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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
植物蛋白质组学技术研究进展
张根连 范术丽 宋美珍 庞朝友 喻树迅
(中国农业科学院棉花研究所 农业部棉花遗传改良重点开放实验室，安阳 455000)
摘 要: 蛋白质组学被认为是后基因组研究中的最主要部分。与基因组学相比较，蛋白质组学的研究内容更为复杂，
同时也更为直观地揭示生命过程。近年来新的蛋白质组学研究技术层出不穷，极大地推动了生命科学的研究进展。简要介
绍了蛋白质组学的概念、蛋白质组学的研究内容以及一些新的研究技术在植物中的应用等。
关键词: 蛋白质组学 双向凝胶电泳 iTRAQ 生物信息学
Development of Plant Proteomics Research Technology
Zhang Genlian Fan Shuli Song Meizhen Pang Chaoyou Yu Shuxun
(Cotton Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Anyang 455000)
Abstract: Proteomics is considered to be the most important part in the post-genomic era． Compared with genomics，proteomics re-
search is more complex，but also more intuitive to manifestation of the life process． In recent years，the emergence of some new technolo-
gies，such as iTRAQ，SPR，greatly promoted the progress of life science research． This paper introduces the concept of proteomics，pro-
teomics research content and some new research techniques in plant applications．
Key words: Proteomics Two-dimensional (2-D)gel electrophoresis iTRAQ Bioinformatics
收稿日期:2011-01-26
作者简介:张根连，硕士研究生，研究方向:作物遗传育种;E-mail:caas08s2b4@ yahoo． cn
通讯作者:喻树迅，E-mail:yu@ cricaas． com． cn
随着拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza-
sativa)、杨树(Populus trichocarpa)等植物全基因组
序列测定的完成和植物基因组学研究的不断深入，
蛋白质组学研究越来越受到人们的关注，并成为后
基因组时代的重要研究领域。作为生命代谢活动的
直接体现者，对蛋白质的功能分析、鉴定及其翻译后
修饰的研究，将会对阐明基因的功能起到极大的推
动作用，并能更加客观准确地揭示生命现象。近些
年来，各种植物组织(器官)在不同阶段的蛋白质表
达谱分析和响应不同环境因子的差异表达蛋白质组
研究被大量报道。以研究拟南芥和水稻为主，涉及
到结构蛋白质组学、亚细胞蛋白质组学、植物响应胁
迫蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学和蛋白质相
互作用等多个方面。
1 蛋白质组学的概念
蛋白质组(proteome)一词是由澳大利亚的 Marc
Wilkins首先提出，并于 1995 年在 Electrophoresis 杂
志上首次发表了关于蛋白质组学的概念的文章［1］。
蛋白质组是由蛋白质(protein)与基因组(genome)
两个词组合而成，指一个细胞或组织基因组的全部
蛋白质。它对应于基因组(genome)的所有蛋白质
构成一个整体，即生物个体、器官、组织和细胞等在
特定环境或特定时期的全部蛋白质的表达图谱。这
一概念的提出很快得到国际普遍认可，并且随后提
出了蛋白质组学(proteomics)的概念，即在大规模水
平上研究蛋白质的特征，主要包括蛋白质的表达水
平、翻译后的修饰与调控、蛋白质间的相互作用等，
以及由此获得蛋白质水平上关于衰老、疾病和代谢
等过程的整体而科学的认识。蛋白质组学是研究在
特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表
达的全部蛋白质，它不是按照传统的方式孤立地研
究某种蛋白质分子的功能，而是应用各种蛋白质组
学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功
能。蛋白质组学旨在弄清每一个蛋白质的结构和功
2011 年第 7 期 张根连等:植物蛋白质组学技术研究进展
能及蛋白质群体内的相互作用及表达水平的变化。
根据研究目的的不同，蛋白质组学从整体上看
可分为 3 个部分:表达蛋白质组学(expression pro-
teomics)、结构蛋白质组学(structural proteomics)和
功能蛋白质组学(functional proteomics)［2 － 4］。表达
蛋白质组学是指利用双向电泳技术进行大规模蛋白
