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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
RNAi技术降低头孢菌素 C工业生产菌株中
cefG基因的转录
龚桂花  刘艳  胡又佳  朱春宝  朱宝泉
(上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室,上海 200437)
  摘  要:  RNA i是近年来新兴的一种通过抑制基因转录水平来实现特定基因表达沉默的技术。本研究尝试在顶头孢霉
工业生产菌株中利用 RNA i技术沉默 cefG基因的转录,构建了一个含可形成 ce fG双链 RNA转录单元的质粒, 并将其导入头
孢菌素 C工业生产菌株中。结果发现其中两个转化子的 cefG基因转录水平在发酵第 4天较出发菌株降低了 80%以上, 而它
们的头孢菌素 C发酵水平较出发菌株则分别降低了 34. 6%和 28. 8%。
关键词:  RNA i ce fG基因  头孢菌素 C 顶头孢霉
Down
regulation of cefG Gene Transcription in an Industrial Strain of
Acremonium chrysogenum by RNA Interference
Gong Gu ihua L iu Yan Hu Youjia Zhu Chunbao Zhu Baoquan
( Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, State Key Laboratory of N ew D rug and
Pharmaceutical Process, Shanghai 200437)
  Abstrac:t  RNA inte rference ( RNA i) is a new techno logy to silence the expression of a targe t gene by suppressing its transcrip

tional leve .l This paper used RNA i to suppress the transcription o f ce fG gene in the b iosynthesis pathw ay of Cepha lospor in C ( CPC ). A
ce fG gene silencing plasm id pYG273 bearing a phleom ycin resistant gene and a transc riptiona l un it for doub le
strand cefG RNA w as
constructed and transform ed into an industrial stra in ofA cremonium chry sogenum . The transcr iption leve ls o f cefG gene in the transfo r

m ants w ere decreased by mo re than 80% at day 4 o f ferm entation, wh ile CPC productionsw ere reduced by 34. 6% and 28. 8% , respec

tive ly.
Key words:  RNA i ce fG gene Cepha lospor in C Acremonium chry sogenum
收稿日期: 2010
03
17
基金项目:国家自然科学基金 ( 30870079 ),上海市自然科学基金 ( 08ZR1418700)
作者简介:龚桂花,女,硕士研究生,研究实习员,研究方向:基因组药学; E
m ai:l longm ucao@ hotm a i.l com
通讯作者:胡又佳,男,研究员,博士生导师,从事基因工程药物的研究; E
m ai:l bebydou@ 126. com
顶头孢霉是工业上产头孢菌素 C ( CPC )的一种
重要的丝状真菌。基因敲除是基因功能研究的常用
方法, 它通过同源重组发生连锁交换,从而破坏目的
基因。但在丝状真菌中, 由于其同源定向整合频率
很低, 同源重组双交换通常需要 3- 8 kb的同源交
换臂 [ 1]。而且,丝状真菌中靶序列与载体上所带序
列的相似性需接近 100% , 不同菌株相似序列内很
小的变化都有可能造成同源重组的失败 [ 2, 3]。因
此,近年来新兴的 RNA i技术可以作为一种替代方
法实现目的基因的表达沉默。它通过降解目的基因
的 mRNA来沉默其表达。丝状真菌中的基因沉默
主要由表达发夹 RNA的质粒载体诱导 [ 4]。这一方
法已经在诸如粗糙脉胞菌 (N eurosp ora crassa )、稻瘟
病菌 [ 5] (Magnaporthe oryzae )和致病真菌如新生隐
球菌 [ 6] ( Cryp tococcus neoformans )、烟曲霉 [ 7] ( Asper

