全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 455-458, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-09-03; 接受日期: 2007-10-09
基金项目: 国家自然科学基金(No.30470106)
* 通讯作者。E-mail: Liu- jiax i@263.net
.技术与方法.
植物小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质染色的新方法
刘晓瑞 1 , 陈祖铿2, 刘家熙 1 *
1首都师范大学生命科学学院, 北京 100048; 2中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室, 北京 100093
摘要 利用改良苯酚品红-苯胺蓝压片法, 观察小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质的动态变化。使用该方法简便、快速且
省时, 获得的照片颜色鲜艳, 细胞质呈红色, 染色体为深红色, 胼胝质呈黄绿色荧光, 对比明显, 有三维效果。单用改良苯酚品
红染液对新鲜材料进行压片, 在蓝光激发下, 细胞质与染色体呈红色荧光, 染色体清晰。实验结果表明, 改良苯酚品红染液可
作为荧光染料代替DAPI及H33258等昂贵的核染料, 从而降低实验成本。
关键词 苯胺蓝, 胼胝质, 改良苯酚品红染色液
刘晓瑞 , 陈祖铿 , 刘家熙 (2008). 植物小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质染色的新方法. 植物学通报 25, 455-458.
胼胝质(王元军, 2005; 郝建华和强胜, 2006)是b-1,
3葡聚糖的混合物, 具有迅速聚合和解聚的生理特性。
胼胝质在植物的筛管代谢和配子体发育等生命活动中发
挥着重要的调节作用, 其合成及分解直接影响植物正常
的生长代谢过程。因此, 胼胝质代谢是植物研究中的重
要内容之一。利用苯胺蓝对胼胝质的专性反应——在
紫外光激发下发出黄绿色荧光, 检测胼胝质动态的方法
已有大量文献报道(李师翁和屠骊珠, 1990; Adrienne et
al., 2005; Penet et al., 2005; 申业等, 2006)。本文报
道一种利用苯胺蓝和改良苯酚品红压片法观察小孢子母
细胞减数分裂过程中胼胝质动态变化的新方法。
1 材料与方法
1.1 染色剂的配制
1.1.1 改良苯酚品红液
参照何兰花和卢家现(2000)的方法配制改良苯酚品红液
(石碳酸 -品红染色液)。(1)甲液的配制。原液 A: 将 3 g
碱性品红溶于 100 mL 70% 的乙醇中(此液可长期保
存)。原液 B: 取 10 mL原液 A 加入 90 mL 5% 的石碳
酸酚水溶液中(2周内使用)。染色液: 取 55 mL原液 B,
加入 6 mL冰醋酸和 6 mL 37% 的甲醛(放置 2周后使
用)。(2 )乙液的配制。取甲液 2-10 mL, 加入 90-98
mL 45% 的醋酸和 1.8 g山梨醇, 即为改良苯酚品红染
色液。放入棕色瓶中保存备用(放置 2周后使用, 可使染
色能力显著增加)。
1.1.2 0.01％水溶性苯胺蓝
将 0.01 g水溶性苯胺蓝加入 100 mL 0.1 mol·L-1 pH
7.2的 PB S 缓冲液中。
1.2 取材与压片
取小孢子母细胞减数分裂时期的百合科大百合属植物大
百合(Cardiocrinum giganteum (Wall. ) Makino)和百合
科萱草属植物大苞萱草(Hemeroc all is middendorf i i
Trautv. et Mey.)的花蕾, 不经过固定, 直接取出花药, 放
入滴有改良苯酚品红染液的载玻片上。将花药横切为 2
段, 用镊子轻捏花药将进行减数分裂的小孢子母细胞释
放出来, 均匀分布在染液中, 盖上盖玻片, 染色 10-15
分钟, 直至光镜下镜检看到清晰的染色体为止。
456 植物学通报 25(4) 2008
图 1 2种百合科植物小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质染色图
(A)-(F) 大苞萱草小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质壁的变化 (A) 前期I; (B) 中期I; (C) 末期I, 赤道面上形成胼胝质细胞板; (D) 后期
