全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 134-140, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-05-29; 接受日期: 2006-11-16
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30370228和 30300044)和中国科学院知识创新工程方向性项目(No. KSCX2-SW-124)
* 通讯作者。E-mail: weiwei@ibcas.ac.cn
.综述.
绿色荧光蛋白及其在 GMOs生态监测中的应用
沈宝成 1,2, 李梅 3, 石纪成 4, 张木清 2, 米湘成 1, 魏伟 1*
1中国科学院植物研究所, 北京 100093
2福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室, 福州 350002
3青海省卫生职业技术学院, 西宁 810000; 4湖南省宁乡县农业局, 宁乡 410600
摘要 绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)是在海洋无脊椎动物水母(Aequorea victoria)中获得的一种由238
个氨基酸组成的多肽。该多肽通过翻译后加工形成生色基团, 产生稳定的荧光, 而且这种荧光很容易被检测。GFP作为动、
植物以及微生物基因工程研究上的一种广泛的选择标记, 具有检测灵敏度高、操作简便、不需要添加任何底物或辅助因子等
优点, 更重要的是利用GFP可对GMOs进行快速、原位、实时、活体监测。本文概括介绍了GFP的特性、改造及其检测, 并从
生态学角度论述了GFP在GMOs生态监测研究中的应用及其发展前景。
关键词 生物安全, 生态监测, 适合度, 基因流, 绿色荧光蛋白
沈宝成, 李梅, 石纪成, 张木清, 米湘成, 魏伟 (2007). 绿色荧光蛋白及其在 GMOs生态监测中的应用. 植物学通报 24, 134-140.
近年来, 遗传修饰生物体(genetically modified
organisms, GMOs), 尤其是转基因植物(transgenic
plants)的研究得到了突飞猛进的发展, 许多转基因植物
已进行了田间试验, 有些已被批准商业化应用。GMOs
在带来巨大的经济效益和社会效益的同时, 也具有潜在
的风险。有关它对生态环境的影响已有不少研究报道,
积累了许多有价值的资料。GMOs向环境释放后可能
带来的生态风险问题也越来越受到人们的重视。要对
GMOs释放的潜在生态风险进行正确评估就必须对其进
行长期有效的监测(钱迎倩, 1998)。
鉴于几乎所有GMOs中都含有标记基因, 且同一标
记基因常被转入不同的生物中, 因此标记基因是筛选鉴
定GMOs的有效方法。现有的标记基因主要有: 分泌
型碱性磷酸酶基因(SEAP)、b -葡糖醛酸糖苷酶基因
(GUS)、b-半乳糖苷酶基因(LAC-Z)、萤火虫荧光素酶
基因(LUC) 、氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)以及绿色荧
光蛋白基因(GFP)等。其中, 来源于水母( jel lyf ish,
Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白基因(GFP)可能是目
前最具潜力、应用最广泛的标记基因之一。GFP是一
种非酶性报告因子, 能够自身催化形成发色基团并在紫
外光或蓝光的激发下发出明亮的绿色荧光。与其它传
统的标记相比, GFP具有荧光强度高、不需要底物或
辅助因子、无种属特异性、分子量小、易与其它蛋白
融合、对细胞基本无毒害、易于检测、可在活细胞实
时、原位观察等优点, 因而能方便可靠地用于转基因及
其表达产物的监测。本文概括介绍了GFP的性质、荧
光检测并从生态学角度论述了GFP在GMOs监测研究
中的应用及其发展前景。
1 绿色荧光蛋白的结构及其性质
绿色荧光蛋白是Shimomura等(1962)在研究维多利亚水
母荧光现象时首先报道的。Prasher等(1992)首次从维
多利亚水母的 cDNA文库中克隆到绿色荧光蛋白基因
GFP10并分析了GFP的一级结构。纯化的GFP由238
个氨基酸组成, 分子量为 27 kDa。由 65-67位的丝氨
酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成独特的、相