质的鉴定和分析，研究蛋白质在不同条件下的表达
量等方面的差异，并构建组织或细胞中的表达蛋白
质图谱。它包括细胞或组织的全蛋白质表达谱和在
不同发育时期、不同环境条件下的蛋白质表达谱的
差异分析。结构蛋白质组学是指大规模、高通量的
测定蛋白质的三维结构，通过蛋白质分子的空间三
维结构分析可以更准确地得到蛋白质可能的结合位
点及结构域等，从而预测蛋白质的催化机理和作用
途径、蛋白质之间以及蛋白质与核酸之间的相互作
用。功能蛋白质组学是以特定的蛋白质群体为研究
对象，对其蛋白质的作用途径或作用方式等进行分
析与阐述。
2 蛋白质组学研究技术
蛋白质组学是现代科学技术发展的产物，在受
到技术发展驱动的同时也受到技术发展的制约［5］。
早在 19 世纪 70 年代，O’Farrell 等［6］就用 NP-40 和
9 mol /L的尿素对大肠杆菌细胞抽提物进行双向凝
胶电泳分析。此后，双向凝胶电泳技术又有许多改
进，如固相化 pH 梯度技术的引进使得双向凝胶电
泳技术的重复性和控制加样量等方面得到巨大的改
善，从而使今天的蛋白质组研究得以实施［6 － 8］;差异
凝胶电泳(DIGE)利用多重荧光分析的方法，第一次
引入了内标的概念。DIGE 技术中每个蛋白点都有
自己的内标，极大地提高了结果的准确性、可靠性和
重复性［9］;TAP技术综合了经典的亲和纯化和免疫共
沉淀这两种技术的优点，为研究高等真核生物的蛋白
质相互作用网络和蛋白质组学提供了新方法［10，11］;
Simpson等对考马斯亮蓝染色技术的改进，使得蛋白
质样品可以在纳克级别上被分析鉴定。
2． 1 蛋白质样品的制备
蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的首要环
节，也是最为重要的部分。蛋白质样品的质量直接
影响到科学研究的真实性和可信度。蛋白质样品的
制备应遵循一定的原则: (1)应使待分析的蛋白样
品全部处于溶解状态(包括一些疏水性蛋白) ，且制
备方法具有可重现性。(2)防止样品在聚焦时发生
蛋白的聚集和沉淀。(3)防止样品制备过程中的抽
提后化学修饰。(4)完全去除样品中的核酸和某些
干扰蛋白。(5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无
关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。
蛋白质组学分析通常利用三氯乙酸 /丙酮溶液
沉淀法提取组织或细胞的全蛋白质组，以组织或细
胞的全蛋白质组作为研究对象。根据研究目的的不
同，也可以对蛋白质样品进行预分级。样品的预分
级是依据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的
细胞器定位进行分级，如可溶性蛋白和不可溶性蛋
白;细胞核、细胞质、叶绿素、线粒体及内质网等细胞
器的分级。Heazlewood 等［12］利用预分级技术分离
拟南芥的线粒体，从中鉴定了与细胞质雄性不育有
关的 ATPase的 F1F0 复合体成分，取得了较好的结
果。Shefcheck等［13］利用亲合层析技术进行蛋白质
的分级和富集低丰度的蛋白质，这种方法对于得到
高质量的二维电泳图谱意义重大。通过分级技术去
除拟南芥叶片中高丰度的蛋白质 1，5-二磷酸核酮
糖羧化酶 /加氧酶，可以显著提高二维电泳图谱的分
辨率［14］。采用 SDS-PAGE电泳技术，根据蛋白质分
子量的大小进行预分级有利于二维电泳的分离和检
测，特别是对高分子量的蛋白质的检测非常有效。
2． 2 蛋白质的分离
目前植物蛋白质组的分离主要是依据分子量大
小、等电点、溶解度以及对配体的特异亲和力等的不
同进行的，具体方法主要有双向凝胶电泳、差异凝胶
电泳、毛细管电泳和液相色谱等技术。
双向凝胶电泳技术(2-D)是目前最基础和常用
的方法，它能够在一块胶上同时分离几千个蛋白质
组分［15］。2-D利用不同蛋白质分子的等电点和分子
量之间的差异，将不同等电点的蛋白质分子在第一
向等电聚焦(IEF)时分开，然后不同分子量的蛋白
质分子在第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳时被区分。2-
D利用 IPG胶条有效解决了载体两性电解质引起 pH
梯度不稳定、出现阴极漂移和重复性差等问题［16］，而
蛋白质的银染技术则使纳克级水平上的蛋白质分析
成为可能。IPG胶条的使用和银染技术的引入使得
2-D的重复性和稳定性得到了较大程度的改善。近
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几年发展的荧光染色技术对蛋白质无固定作用，与
质谱兼容性好，而灵敏度与银染相近，线性范围远高
于银染［17］，为蛋白质组学提供了很大的便利。1997
年，Unlu等发表了第一篇荧光差异凝胶电泳的论
文，将不同的样品分别用不同的荧光染料进行标记
后混合在同一块凝胶中进行双向电泳，极大地提高
了试验结果的重复性和定量的准确性。Tang 等利
用 DIGE技术研究油菜素内酯信号激酶，发现 BSK
是 BRI1 激酶反应的基质并下调 BR信号转导途径。
通过凝胶电泳可以实现一次性高通量分离蛋白
质，但也存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、重
复性差等。1973 年由 Baldwin 和 Mclafferty 最早实
现了液相色谱 －质谱联用技术的应用。随后普通液
相层析和气相色谱联合改进得到的高效液相色谱技