gillus fum igatus)中实现了有效的靶基因沉默现象。
顶头孢霉中的 RNA i现象由 Janus等 [ 8 ]首次报道, 接
着, U llan等 [ 9]用 RNA i技术使产黄青霉中的 pcbC
基因和顶头孢霉中的 cefEF基因的转录水平分别下
降了 20% - 70%。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
CPC生物合成途径的最后一步反应中脱乙酰
头孢菌素 C ( DAC)在 C
7位乙酰化生成 CPC,属于
可逆反应。此步反应由 cefG基因编码的乙酰转移
酶催化。本研究尝试使用 RNA i的方法沉默 cefG基
因的转录,通过检测 mRNA的转录水平的变化来检
验 RNA i技术在顶头孢霉工业菌株中的适用性。
1 材料与方法
1. 1 菌种
大肠杆菌 DH5 a,质粒 pYG858为本室保藏,顶
头孢霉生产菌株 V 2来自山西威奇达药业有限公司,
CPC和 DAC标准品由本院赵文杰提供。
1. 2 试剂
限制性内切酶、T4连接酶、Taq酶, cDNA逆转录
试剂盒和 Real
t ime PCR试剂盒购自大连 TaK aRa公
司, 高纯度质粒抽提试剂盒购自德国 MN公司, Ly

sing Enzyme购自 SIGMA公司, 博来霉素由日本传
染病研究所 Dr. H otta惠赠。RNA抽提试剂盒购自
上海生工生物技术有限公司, 其它常用试剂为国产
分析纯。
1. 3 引物
本研究中所用到的引物由上海英骏公司合成,
序列见表 1。
表 1 本研究所涉及的引物序列
引物 序 列 ( 5 - 3 )
5 in tron2 TGCTCACATATGTGAGCCTTTCTTCTTGCCTGTCA
3 in tron2 CGAAGCTTCTGTGTGTTTTGAACAATTTCACG
In tron2序列 1 GTGAGCCTTTCTTCTTGCCTGTCATTGTTTTTTTGTTTTTTTTCTTTTTTTCCTTTTTTTCGAACAGTGTC
In tron2序列 2 TTTTCCTTTTTTTCGAACAGTGTCCCCATTGGAGAGTCGTTGGCTATGCAAATAAAATGGAAGGG
In tron2序列 3 GGCTATGCAAATAAAATGGAAGGGGCTGACAAGATCGTGAAATTGTTCAAAACACACAG
5
cefG
an t:i CGTCTAGAATGTCGCCTCAGATCGCCAATCGC
3
cefG
an ti ATCTCGAGCATGGATGCGCCGACTACGGCA
5
cefG
sen CGGAATTCATGTCGCCTCAGATCGCCAATCGC
3
cefG
sen AGCTATCATATGCATGGATGCGCCGACTACGGCA
5 actin 5
TGGTTCCATTCTGGCGTCT
3
3 actin 5
CGTTCTTTTGCGGAGGGT
3
5 cefG 5
TAGATGCCCAAGACATAGCCAG
3
3 cefG 5
CGCAGTTATCCCTTGAGACATTC
3
1. 4 顶头孢霉菌丝体的培养和原生质体制备
从斜面上刮下适量孢子接种于玉米浆培养基中,
28! 、230 r /m in培养 96 h,再以 10%的接种量转接于
YPS培养基中,相同条件培养 12- 16 h后,室温离心
( Beckman Avanti J
25, JA
17转子 ) 10 000 r/m in,
5 m in收获菌体。生理盐水洗涤后的菌丝体用 5
mmo l/L的 DTT预处理 20 m in, P bu ffer(KC l 4. 47%,
M gC l2
6H2O 0203%, CaC l2 0278% ) 洗涤后 用
8 mg /mL Lysing Enzym e酶解 1. 5 h,收集原生质体悬
浮于 P buffer中使其浓度大于 108个 /mL。
1. 5 顶头孢霉原生质体转化和转化子的鉴定
采用 PEG
CaC l2介导的原生质体转化法 [ 10]将构
建的质粒转化顶头孢霉, 挑取博来霉素抗性转化子
培养后以液氮抽提法 [ 11]提取基因组 DNA进行 PCR
验证。PCR验证正确的转化子发酵培养 4 d后提取
RNA, 根据试剂盒的操作步骤分别进行逆转录和定
量 PCR。
1. 6 顶头孢霉的发酵和发酵产物的 HPLC检测
从培养 10 d的斜面上刮下适量孢子, 接种于
20mL种子培养基中,于 230 r /m in, 28! 培养 3 d,再
以 10% (V /V )接种量转接至 20mL发酵培养基中,
25! , 230 r/m in,培养 7 d。发酵液经滤纸过滤, 收集
滤液直接进行 HPLC分析,以外标法进行测定。采用
C18 ( 5
m, 4. 6 ∀ 150 mm)柱,流动相为甲醇: 0. 2%磷
194
2010年第 10期     龚桂花等: RNA i技术降低头孢菌素 C工业生产菌株中 cefG基因的转录
酸二氢钠 ( 5#95), 检测波长 254 nm, 流速 1mL /m in,
柱温 40! ,进样量 10
L。
2 结果
2. 1 cefG基因沉默质粒 pYG273的构建
本试验在设计表达 cefG基因发夹 RNA的转录
单元时采用了 cefG基因的 450 bp片段作为插入到
基因间隔区的反向重复片段,分别命名为 ce fG sense
和 cefG antisense。其在转录后可以形成 cefG基因
450 bp片段的双链 RNA结构 ( dsRNA ) 。将长度为
147 bp、来自稻瘟病菌曲霉的几丁质基因的内含子
intron2( GenBank登录号: X61500)作为基因间隔区,
cefG sense和 cefG ant isense反向重复序列及其在转
录后所形成的发夹 RNA结构示意图, 见图 1。 In