当稳定的环状三肽结构, 构成 GFP生色基团的核心。
135沈宝成等: 绿色荧光蛋白及其在GMOs生态监测中的应用
当受到 395 nm近紫外光或 470 nm蓝色光激发后, 在
Ca2+ 激活下能发出 510 nm的绿色荧光。GFP的分子
结构也有许多研究报道, 它是由11个b-折叠围绕着一个
a-螺旋形成的, 形状像一个圆筒, 长 420 nm , 宽 240
nm。位于圆筒中央的这个a-螺旋含有一个由6肽组成
的发光中心, 而发光团是由其中的Ser65-Tyr66-Gly67
经过环化和氧化形成的(Ward et al., 1980)。Chalfie等
(1994)和Wang等(1994)两个研究小组分别成功地使
GFP在大肠杆菌、线虫和果蝇中表达, 开创了GFP应
用先河。随后 , 其异源表达的范围迅速扩大。目前
GFP在动物、植物、微生物的转基因研究中已得到广
泛的应用(Sheen et al.,1995; Chalfie and Kain,1998;
Stewart, 2005)。
GFP基因作为理想的标记基因, 具备许多优点。(1)
检测方便。GFP荧光反应不需任何反应底物及其它辅
助因子, 只需激发光源或荧光显微镜就可观察到。且材
料无需预处理, 可以活体观察, 不会损伤正在生长的细胞
和组织。(2)荧光稳定。GFP荧光在通常的变性条件下
都很稳定, 不易变性衰退, 对光致漂白作用有强烈的耐受
性, 能忍受长时间光照, 从而延长了可检测时间。(3)共
用性和通用性。GFP基因的表达几乎没有受体范围及
细胞种类、位置的限制, 在原核和真核生物中都获得了
成功的表达。GFP基因适用于多种转化方式。相对其
它的目的基因和标记基因, 在转化方式上没有特殊性。
(4)对细胞基本无毒害。在转化GFP基因时发现, 其表
达不仅没有特异性, 表达产物对活细胞也基本没有毒害
作用, 并且不影响细胞的正常生长和功能 (Chalfie et al.,
1 9 9 4 ) 。动物毒理学实验也未检测出不利影响
(Richards et al., 2003b)。Sheen等(1995)的研究表
明: 在玉米中, 即便GFP在细胞中的表达量很高时, 对
细胞也不会产生明显毒害。 (5) GFP是合适的蛋白标
记。由于GFP较小, 可以将GFP基因和目标基因构建
在一起表达融合蛋白。无论在目标蛋白的 N-端, 还是
C-端, 它都不会影响目标蛋白的构像。这些优点就使
GFP有可能成为一种快速、简便、经济的标记蛋白来
用于监测GMOs中目的基因的表达及转基因产物在环境
中的去向与留存。
尽管GFP基因作为标记基因有许多无可比拟的优
点, 但野生型GFP发光较弱, 甚至在某些植物细胞中并
不表达。通过以下几种途径可以对GFP蛋白和GFP基
因进行修饰改造以满足人们研究的需要。(1)对荧光蛋白
本身的修饰。通过不同的GFP的比较研究发现, 荧光
蛋白的激发光波长越长, 其光稳定性越高, 自发荧光的干
扰越低, 能更好地与荧光过滤装置相匹配。除了野生型
GFP,克隆技术又产生了几种遗传突变体: egfp、gfp-
s65t和 rs-gfp。这些突变体有两个主要的优点: 它们的
荧光信号的强度明显比野生型强; 具有红光转换激发光
谱(red-shifted excitation spectra) , 对光淬灭具有更强
的抵抗性。红光转换GFP变种 EGFP、GFP-S65T和
RSGFP在生色基团中含有不同的突变, 这些变种在490
nm 都有一个单一的红光转换激发峰(Hiem et a l . ,
1995)。根据等量可溶性蛋白光谱分析, EGFP用 485
nm光激发时, 可产生比野生型强 35倍的荧光。GFP-
S65T和 RSGFP的荧光强度也比野生型的大 4-6倍。
(2)对GFP基因的修饰。GFP在受体内的表达水平的
提高有赖于寻找到更为通用的转录翻译的增强子和更强
的启动子。目前, 已获得了多种含 GFP基因的质粒。
其中m-gfp5-ER是目前较好的植物表达载体(Stewart,
2005)。对GFP基因的序列进行一定的修改也能提高
它的表达频率, 增加荧光强度。当然, 只要转化后受体
生物表达的荧光强度比较高, 容易检测, 所用的GFP基
因就是合适的。对GFP基因的修饰主要有改变碱基组
分。为适合GFP基因在植物中表达, 修饰方法有增加
G和C, 降低A和T的含量, 把密码子改为植物蛋白表达
偏爱的密码子。可通过消除隐蔽型内含子, 以逃避植物
细胞的错误剪接, 插入植物内含子或更换强启动子等手
段增加荧光强度(Haseloff et al., 1997)。
