全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
两个枣树扩展蛋白基因 cDNA全序列的克隆及分析
孟玉平 1 曹秋芬1 魏玮 1 孙海峰 2
( 1山西省农业生物技术研究中心,太原 030031; 2山西大学化学化工学院,太原 030006)
摘 要: 用定向克隆法构建了枣树 (Ziz iphus jujubaM il.l )快速生长初期结果枝的 cDNA文库, 经过重组质粒的筛选,克隆
获得两个扩展蛋白基因 cDNA全序列,分别命名为 ZjEXP1 ( GenBank登录号: F J449891)和 ZjEXP2 ( GenBank登录号: F J449892)。
ZjEXP1 全长 1 037 bp,包含编码 254个氨基酸的完整开放阅读框; ZjEXP2 全长 905 bp, 包含编码 251个氨基酸的完整开放阅读
框。两个序列有共同的结构特征, 即在 N末端有 8个保守的半胱氨酸残基的丰富域, C末端有 4个保守的色氨酸残基的丰富
域, 中间有一个组氨酸 ( H isPheAsp, HFD )功能域。两者之间的氨基酸同源性为 74 0%。从已知的扩展蛋白基因家族的进化
分析表明, Z jEXP1 和 ZjEXP2由一个祖先进化而来, 又分别属于两个不同的分支。
关键词: 枣树 扩展蛋白基因 cDNA克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Two Expansin
Genes cDNA from Chinese Jujube
M eng Yuping
1
CaoQ iufen
1
W eiW ei
1
Sun H aifeng
2
(
1
AgriB io technology Research Center of Shanx iP rovince, Taiyuan 030031;
2
College of Chem istry and Chem ical Engineering of Shanxi University, Taiyuan 030006)
Abstrac:t U sing d irec tiona l cloning, a cDNA libra ry o f the bear ing shoo t during early days o f rap id g row th in Ch inese ju jubew as
constructed. Two expansin genes we re obta ined through plasm id recomb ination and c lone techn ique, w hich w ere nam ed asZ jEXP1 ( Gen
Bank Num be r: F J449891) and ZjEXP2 ( GenBank Number: F J449892) , respectively. Sequence ana lysis indicated thatZjEXP1 is 1 037
bp in full length and conta ins an encoding 254 am ino ac ids open reading fram e, and thatZjEXP2 is 905 bp in full leng th and conta ins
an encod ing 251 am ino acids open read ing fram e. Further analysis suggested that the tw o expansin sequences reta in som e comm on struc
tu re charac ter, nam ely, a conserva tive reg ion conta in ing eigh t cyste ine residues is located in Nterm ina,l another conservative reg ion con
ta ining four tryptophan residues is lo ca ted in Cterm ina,l and one function reg ion conta ined H isPheAsp is located in them idd le o f the
sequence. In addition, the hom o logy be tw een tw o expansins is 74. 0% at am ino acid sequence leve.l By Ana ly sing evo lvem en t o f fam ily
from known expans in genes, it deduced tha tZjEXP1 and ZjEXP2 cam e from sam e progen itor, how ever, they do be long to two embranch
m ent.