术(high performance liquid chromatography，HPLC) ，
能够方便、快速地实现单一蛋白质高灵敏度的层析
分析。高效液相色谱技术通过等点聚焦方式进行蛋
白质混合物的分离。HPLC 操作方便、快速，不必从
凝胶上回收样品。HPLC 分析过程易于自动化，适
用于各种蛋白质，如偏酸性、偏碱性、疏水性、分子量
大于 100 kD或小于 10 kD的蛋白质等，也可用于很
多不易挥发和难以热分解物质。目前，高效液相色
谱技术已经被广泛应用于对多肽混合物的分析，常
用于膜蛋白及低丰度蛋白的分离［18，19］。
2． 3 蛋白质鉴定技术
目前蛋白质鉴定技术主要有 Edman 降解法测
序、质谱(mass spectrometry，MS)、同位素标记亲和标
签(isotope coded affinity tags，ICAT)、串联亲和纯化
(tandem affinity purification，tap)、蛋白质芯片(protein
chip)、免疫共沉淀、酵母双杂 /三杂等技术。
质谱技术的基本原理是带电粒子在磁场或电场
中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷之比
质荷比(m/z)的不同而变化，可以据此来判断粒子
的质量和特性［20］。近些年生物质谱技术飞速发展，
在准确性、灵敏度、溶解性和高通量方面有很大的改
善，并已经成为蛋白质鉴定的重要工具之一。目前
应用最为普遍的蛋白质鉴定质谱技术主要有两种:
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MAIDI-TOF-
MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-MS /MS)的“软电
离”方法，即样品分子电离时保持整个分子的完整
性，不会形成碎片离子。表面增强激光解吸离子化
飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术可以直接在固
相吸附了蛋白质的芯片表面，使用脉冲氮激光能量，
使被捕获的靶蛋白从芯片表面电离出来，根据靶蛋
白在离子装置中的飞行时间，测量出其分子量［21］。
SELDI技术是蛋白质组学研究比较理想的技术平
台，其样品不需要用液相色谱或气相色谱预先纯化，
可分析疏水性蛋白质、pI 过高或过低的蛋白质以及
低分子量(0． 5 － 500 kD)的蛋白质。SELDI 技术只
需要微量样品就能在较短时间内得到理想结果，且
试验的重复性好、灵敏度高。
表面等离子共振技术(surface plamon resonace
technology，SPR 技术)是 20 世纪 80 年代发展起来
的以生物传感芯片(biosensor chip)为中心的一种新
技术，由美国 ABI公司开发。生物分子相互作用分
析质谱(BIA-MS)是 SPR-BIA 技术与传统的蛋白鉴
定技术 MALDI-TOF-MS 有机结合形成的一种新的
研究手段。BIA-MS 分为两步:第一步，SPR 检测自
身环境中的生物分子;第二步，MALDI-TOF-MS 鉴定
结合在 SPR 传感器表面的分析物。这种方法综合
了 SPR-BIA和 MALDI-TOF-MS 两种技术的优势，实
现了定量与定性的结合［22，23］。利用 BIA-MS 可以筛
选和鉴定感兴趣的蛋白及与之结合的对象，这是
BIA-MS的一个主要应用领域。目前，SPR技术已成
为了当今一种全新的研究蛋白质之间相互作用的手
段。SPR生物传感器是利用表面等离子体共振现象
和 SPR谱峰对金属表面上电解质变化敏感的特点，
通过将受体蛋白固定在金属膜上，检测受体蛋白与
液相中配体蛋白的特异性结合。SPR技术的特点是
检测快速、安全、不需标记物或染料，灵敏度高。其
除了应用于检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用
外，还可检测蛋白质与核酸及其他生物大分子之间
的相互作用，并且能对整个反应过程进行实时监测。
2． 4 定量蛋白质组学
随着蛋白质组研究的不断深入，蛋白质组学研
究中仅能提供蛋白质种类和修饰信息的定性分析技
术已经不能满足目前研究工作的需要，因此，定量蛋
白质组学技术和方法的研究正逐渐成为该领域方法
学研究的热点。蛋白质组学定量方法包括相对定量
和绝对定量两部分:相对定量蛋白质组学(也称比
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较蛋白质组学)是指对不同生理病理状态下细胞、
组织或体液蛋白质表达量的相对变化进行比较分
析;绝对定量蛋白质组学是指测定细胞、组织或体液
蛋白质组中每种蛋白质的绝对量或浓度。
相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags
for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是由美
国应用生物系统公司研发的一种多肽体外标记技
术［24，25］。用一对同位素标签分别结合到待测样品
的肽段和合成的氨基酸序列相同的肽段上，这样就
形成了物理化学性质相同而相对分子量不同的同位
素标签化合物标记的一对肽段，经质谱检测即可测
定样品中的蛋白或肽段的绝对量。iTRAQ 试剂盒
分为 4 种或 8 种同位素组成的标记试剂。8 种同位
素标记试剂由 8 种相对分子质量均为 305 的等量异
位标签分子组成，标签分子由质量平衡基团、氨基酸
特异性多肽反应基团，以及相对分子质量分别为