2 GFP荧光的检测
GFP荧光的检测极其方便, 可用手持紫外灯、普通荧
光显微镜、流式细胞仪或激光扫描共聚焦显微镜方便
地在活体中进行检测, 而对活细胞无伤害。受体细胞组
织和整株植物都可以用手持紫外灯观察。进一步可用
136 植物学通报 24(2) 2007
普通荧光显微镜, 以蓝光或紫外光激发, 再选择适合的滤
光片, 就可以看到细胞内GFP荧光。如果要观察组织
内部GFP荧光但又不损伤材料, 可以使用激光扫描共聚
焦显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)
(Tang et al., 2004)。
GFP作为转基因遗传标记, 其用途障碍之一是所观
察荧光的稳定性。现在荧光技术已经发展到能够在转
基因植物或蛋白提取物中定量GFP水平。Richards等
(2003a)研究转基因植物中是否可以将GFP荧光作为重
组蛋白合成的指示剂, 结果表明, 荧光强度随GFP表达
量的增加而增加, 呈线性相关。可以利用标准曲线评估
GFP在植物和蛋白提取物中的含量。同时, 利用酶联
免疫检测法(enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA)检测转基因植物蛋白提取物GFP, 证明荧光技术
可以有效可靠地检测重组体GFP表达。并测定在纯合
子和杂合子 GFP 表达量, 结果表明转基因纯合植株
GFP表达量是杂合植株表达量的 2倍。荧光技术以其
简单、快速等优点将可能成为替代传统技术的有力手
段。但是, 由于 GFP的荧光讯号是非线性的, 若要对
GFP进行比较精确的定量, 则在每一个不同的应用中, 都
必须测定荧光讯号的线性范围, 绘制校正曲线, 这是GFP
应用的不便之处。
绿色荧光蛋白检测仪(the general fluorescent pro-
tein meter, GFP-Meter)是一种新型的便携式荧光检测
和数据资料记录仪器, 其利用光纤光学电缆和叶片夹来
汇集荧光光谱数据。与传统的分析系统相比, GFP-
Meter可以在田间快速、准确、高效地测量植物叶片
中绿色荧光蛋白的含量, 并对植物组织无破坏, 可继续进
行植物生态生理学研究。该仪器可根据不同的研究目
的选择不同的配置, 以用于检测蓝绿色、红色、黄色
荧光蛋白等。GFP-Meter轻便、手持式以及可使用电
池的优点使其非常适合在田间应用。另外, 它采用的荧
光性技术是一种非损伤性技术, 不会对样品造成干扰。
产生荧光信号所需要的激发态的光能很低, 减少了对光
致漂白的影响, 并且可以在对其自然生理行为没有不利
影响的条件下进行活体组织的研究, 是目前比较理想的
GFP 田间快速定性、定量检测仪器。
在证明GFP-Meter有效性和精确性方面, Millwood
等(2003)对GFP- Meter测定荧光强度和传统实验室荧
光分析装置分光荧光计FluoroMax-2测定的荧光强度做
了比较。线性回归分析表明, 二者呈正向函数关系。对
GFP-Meter准确性的重复性研究发现, 二者没有显著差
别。通过准确性的持续性研究发现, GFP-Meter仅在每
次测量的开始是精确的, 在随后针对同一叶片同一位点
的测量时出现荧光值的急剧降低。因此, 利用 GFP-
Meter测量荧光时要注意将叶片夹放在叶片上后应立即
测量读数, 随后的测量值可以用作定性研究(Millwood et
al., 2003)。
3 GFP在GMOs监测中的应用及发展前景
3.1 野外非破坏性快速区分GMOs和非GMOs
目前常用的GMOs检测方法主要有PCR定性和定量分
析、酶联免疫检测(ELISA)和生物测定(表型性状、生
化检测)、生物芯片检测等。但是这些检测方法通常成
本较高, 操作复杂, 且易损伤样品, 不适合田间大规模
GMOs检测。而 GFP标记将是田间大规模快速检测
GMOs的理想手段。研究人员将 GFP与 Bt基因连锁
在一起转入了油菜(Halfhill et al., 2001), 手持长波紫外
灯照射植物, 含有GFP的植株发出绿色荧光, 而非转化
植株由于叶绿素的自发荧光显示红色。这样就大大减
轻了工作强度, 也方便了田间对转基因植物的鉴定。
GFP-Meter的应用使得GFP的检测更加方便、快捷。
另外, GFP 可作为重组蛋白合成的指示剂用于监测
GMOs中目的基因的表达及其在环境中的去向与留存
(Stewart, 2001)。Halfhill等(2003)在温室和田间实验研
究发现, GFP荧光强度与可溶性蛋白的浓度密切相关。
将GFP基因与Bt内毒素基因组成重组体, GFP表达与