Key words: Z iz iphus jujubaM il.l Expansin gene cDNA c loning Sequence ana lysis
收稿日期: 20091207
基金项目:山西省自然科学基金项目 ( 20080110622 ),山西省留学基金项目 ( 200581)
作者简介:孟玉平,男,副研究员,研究方向:果树生物技术; Em ai:l m engyup ing@ yahoo. com. cn
通讯作者:曹秋芬, Em ai:l caoq iufeng@ yahoo. com. cn
扩展蛋白 ( Expansin)是一类植物细胞壁蛋白。
最初发现这种蛋白和细胞生长时的细胞壁伸展性有
关,所以又名伸展蛋白、伸展素、膨大素、苹果菌素
等,是高等植物细胞壁中一类富含羟脯氨酸的糖蛋
白。植物细胞壁是构成和支撑机体组织的骨架,细
胞的伸长是植物组织生长的重要原因之一, 而植物
细胞的伸长受制于细胞壁, 它在一定程度上会限制
植物细胞原生质量的迅速增加。植物生长调控分子
机制的研究表明, 扩展蛋白能够通过打断细胞壁多
聚物之间的氢键诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松
弛, 促进细胞壁膨胀,它是对植物生长具广泛有效性
的蛋白质 [ 1, 2]。扩展蛋白基因主要有两类多基因家
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
族,分别为 expansin、expansin, 每类扩展蛋白基
因家族又有很多的基因成员 [ 3- 5]。扩展蛋白已在不
同的植物中被鉴定存在, 并且大量的扩展蛋白基因
被克隆。研究表明, 每一个扩展蛋白基因在高度特
定的位点和高度特定的细胞类型中表达, 其表达在
时间、空间上受到严格的调控且受到激素和环境因
子的调控。目前认为, 扩展蛋白几乎参与了植物的
整个发育过程,除具有增大细胞的功能外,扩展蛋白
在细胞生长、种子萌发、根毛形成、根系生长、叶原基
形成、叶子生长发育、果实成熟、器官脱离,以及花粉
管生长方面起着重要的作用 [ 6, 7]。因此, 扩展蛋白
基因成为当今的研究热点。
枣树 (Z iziphus jujuba M il.l )属于鼠李科枣属植
物,原产于中国, 主要分布于我国黄河流域的广大丘
陵山区,是一种重要的经济林树种。枣树是较古老
的植物, 有据可证的即有 3 000多年的栽培历史。
枣树特别耐旱、耐瘠薄, 抗逆性很强。枣树结果枝
(枣吊 )于春天从结果母枝 (枣股 )中萌发,边生长边
花芽分化,秋天在果实采摘后一个多月即自行脱落,
它是一年中生长发育最活跃的器官 [ 8]。为了从分
子生物学的角度探索枣树的诸多优良特性, 构建了
枣树生长初期结果枝 cDNA文库, 再从文库中克隆
分离有用抗逆性基因, 进而分析研究,已经在 Gen
Bank登录部分基因 [ 9- 11]。开展枣树抗逆性基因的
克隆和研究对于了解枣树抗逆性机理以及为植物品
种改良提供优良基因具有重要意义。目前有关枣树
基因的研究资料及其有限, 其扩展蛋白基因克隆尚
属首次。
1 材料与方法
11 材料
试验材料取自山西省农业生物技术研究中心试
验园 40年生的壶瓶枣树 ( Z iziphus jujuba M il.l Hup
ing ),于春天采集长度约 2 mm的结果枝 (枣吊 ) ,用
于构建 cDNA文库。所采集的材料用冰壶从试验园
取回后做适当剥离、修整, 液氮快速冷冻后置于
- 70 冰箱保存备用。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及 PCR用试
剂等常规分子生物学试剂购自大连宝生物有限公
司, mRNA纯化试剂盒 (货号: Z5200)购自 Prom ega
(美国 ) , cDNA文库构建试剂盒 (货号: 18248- 039)
购自 Inv itrogen(美国 )。大肠杆菌 E. co li DH 5菌株
为本研究室保存。
12 总 RNA提取及 mRNA纯化
采用改良 CTAB法 [ 12]进行总 RNA提取。真空
干燥后溶于 DEPC处理过的超纯水中。使用 Eppen
dorf B iophotometen测定 RNA的浓度和纯度, 15%
变性琼脂糖凝胶检测 RNA的完整性。根据 Po lyA
