的磁珠。
将磁珠和杂交液混合，室温条件下置摇床杂交
30 min，使链霉亲和素与生物素充分结合。转置磁
力架上，吸走残留杂交液。接着对磁珠进行洗涤去
除未结合到磁珠上面的杂质，洗涤过程如下: (1)加
入 200 μL的洗液 I(6 × SSC 和 0． 1% SDS)室温清
洗两次，每次 10 min。(2)加入 200 μL 的洗液 I，在
43℃条件下清洗两次，每次 15 min。(3)加入洗液
Ⅱ(6 × SSC) ，室温下清洗两次，每次 10 min。
移出废液后加入 50 μL ddH2O，95℃处理10 min，
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
将磁珠上吸附的含有微卫星的单链 DNA释放并溶解
于 ddH2O中，快速置于磁力架上，吸出含有微卫星的
洗脱液。
1． 6 微卫星序列的 PCR扩增和纯化
建立 25 μL体系的 PCR，其中包含 1 μL洗脱液
作为模板，10 pmol 的 Adaptor B 作为引物，反应程
序:94℃预变性 5 min;然后 94℃ 1 min，60℃ 1 min，
72℃ 1 min，30 个循环;最后 72℃延伸 10 min。产物
在 1%琼脂糖凝胶电泳上检测。利用 UNIQ-10 柱式
回收试剂盒对 PCR产物进行纯化，去除杂质。
1． 7 连接载体，转化
连接试剂盒购于上海生工有限公司。建立 5 μL
的连接体系，16℃连接过夜，其中包含2． 5 μL Solution
I，2． 25 μL 的经纯化后的 PCR 产物，0． 25 μL 的
pMD18-T vector。然后用 DH5α大肠杆菌感受态细胞
进行转化，最后挑取平板上的单个菌落于 96 孔板中
扩大培养。
1． 8 阳性克隆的筛选和测序
用 Adapter B 和 PrimerGT 作引物，对菌液建立
25 μL 体系的 PCR，PCR 组分中模板为 1 μL 菌液
(或用灭菌的牙签挑取的细菌) ，引物 Adapter B 和
PrimerGT各 10 pmol。反应产物在 1． 5%的琼脂糖
凝胶电泳上检测，出现两条或两条以上条带的可以
初步被认为是所需要的阳性克隆。这部分克隆将被
送去上海英骏公司测序，以最终确定是否包含微卫
星序列。
1． 9 序列分析及引物合成与扩增
测序结果用 Chromas软件进行峰图分析，MEGA4
软件进行序列比对，去除接头和质粒序列，利用 SS-
Rhunter软件查找含有微卫星的序列，记录重复次数，
并通过 DNAMAN软件除去重复测序的序列，然后选
取有足够长度侧翼链的微卫星，用 Primer Premier5 设
计出引物，送至上海英骏生物技术有限公司合成，最
后将获得的引物对曼氏无针乌贼基因组进行扩增。
2 结果
2． 1 酶切结果
基因组 DNA经过 Sau 3A I 限制性内切酶酶切以
后，在琼脂糖凝胶电泳中出现了预期的弥散条带
(图 1)。
M． DNA marker;1－4．酶切片段
图 1 曼氏无针乌贼基因组DNA的酶切产物
2． 2 PCR文库
带上接头并切胶回收的酶切片段，经过 PCR
后，在琼脂糖凝胶电泳上呈现了 400 － 1 000 bp左右
的弥散条带(图 2)。与原来酶切后整片的弥散条带
相比，PCR 产物的条带集中于约 400 － 1 000 bp 的
区间内，说明接头已经成功连接到酶切片段上。
M． DNA marker;1．酶切片段;2－ 4． PCR片段
图 2 酶切产物与 PCR文库比较
2． 3 PCR检测阳性克隆
用 Adaptor B和 PrimerGT对扩大培养的克隆进
行菌液 PCR(图 3)后，选择出现两条或两条以上条
带的克隆进行测序。
M． DNA marker;1－ 7．菌落 PCR电泳结果，其中 2 和 5 为阳性克隆
图 3 PCR检测筛选阳性克隆
2． 4 测序结果波峰图
测序结果利用 Chromas软件进行波峰分析，发现
大多数序列测序都比较准确，可信度高。如图 4 所示
为曼氏无针乌贼中 GT微卫星位点的测序波峰图。
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2011 年第 3 期 吴璋等:曼氏无针乌贼 GT微卫星位点的筛选
图 4 曼氏无针乌贼中包含的 GT微卫星
2． 5 SSR序列分析
在测序的 120 个含有插入序列的克隆中，108
个克隆含有微卫星序列，阳性克隆比率达到 85%，
除去重复测序和侧翼序列不足的微卫星序列后，能
够进行引物设计的有 64 条。其中，核心序列含有
(CA)n重复的有 32 条，占 62． 5%; (GT)n重复的有
23 条，约占 40． 6%。除此之外，还有(GCGT)n、
(A)n、(T)n、(AT)n、(CAA)n和(GTGTGA)n等重复