Bt毒素在整个发育阶段呈正相关。结果表明, GFP可
以作为准确的转基因标记来指示转基因的存在与表达。
因此, GFP可用于野外非破坏性快速检测遗传修饰作物,
具有简便、适用、灵敏和可靠等优点。
3.2 监测转基因植物在田间的基因流及其适合
137沈宝成等: 绿色荧光蛋白及其在GMOs生态监测中的应用
度
转基因植物释放到环境中以后, 外源基因向野生近缘种
逃逸及其生态学后果一直是转基因植物生态安全研究的
热点(钱迎倩, 1998; 魏伟等, 1999; Wei et al., 2003)。
近年来, 通过基因工程已得到许多种类的转基因植物, 而
且有些已开始大面积种植。如果这些转基因植株与生
长在它们周围的某些杂草具有杂交亲合性, 通过花粉散
布或种子传播可能会造成目的基因的逃逸(黄国存等,
1998)。从目前的研究来看, 转基因在时空上的逃逸广
泛存在, 这就需要更好的技术和方法来控制和管理转基
因作物与其野生亲缘种间的基因流, 而GFP标记是理想
的监测手段。
基因流(gene flow)主要指生物的个体或群体之间由
于杂交而导致的基因交流, 在生物安全的文献中主要是
特指转基因在转基因生物与其有亲缘关系的生物间的流
动。基因流的产生主要有两个机制: 花粉的传播和种子
的散布。转基因向野生近缘种逃逸是由花粉流或种子
传播介导的基因流来实现的(魏伟等, 1999)。作物 -野
生近缘种之间的基因流会造成转基因向野生种的逃逸。
转基因作物与其野生近缘种的杂交种如果可以进一步与
野生近缘种回交而产生基因渗入 ( t r a n s g e n e
introgression)现象, 会将转基因扩散到野生近缘种的种
群中。这将导致不可预测的生态后果: 转基因是否会提
高野生近缘种的适合度和赋予野生近缘种更强的杂草
性？适合度的提高是否会影响到野生种群的进化过程,
甚至影响到群落内物种之间的生态遗传关系？这些问题
的解答离不开对转基因适合度与适合度代价的研究与评
价。适合度主要是指某个基因型的携带者对未来世代
的基因库所做的相对贡献。适合度包括生殖和生存两
个方面。在没有选择压力下, 如果抗逆性的特定基因型
个体的适合度低于非抗个体的适合度, 即可以认为该基
因型存在适合度代价。适合度是野生或杂(回)交种群在
野外竞争定居能力的重要指标, 能够指示外源转基因在
自然界的命运, 在某种程度上也能预测对生物多样性影
响的程度。
Stewart等(2005)认为, 在细胞质中或内质网上表达
GFP不会带来任何适合度代价, 而GFP的表达有助于
检测转基因作物与其近缘种间的基因流。因此在跟踪
基因流方面是一个比较有效的手段, 并可以将其应用到
野外对基因流的监测上以及转基因适合度代价的研究
上。Hudson和 Stewart(2004)的研究结果表明, GFP
在烟草花粉粒中的表达对花粉的形成没有影响。
Hudson 等(2001)借助荧光显微镜在蜜蜂的腿上发现了
具有GFP荧光的花粉, 研究人员认为GFP标记可以用
来追踪花粉在环境中的运动, 确定转基因花粉的空间散
布模式, 监测基因流。Halfhill等(2005)将转GFP/Bt基
因的油菜与野生芜菁的杂交种与野生芜菁回交, 根据
GFP荧光反应鉴定杂交种和回交种, 获得的携带GFP/
Bt基因的回交种再与野生芜菁一起释放到麦田中, 发现
回交种对小麦产量造成的影响比野生芜菁要低 20%。
研究者认为杂草经历了多年的选择, 其适合度肯定要比
携带外源基因的杂(回)交种高(Halfhill et al., 2005)。
3.3 在生态环境监测方面的应用
利用GFP因子能够表达荧光性, 可以作为生物报告因
子。当环境中存在硝基化合物、非爆炸军火、爆炸军
火残留物等污染物时, 报告因子就会发出荧光。Smith
等(2002)获得了输导组织中能够表达绿色荧光蛋白(m-
gfp5-ER)的遗传修饰烟草。有机金属离子磷酸盐杀虫
剂能够诱导GFP基因表达, 当其暴露在杀虫剂中时, 便
能观测到绿色荧光的存在。新加坡国立大学培育成功
的一种会在黑夜中发光的转基因观赏斑马鱼, 可利用它
们来监测水源的污染程度: 每当遇到含硫重金属、化学
毒素及致癌物质等污染物时, 这些污染物能够诱导GFP
基因表达, 这些转基因鱼就会自动发光, 由此发出“警讯”
(Gong et al., 2001; Melamed et al., 2003)。
3.4 在基因工程微生物生态监测中的应用
基因工程微生物 ( g e n e t i c a l l y e n g i n e e r e d