T tractmRNA Isolat ion System! ( Z5200 mRNA iso la
tions)试剂盒的说明, 利用磁珠分离的方法从提取到
的总 RNA中分离纯化 mRNA。分光光度法测定
mRNA的浓度和纯度, 并用上述方法电泳检测 mR
NA的完整性。
13 cDNA文库的构建
用纯化的 mRNA进行 cDNA文库构建,具体操作
步骤按照试剂盒说明书进行 (货号: 18248- 039, In
v itrogen,美国 )。在由 mRNA合成 cDNA第一链时,
设计有N ot I接头引物。合成的 cDNA双链加上 Sal I
接头后, 用 N ot I酶解, 最后合成的 cDNA 5∀端具有
Sal I的酶切位点, 3∀端具有 Not I酶切位点。最后将
合成的 cDNA产物通过柱层析分级去除 500 bp以下
的小片段后,即为构建好的 cDNA文库。利用 Eppen
dorf B iophotometen测定 cDNA文库的浓度,并用 TEN
( 10 mM T risHC ,l pH75, 01 mM EDTA, 25 mM
NaC l)缓冲液稀释至 10 ng / L,便于与载体连接。
14 cDNA片段与质粒载体的连接以及扩展蛋白
基因 cDNA的克隆
连接反应液为 1 L cDNA产物, 1 L Sal IN o t
I双酶切过的载体 pSPORT1, 1 L的 T4DNA连接
酶, 4 L的 5 #T4 DNA连接酶 bu ffer,用灭菌水补
充反应体积至 20 L, 连接反应条件为 12 12 h
以上。将连接产物转化至 100 L E. coli DH5感
受态细胞,涂布于有氨苄青霉素抗性的平皿 37 培
养过夜。蓝白斑筛选重组质粒并委托上海生工双向
测序。
15 同源性分析以及系统发育树的构建
将得到的 cDNA序列分别利用 NCBI( www. nc
b.i n lm. n ih. gov / )在线分析软件进行 B last分析。利
用软件 Lasergene中 C lusta lV的方法,将推测的氨基
酸序列与 GenBank登录的其他植物扩展蛋白基因
全长氨基酸序列进行同源性比对, 同时绘制系统进
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2010年第 2期 孟玉平等 :两个枣树扩展蛋白基因 cDNA全序列的克隆及分析
化树。
2 结果与分析
21 RNA的提取、纯化与 cDNA文库的构建
将提取的枣结果枝总 RNA溶于 800 L DEPC
处理水中。分光光 度法测定总 RNA 浓度为
OD260 = 233 g / L, A260 /280、A 260 /230值分别为 199
和 207, 经过变性琼脂糖电泳确认总 RNA的完整
性和纯度都非常好后, 利用 Prom ega的 mRNA纯化
试剂盒对总 RNA进行纯化, 并将纯化后的 mRNA
溶于 10 L DEPC处理水中, 测定 mRNA含量为
21 g /mL。将 mRNA反转录成 cDNA, 连接到载体
pSPORT1, 涂平板计算所构建的 cDNA文库容量为
21 # 105。
22 枣树扩展蛋白基因 cDNA的克隆
对构建的枣结果枝 cDNA文库进行了部分与
载体连接, 从获得的 1338个阳性克隆中提取质
粒, 用 BamH∃和 P st∃双酶切确认有 557个插入
片段。对其中 469个片段测序并与 G enBank进行
B last分析表明, 有两个 1000 bp左右的插入片段
(图 1)与 GenB ank中登录的其他植物扩展蛋白基
因的同源性分别在 70%和 75% 以上,证明为扩展
蛋白基因的同源序列。它们的核苷酸序列长度分
别为 1 037 bp和 905 bp, 将得到的两个 cDNA片段
在 GenB ank中进行了登录, 将 1 037 bp的片段命
名为 Z jEXP1 ( Z iziphus jujuba M il.l E xpansin 1 ) ,
GenBank登录号为 FJ449891; 905 bp的片段命名
为 ZjEXP2 ( Z iziphus jujuba M il.l E xpansin 2 ), G en
Bank登录号为 FJ449892。
M. DL2000分子量标记; 1. Z jEXP1片段; 2. ZjEXP2片段