序列。按照 Weber［20］提出的分类标准，完美型微卫
星序列有 53 条，占 82． 8%，且其中核心序列重复次
数最高可达 157 次。非完美型和混合型微卫星分别
为 6 条(9． 4%)和 5 条(7． 8%)。在已获得的序列
中，有 49 条已经登录 GenBank 数据库，检索号:
HM756198 － HM756246。
2． 6 引物的扩增
在对各个引物进行退火温度的调整后，选取扩
增条带清晰，特异性好的微卫星引物，为以后遗传学
分析之用。图 5 为引物 Wz3 在基因组 DNA 中扩增
的琼脂糖电泳图。
M． DNA marker;1－ 5． Wz3 在 5 个乌贼个体中的扩增条带
图 5 Wz3 在曼氏无针乌贼中的 PCR扩增图
3 讨论
在利用磁珠筛选微卫星的过程当中，很多因素
都将最终影响到试验的结果。高纯度的基因组
DNA是所有试验的前提，因为酶切的过程中，内切
酶可能会被其他杂质所抑制，从而无法将基因组
DNA完全酶切。内切酶的选择要根据基因组 DNA
的大小以及酶切片段的长度制定，本试验选取限制
性内切酶 Sau 3A I 对曼氏无针乌贼基因组 DNA 进
行单酶切，效果比较理想。根据实际情况，单酶切和
双酶切都可以运用到试验中来。DNA 的浓度也是
关键之一，试验要经过割胶回收，磁珠筛选等步骤，
DNA的损失会比较严重。为了避免 DNA 浓度太低
导致试验无法进行，在构建 PCR文库时可以做多管
PCR，混合后一起纯化，这样可以提高文库的浓度。
孙效文等［14］认为磁珠的平衡及洗液和洗涤温度是
富集的关键，洗涤温度控制要求要非常严格。研究
发现，洗涤温度在一定范围内提高将使富集效率提
高，但洗脱非目的片段甚至所需的目的片段的概率
也将增大。为了避免将目的片段也洗脱，适量地降
低温度也是个可行的办法，只要在 PCR检测阳性克
隆的时候条带比较明显，仍然能去除很多非目的片
段，获得比较高的筛选效率。
为了开发更多可用的微卫星位点，同时节省资
源，采用多种不同的方法以提高微卫星的筛选效率，
如提高洗脱温度等。魏东旺等［15］用探针(CA)n对质
粒 pGEM-3Zf(+)构建的鲤鱼基因文库进行杂交筛
选，从 2 000个白色菌落中共获得微卫星 22 个。Gio-
vannim［16］用尼龙膜杂交法从 Saccharum spp．中筛选
微卫星位点，筛选效率提高了 40%。Nunome［17］利用
链霉亲和素包被的磁珠从 Solanum melongena 中筛选
微卫星，杂交液经 PCR 后直接连入载体，转化后测
序，在 96 个克隆中发现了 71 个含有微卫星，效率为
74%。Deng等［18］用磁珠法在亚麻(Linum usitatissi-
mum L．)中富集微卫星，在运用了接头引物和探针引
物对菌落进行阳性筛选后，对 104 个克隆进行了测
序，其中 97 个(93． 3%)含有微卫星序列。鲁翠云
等［19］在用磁珠筛选白鲢的微卫星分子标记后采用同
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位素杂交对文库进行了二次筛选，在 149 个阳性克隆
中，138个含有微卫星序列，效率达到了 92． 6%。但
根据本试验获得的结果，笔者认为只要筛选效率达到
一定的高度后，没有必要再为单纯的提高一点筛选效
率而增加一些费时费钱，甚至像同位素杂交等有一定
危险度的筛选步骤。随着测序技术的发展以及成本
的降低，很多筛选步骤都可以在低成本的条件下被测
序所代替。
Weber［20］认为，只有在双碱基重复序列重复次
数大于 12 次时，微卫星标记才有可能表现出较高
PIC(polymorphic information content)值。本试验所
获得的微卫星序列中，微卫星序列的重复次数都非
常高，20 次以上的占 90． 1%，其中重复次数最高的
达到 157 次，只有 2 个微卫星重复序列少于 10。这
可能是由于使用的探针重复次数较多，或者在磁珠
洗脱的时候比较彻底，使结合不牢固的重复次数较
少的微卫星序列都被洗脱。Smulders［21］认为，高重
复次数的微卫星标记在种内和种间都能产生多态
性。因此选择高重复的微卫星标记作遗传分析是非
常有利的。
曼氏无针乌贼作为我国一个具有较高经济价值
和营养价值的特殊种类，应该对其进行保护和利用。
对曼氏无针乌贼遗传学的研究能更好地辅助人工养
殖及良种选育等，不仅能扩大其种群数量，而且能提
高个体质量，创造更多的经济价值。微卫星则是曼
氏无针乌贼遗传学研究最有力的工具之一。
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(责任编辑 狄艳红)
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