microorganisms, GEMs)在生态系统中的存活情况、
特征产物的表达和新的遗传分泌物对其它生物体的影响,
是考察它对开放的生态环境中影响的关键因素。因此
GEMs的监测方法, 尤其是监测GEMs在大量异源微生
物群体中的存活和分布情况显得十分重要。由于可以
138 植物学通报 24(2) 2007
避开实验室培养造成的偏差, 直接在环境中进行原位分
析, 效率高而且费用低, 因此GFP标记在GEMs的空间
分布研究和原位实时监测上具有明显的优势。GFP标
记也可以用来监测病原微生物的分布及其与植物的相互
作用。Casper和Holt(1996)将 gfp-cDNA插入到 TMv
基因组cDNA克隆中, 导入烟草植株, 在感染的叶片和整
个植株中, 都观察到了病毒的感染和GFP基因的表达。
董越梅等(2000)将GFP标记用于植物内生固氮菌, 用荧
光显微镜观察到了该菌对玉米植株的侵染过程以及在植
物体内的定殖。所以, 借助GFP标记可以动态观察到
转基因的转染过程, 了解转化过程中定殖的阶段与部位,
这一优势可能会在提高转化效率和技术方面发挥重大作
用。GFP还可以监测水体和水生动物中的细菌, 尤其
是致病菌的动态分布及其存活时间。Leff和Leff(1996)
还利用GFP监测工程菌在水生环境的存活和去向。张
庆华和陆承平 (2002)用绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞
菌研究其在越冬水体饥饿存活及复苏。因此, GFP可以
作为监测和评价GEMs生态生长情况的重要标记。
GFP还可以用于监测GEMs水平基因转移方面。
水平基因转移是指有性不亲和物种之间发生的基因交
流。如果将GFP用于水平基因转移及其产生的生态效
应的深入研究, 将有助于对GEMs的安全性做出新的评
价。另外, 目前水生生物特别是鱼类转基因生物技术的
发展比较快, 但对其生态风险评价的研究相对滞后。其
主要障碍是无法有效地跟踪监测转基因生物体, 所以
GFP标记在转基因水生生物特别是转基因鱼的释放及其
生态学风险评价方面也具有应用潜力。
4 研究展望
作为目前唯一的活体报告蛋白, GFP具有其它酶类报告
蛋白不可替代的优点。但目前看来仍有其不足。(1)检
测灵敏度还有待提高, 多数生物具有微弱的自发荧光现
象, 并有着类似的激发和发射波长, 这个荧光背景会影响
某些GFP的检测。研究发现, 用长波段检测能有效地
降低背景值(Stewart, 2005)。(2)紫外光激发对某些GFP
有光漂白和光破坏作用, 导致荧光信号迅速丧失。考虑
到目前现状和存在的问题, 预计今后将研究发现更多的
突变改进型GFP, 它们或具有更高的荧光活性, 或者分
别具有不同的吸收或发射光谱特性。
尽管存在上述不足, 但GFP在GMOs生态监测及
生态学研究领域中的应用并不存在原则上的障碍。相
信随着GFP的不断改进及优化, GFP的应用在技术上
将出现更多的创新, 其应用范围将会越来越广阔。以
GFP作为标记基因, 再结合适当的监测工具, 我们就可
根据GFP基因在自然界中的动向来确定转基因在自然
界中的存留与转移。这将有助于我们对GMOs释放的
生态风险进行正确的预测及评价, 进而指导GMOs的商
品化生产及大规模田间释放。相信 GFP会在未来的
GMOs生态监测研究中发挥更大的作用。
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140 植物学通报 24(2) 2007
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: weiwei@ibcas.ac.cn
Green Fluorescent Protein and Its Application in Ecological
Monitoring of Genetically Modified Organisms
Baocheng Shen1,2, Mei Li3, Jicheng Shi4, Muqing Zhang2, Xiangcheng Mi1,Wei Wei1*
1 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
2 Key Laboratory of Eco-Physiology and Genetic Improvement for Sugarcane under Ministry of Agriculture, Fujian Agricultural and