图 1 BamH∃和 Pst∃双酶切 pSPORT1质粒鉴定图
23 Z jEXP1和 ZjEXP2序列分析
序列分析表明 (图 2A, B ) , ZjEXP1 包含编码
254个氨基酸的完整开放阅续框, ZjEXP2包含编码
251个氨基酸的完整开放阅读框, 而且在 N末端都
有 8个保守的半胱氨酸残基的丰富域, C末端都有
4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有一个组氨
酸 ( H isPheA sp, HFD)功能域, 这是多数植物扩展
蛋白所持有的,为扩展蛋白基因全序列。ZjEXP1预
测的蛋白质分子量为 2699 kD, 等电点为 832;
Z jEXP2预测的蛋白质分子量为 2663 kD,等电点为
933。Z jEXP1和 Z jEXP2之间的核苷酸水平同源性
为 665% ,氨基酸同源性为 740% (图 3) , 属于同
一扩展蛋白基因家族。
24 Z jEXP1、ZjEXP2与其它植物氨基酸同源性比
较及其进化分析
将推测的 ZjEXP1和 ZjEXP2 编码的氨基酸全
长序列与 GenBank登录的其他植物的扩展蛋白基
因全长氨基酸序列进行同源性比对, 同时构建了它
们的系统进化树。结果表明, Z jEXP1氨基酸水平的
同源性与陆地棉 ( Go ssyp ium hirsutum ) expansion2
( ABB59694)为 885%, 与西洋梨 (Py rus communis )
expansion( BAC67188)为 874% ,与李 (P runus salic
ina ) expansion( ABY55298)和油桃 (P runus p ersica )
expansion( BAB19676)为 865%, 与酸樱桃 ( P runus
cerasus) expansion ( AAK48845 )为 862% , 与杏梅
(P runusmume ) expansion ( BAE48665)为 861%, 与
草莓 ( F ragaria # ananassa ) expansion ( AAF21101 )
为 842%。
Z jEXP2氨基酸水平的同源性与枇杷 (E riobotrya
japonica ) expansion1 ( ABW96604 )为 942% , 与油
桃 expansion ( BAC66786 )、酸樱桃 expansion ( AAL
40354)、草莓 expansion( ABA62612)、西洋梨 expan
sion( BAC67191)为 884%, 砂梨 (Py rus pyrifolia ) ex
pansion( ABR04073)为 880% , 甜樱桃 ( P runus avi
um ) expansion( AAG13983) 876%。但是 ZjEXP1和
Z jEXP2之间氨基酸水平的同源性为 740% , 小于
其它植物。
从构建的系统进化树 (图 4)可以看出, Z jEXP1
和 ZjEXP2由一个祖先进化而来, 但是它们的遗传
距离较远,远于图中其它植物,明显属于两个进化分
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
M.起始密码子; C.半胱氨酸残基; W.色氨酸残基; H FD.组氨酸功能域; * .终止密码子
图 2 ZjEXP1 (A )和 ZjEXP2 (B ) cDNA的全长核苷酸序列和推导的氨基酸序列
116
2010年第 2期 孟玉平等 :两个枣树扩展蛋白基因 cDNA全序列的克隆及分析
支 ( ∃、! )。ZjEXP1处于分支 ∃中, 与陆地棉 ex
pansion2亲缘关系最近, 其次是玫瑰 (Rosa # borbor
niana ) expansion、草莓 expansion、西洋梨 expansion、
苹果 expansion、杏 expansion、甜樱桃 expansion、李
expansion、油桃 expansion、杏梅 expansion和酸樱桃
expansion。ZjEXP2处于分支 !中,与甜樱桃 expan
sion、油桃 expansion、酸樱桃 expansion、湖北海棠
(Malu s hup ehensis ) expansion、草莓 expansion、砂梨