tron2序列则通过 PCR由合成的 3段 o ligo( intron2
序列 1、2、3)获得。将 PCR扩增的 450 bp的 cefG
sense和 cefG antisense分别插入 intron2序列两侧获
得 cefG基因沉默载体 pYG273, 如图 2所示。经酶
切验证正确。
图 1 ce fG基因发夹 RNA形成示意图
由于 pYG273的插入片段上含有两段反向重复
序列,测序时极易出现双峰。故将 pYG273上 600 bp
的 cefG antisense+ intron2和 450 bp的 cefG sense用
相应的限制性内切酶消化后连入 pUC18后送上海英
骏生物技术有限公司测序,测序结果证明与设计时完
全一致。
2. 2 质粒 pYG273对顶头孢霉 V2的转化及转化子
的验证
高纯度的质粒 pYG273( 2. 5mg / mL) 5- 6mL加
入预先制备的 V2原生质体中 (浓度大于 108个 /mL)。
1. /H ind III; 2. DL 2000M ark er; 3. pYG273质粒;
4. E coR I; 5. E coR I+ Nd e I; 6. E coR I+ X ba I
图 2 cefG基因沉默载体 pYG273及其酶切验证图
根据质粒 pYG273上的筛选标记腐草霉素抗性基因
( ph leo
r
) ,采用博来霉素 (浓度 3 mg /mL)抗性平板
筛选转化子。挑选不同批转化平板的转化子菌落共
50个,斜面培养后使用液氮抽提法提取抗性转化子
基因组 DNA, 以此为模板, 以 5 intron2和 3 intron2
为引物通过 PCR验证转化子的正确性。 PCR产物
的电泳如图 3所示。结果显示阳性对照质粒
pYG273和转化子均能扩增出 150 bp的片段, 而出
发菌顶头孢霉 V 2则无法扩增出此片段。表明构建
的 cefG基因沉默载体 pYG273已经插入到顶头孢霉
基因组中。经验证, 有 4个转化子正确, 分别为
V t
1、V t
5、V t
8和 V t
9。
2. 3 转化子的 RNA提取和定量 PCR结果分析
将验证正确的转化子与出发菌 V 2同时发酵培
养, 每个转化子接种两个种子瓶, 种子培养 3 d后每
瓶种子转接两个发酵瓶,根据 RNA抽提试剂盒的说
明提取发酵不同天数的总 RNA。以真核生物通用
引物 O ligo
p( dT) 18 Prim er逆转录合成 cDNA进行
195
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
1. int ron2:以转化至 A. chrysog enum 基因组 DNA的质粒
pYG273为模板; 2. in tron2:以质粒 pYG273为模板; 3.
150 bp ladderm arker; 4. intron2:以 A. chry sogenum 基因组
DNA为模板
图 3 pYG273顶头孢霉转化子的 PCR验证
RT
PCR分析 cefG基因的转录结果表明, 4个转化
子的 RNA均有不同程度下降。同时分析转化子发
酵 7 d后的 CPC产量,挑选 CPC产量较出发菌 V 2有
所降低的两个转化子 V t
5和 V t
8的 RNA进行定量
PCR的分析, 以顶头孢霉 actin基因 ( GenBank登录
号: AF056976)作为内参, 通过荧光定量 PCR检测
cefG mRNA的转录水平。转化子 V t
5和V t
8与出发
菌 V 2发酵 4 d的 cefG mRNA相对转录水平的检测
结果见表 2。结果显示这两个转化子的 cefG mRNA