Forestry University, Fuzhou 350002, China
3 Qinghai Professional and Technological College of Hygienics, Xining 810000, China
4 Agricultural Bureau of Ningxiang City, Hunan Province, Ningxiang 410600, China
Abstract Green fluorescent protein (GFP) is a special protein of a single polypeptide chain with 238 amino acids derived from
Aequorea victoria. A chromophore is formed autocatalytically on the nascent apoprotein’s backbone via posttranslational modification.
The stable light-stimulated fluorescence is specifically independent and does not require cofactors, substrates or additional gene
products. As a valid marker gene for bacteria, animal and plant genetic engineering, GFP is very sensitive for detection and is easily
manipulated. What is more important, GFP can be detected in vivo, in situ, and in real time. This paper briefly introduces the
biochemical and genetic properties of GFP and its application in the research of ecological monitoring of genetically modified
organisms (GMOs).
Key words biosafety, ecological monitoring, fitness, gene flow, green fluorescent protein
Shen BC, Li M, Shi JC, Zhang MQ, Mi XC, Wei W (2007). Green fluorescent protein and its application in ecological monitoring of
genetically modified organisms. Chin Bull Bot 24, 134-140.
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《中国长白山观赏植物彩色图志》由中国工程院陈俊愉院士和中国科学院洪德元院士做序, 中国工程院陈俊愉院士主审,
中国园艺学会理事长、中国工程院方智远院士做书评; 吉林人民教育出版社出版; 本书是由吉林省通化师范学院生物系周繇
教授、朱俊义教授, 药学系于俊林教授及中国科学院植物研究所徐克学研究员, 历经 25年, 完成了迄今为止第一部反映长白
山野生观赏植物的大型志书。本书为精装本, 大 16开, 全铜版纸, 550页, 100万字, 配生态照片 1 248张, 收录植物 104科、
3 3 2 属、6 0 9 种、4 2 变种、9 变型。
全书内容详实全面, 章节编排合理, 设计新颖科学。根据植物的园林用途分为园景树类、行道树类、庭荫树类、垂
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型汇总表及中文和拉丁文索引, 便于广大读者查阅和使用。全书科学性强、植物名称鉴定正确、文字严谨, 系统介绍了每
一种植物的中文名、拉丁名、别名、形态特征、生境、分布、园林用途、繁殖方法及主要经济价值等。
全书图片清晰生动 , 其中有 8 0 余张照片做了《园林》、《中国花卉园艺》、《中草药》、《生物学通报》、《中
国野生植物资源》等刊物的封面、封底和中间的插页。每种观赏植物既有整体景观, 又有重要部位的特写。该书既可作
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