expansion和西洋梨 expansion亲缘关系较近。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
3 讨论
已知扩展蛋白基因在植物中存在众多, 如拟南
芥有 27个 expansin、10个 expansin基因; 水稻
至少有 32个 expansin、24个 expansin基因 [ 13 ]。
在其它作物中, 已经发现玉米、大豆、莴苣、烟草、番
茄等植物有扩展蛋白基因的存在, 在 GenBank中都
可以查到。但有关中国枣的扩展蛋白基因尚未见有
报道, Z jEXP1和 ZjEXP2是首次在 GenBank登录的
枣树扩展蛋白基因家族。大量研究表明, expansin
分子量大约 26 kD,高度保守,氨基酸序列同源性达
70% - 90%; expansin分子量约 29 kD,分子序列
变化较大,两类 expansin同源性约 20% - 25% ,但
在进化、结构和功能上相关明显。 Expansin基因初
级转录产物编码的蛋白质有 3个主要的功能域。首
先, N末端一个信号肽 (约 22- 25个氨基酸残基 ) ,
它引导新生肽进入内质网 /高尔基体,在成熟蛋白分
泌前被切除,典型的成熟蛋白约为 225个氨基酸,分
子量为 25- 27 kD, 没有糖基化位点; 其次, 在 C端
(大约 10 kD )有显著的表面高度保守性且具有一定
间距的色氨酸残基, 类似于微生物中纤维素结合区
域 ( CBDlike)的表面多糖结合部分, 可能形成应答
expansin蛋白结合到细胞壁的区域;最后, 两个区域
间包含高度保守的半胱氨酸区和 HFD(H isPheAsp)
功能域,其中 30% 的序列类似于葡聚糖内切酶的一
个小家族 ( fam ily45)的催化域, 可能具有催化特
性 [ 14]。克隆得到的 Z jEXP1和 ZjEXP2都包含了完
整开放阅读框,而且它们 N末端的半胱氨酸残基丰
富域、C末端的色氨酸残基丰富域以及中部的组氨
酸功能域、蛋白质分子量等都符合植物扩展蛋白基
因的结构和特点。Z jEXP1和 Z jEXP2 属于同一家
族,起源于同一个祖先,但在其后的进化过程中属于
两个不同的分枝,它们可能存在功能上的区别。
ZjEXP1和 Z jEXP2来自于枣树发芽不久后的结
果枝。这个时期,结果枝处于快速生长初期,大多数
基因处于活跃阶段, 从这一时期构建的 cDNA文库
中得到了 ZjEXP1和 Z jEXP2的完整序列,说明这两
个扩展蛋白基因在细胞开始生长时就表达, 与细胞
生长密切相关。众多研究表明,扩展蛋白除有诱导
细胞壁伸长的功能外, 还有促进形态发生 [ 15 ]、根毛
生长 [ 16]、授粉受精 [ 17 ]、果实成熟软化 [ 18]和胞壁分
离 [ 19]等功能。尤其是扩展蛋白作为细胞壁的结构
成分,在防御和抗病及抗逆性中起作用。扩展蛋白
中大多数羟脯氨酸都被糖基化, 从而形成一种稳定
的杆状结构,起强固细胞壁的作用,保护细胞免受病
原菌的侵染。但是枣树作为一种抗逆性强的果树,
目前对其有关扩展蛋白基因家族知之甚少, 尤其是
它们的功能,需要进行更多的研究。
参 考 文 献
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(下转第 125页 )
118
2010年第 2期 周双清等: Che lex100快速提取放线菌 DNA作为 PCR扩增模板
Che lex 100是一种由苯乙烯和苯二乙烯组成的
独特螯合树脂,可以高选择性地结合多价阳离子,去
除样品和缓冲液中的金属离子,避免煮沸过程中模
板 DNA的降解。目前广泛应用于医学微量血痕
DNA
[ 5, 6]和血液制品污染细菌 DNA [ 7]提取, 以及植
物转基因检测模板 DNA的制备 [ 8]。有学者也曾应
用 Chelex100提取放线细菌基因组, 并成功扩增出
16S rRNA基因 [ 9] , 但在丝状放线菌 DNA的提取方
面少有报道。本试验利用 Che lex100煮沸法能快速
提取放线菌 DNA, 使 16S rRNA基因的 PCR扩增更
加简便、省时和经济,在大规模快速筛选、鉴定放线
菌资源方面具有重要的意义。
参 考 文 献
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