113、114、115、116、117、118、119 和 121 的报告基团
组成。不同同位素标记后的样品在一级质谱检测时
具有相同的质荷比。而在串联质谱检测时，由于碰
撞诱导解离，标记蛋白分解为报告基团、质量平衡基
团和氨基酸部分，产生低质荷比的报告离子。同时，
多肽内酰胺键断裂，形成一系列 b离子和 y离子，得
到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以
鉴定出相应的蛋白质前体。iTRAQ 试剂可同时标
记肽段的 N端和赖氨酸的 ε 氨基，因此样品中几乎
所有的蛋白都可以标记，包括膜蛋白、疏水蛋白等
DIGE难以检测到的蛋白。
3 生物信息学技术的应用
生物信息学是蛋白质组学研究中极其重要的组
成部分，它为 2D-PAGE图像的分析及蛋白质鉴定等
提供了快捷的帮助和大量的信息。生物信息学以计
算机为辅助工具，运用信息学和数学理论方法研究
生命现象，通过对生物大分子信息的获取、加工、分
类、检索、分析与比较，最终获得生物意义的一门学
科。蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平发展的标
志，根据内容可大致分为一级数据库、二级数据库、
复合数据库和三维结构数据库等。表 1 中列出一些
常用数据库及软件。
目前应用较多的蛋白质组数据库主要有基于氨
基酸序列的数据库，如 SWISS-PROT(protein se-
quence database)、PIR(protein information resource)、
TrEMBL(SP-TrEMBL and REM-TrEMBL)、PPDB(the
plant proteome database)等;蛋白质结构数据库，如
PROSITE(protein sites and patterns database)、PDB
(protein data bank)、SCOP(structural classification of
protein)、CATH(class，architecture，topology and ho-
mologous superfamily)等;蛋白质与蛋白质相互作用
数据库，如 BIND、DIP、BIOGRID。此外，许多数据库
都还提供氨基酸序列与结构分析、同源性比对和蛋
白质的结构预测等各种服务，如 SWISS-MODEL 同
源建模、HMMTOP 跨膜域预测、PSORT 亚细胞定
位等。
表 1 蛋白质组学常用数据库与软件
网址 内容
http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov / NCBI
http:/ /www． matrixscience． com Mascot
http:/ /prospector． ucsf． edu ProteinProspector
http:/ /pir． georgetown． edu / PIR
http:/ /www． expasy． ch / tools Expasy proteomics tools
http:/ /www． expasy． ch /ch2d / Swiss-2D PAGE
http:/ /www． embl-heidelberg． de / EMBL
http:/ /www． bind． ca BIND
http:/ /dip． doe-mbi． ucla． edu Portal DIP
http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /TargetP / 蛋白质亚细胞定位分析
http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /TMHMM/ 蛋白跨膜区域预测
http:/ /www． expasy． org / tools /protscale． html / 蛋白质疏水性分析
http:/ /www． expasy． org / tools / findmod /
潜在蛋白翻译后修饰
预测
http:/ / imtech． res． in / raghava /apssp / 蛋白质二级结构预测
http:/ /www． bmm． icnet． uk /servers /3djigsaw/ 蛋白质三级结构预测
4 前景与展望
蛋白质组学为大规模地直接研究基因功能提供
了强有力的工具，特别是多种质谱法与双向凝胶电
泳技术联合应用是植物蛋白质研究的重大突破。植
物蛋白质组学已经成为一个活跃的学科，但是蛋白
质组学并非没有瑕疵，利用蛋白质组学获得和鉴定
植物低丰度蛋白仍然是一个巨大的挑战。植物组织
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
或细胞内的低丰度蛋白多为有调控功能的重要蛋
白，如植物叶片中的膜蛋白等。而双向凝胶电泳技
术的限制，这些低丰度的蛋白质或被高丰度蛋白质
遮掩或难以被识别。液相色谱与质谱联用技术的应
用弥补了这些不足。仅仅知道蛋白质的身份并不足
以对蛋白质给出最终定论，蛋白质的相对和绝对定
量愈发重要，对蛋白质的相对和绝对定量分析，已经
成为蛋白质组学研究的热点。
蛋白质组学与其他学科交叉日益显著，其与基
因组学、生物信息学等的融合将成为未来生命科学
发展的趋势。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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