相对转录水平分别下降了 82%和 87%。
表 2 荧光定量检测转化子与出发菌
cefG mRNA相对转录水平
转化子    相对转录水平
V 2 4d
mRNA 1. 00  
Vt
5 4d
mRNA 0. 18 ∃ 0. 011
Vt
8 4d
mRNA 0. 13 ∃ 0. 023
2. 4 转化子发酵产物的分析
将 2. 3中转化子 V t
5和 V t
8以及出发菌 V2发
酵 7 d后的发酵产物进行 HPLC统计分析 (每个转
化子有 4个平行瓶 )。统计结果见表 3。从发酵结
果来看,转化子 V t
5和 V t
8的 CPC产量比出发菌
株 V 2分别降低 34. 6%和 28. 8%, 这个结果也与以
上的定量 PCR结果相对应, 说明 cefG基因转录水
平的降低使其编码的乙酰转移酶的表达量降低, 削
弱了 DAC到 CPC的这一步反应, 从而导致 CPC产
量的降低。
表 3 转化子及出发菌 CPC相对发酵单位
菌种 CPC
V 2 100 ∃ 2. 94
V t
5 68. 04 ∃ 4. 22
V t
8 71. 20 ∃ 3. 87
3 讨论
丝状真菌尤其是顶头孢霉的基因敲除及阻断,
目前成熟的技术并不多。虽然 Waltz等 [ 12] 早在
1993年就构建了含有 pcbC基因同源片段的重组质
粒并转化顶头孢霉,但试验结果发现在顶头孢霉中
发生基本为随机整合,而不是同源重组,这就为定点
敲除某个基因并研究其在顶头孢霉中的功能带来很
大困难。
近年来,随着 RNA i技术的普遍应用, 逐渐有研
究者尝试将这一技术应用于丝状真菌特定基因的沉
默。 Janus等 [ 8]最早于 2007年发表了采用 RNA i技
术来沉默 pcbC基因以及报告基因 DsR ed, 30%的转
化子表现了不同程度的基因沉默现象。 2008年, 还
有一篇文章 [ 9]报道了利用 RNA i技术来沉默产黄青
霉中的 pcbC基因和顶头孢霉中的 cefEF基因,他们
利用定量 PCR对转录水平的高低进行了定量分析,
结果表明,顶头孢霉的不同阳性转化子在发酵 48、
72、96 h, cefEF基因的转录水平分别比对照下降了
20% - 70%。
Yamada等 [ 13]发现丝状真菌中的基因沉默用
300- 500 bp的反向插入片段引起的沉默效率最高。
因此本试验采用 450 bp的 cefG基因片段作为反向
插入片段构建发夹 RNA的转录单元进而诱导目的
基因的沉默。结果发现在转化子发酵 4 d后其 cefG
mRNA转录水平较出发菌下降了 80%以上,比文献
报道的对目的基因的转录水平降低程度都高 [ 8, 9]。
说明本试验构建的 cefG RNA i载体对目的基因 mR

NA发挥了较好的降解作用, 进而证明 RNA i技术用
于顶头孢霉工业生产菌株是有效的, 为工业生产菌
株中的基因改造提供了新的技术路线。
196
2010年第 10期     龚桂花等: RNA i技术降低头孢菌素 C工业生产菌株中 cefG基因的转录
本试验使用 RNA i的方法较同源重组法不仅较
快地获得了正确的转化子, 而且转化子对目的基因
的转录水平发挥了较好的沉默作用。对转化子的发
酵产物 CPC的分析也显示其产量发生了下降, 这与
cefG基因的转录水平下降是相对应的。通过研究,
我们进一步发现了 RNA i较同源重组在沉默基因水
平上的优势,同时也确认了 RNA i技术在顶头孢霉
工业菌株中应用的可行性。因此, RNA i不失为一个
迅速有效的基因工程手段并有望成为工业生产菌株
基因改造的新方法。
参 考 文 献
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