II; (E) 左右对称形四分体; (F) 四面体形四分体; (G)-(J) 大百合小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质壁的变化 (G) 前期I, 赤道面两端出
现胼胝质荧光, 在细胞中央形成胼胝质环; (H) 二分体; (I) , (J) 左右对称形四分体; (K) 单用苯胺蓝染色的大百合二分体, 示胼胝质壁; (L)
单用改良苯酚品红染色的大苞萱草减数分裂前期 I、中期 I及后期 I, 示染色体。Bar=10 µm
Figur e 1 The dynamics of callose w all of microspore mother cells during the meios is in tw o species of Liliaceae
(A)-(F) The callose w all of mic rospore mother cells dur ing the meios is in Hemerocal li s mi ddendorfii (A) Prophase I; (B)
Metaphase I; (C) Telephase I, show ing the centrifugal callose cell plate; (D) A naphase II; (E) Isobilateral tetrad; (F) Tetragonal
tetrad; (G)-(J) The callose w all of microspore mother cells during the meiosis in Cardioc rinum giganteum (G) Prophase I, show ing
the callose ring in the median of the cell; (H) Dyad; (I), (J) Isobilateral tetrad; (K) Dyad of Cardiocrinum giganteum s tained only by
aniline-blue, show ing the callose w all; (L) Prophase I, metaphase I and anaphase I in Hemerocalli s mi ddendorfi i s tained only by
improved carbol f uchsin, show ing the chromosomes. Bar=10 µm
457刘晓瑞等: 植物小孢子母细胞减数分裂过程中胼胝质染色的新方法
沿盖玻片的一边滴加 0.01%的水溶性苯胺蓝溶液,
用吸水纸在盖玻片的对边吸取改良苯酚品红溶液, 直至
水溶性苯胺蓝溶液完全浸没进行减数分裂的小孢子母细
胞。染色 1 0-1 5 分钟。
同时, 分别用改良苯酚品红和 0.01%的水溶性苯胺
蓝溶液单独染色 10-15 分钟作为对照。
1.3 显微观察与照相
经上述染色后的材料, 在 Nikon Eclipse E600型显
微镜明场和荧光系统下对比观察并照相。用蓝光(B-2A)
激发, EX450-490, DM505, BA520。曝光时间 1/4秒。
2 结果与讨论
2.1 大苞萱草与大百合小孢子母细胞减数分裂
过程中胼胝质的变化
大苞萱草的胼胝质在小孢子母细胞减数分裂过程中呈现
有规律的变化。小孢子母细胞减数分裂的早前期, 开始
在角隅处沉积胼胝质, 直至包围整个母细胞(图 1A), 经
中期 I(图 1B), 到后期 I时, 胼胝质荧光逐渐集中到赤道
面上形成胼胝质细胞板(图1C), 最后形成二分体, 二分体
再重复上述过程(图 1D), 产生左右对称形(图 1E)和四面
体形(图 1F)四分体。晚四分体时, 胼胝质迅速解体, 小
孢子从共同包围的胼胝质壁中释放出来, 各自独立发育
为雄配子体。
大百合与大苞萱草胼胝质变化不同之处是在减数分
裂前期, 赤道面两端便出现胼胝质荧光(图1G), 随着减数
分裂的进行, 胼胝质由两端向中央延伸, 形成二分体(图
1H, K), 形成的四分体多为左右对称形四分体(图 1I,J)。
2.2 改良苯酚品红-苯胺蓝整体压片法观察胼胝
质的优点
该法简便、快速且省时, 材料无需固定即可染色。在
蓝光激发下, 细胞质呈红色, 染色体为深红色, 而胼胝质
呈黄绿色荧光。获得的照片颜色鲜艳, 对比明显, 不但
能观察到胼胝质的变化, 还能看到染色体的变化。使用
该法也能够观察到胼胝质在小孢子母细胞减数分裂过程
中的整体分布, 照片有一定的三维立体效果, 避免了由于
切片切面造成的假象。
同时, 单用改良苯酚品红染液对新鲜材料进行压片,
在相同激发条件下, 染色质与染色体呈红色荧光(图1L),
染色体状态清晰。因此可考虑将改良苯酚品红染液作
为荧光染料, 代替 DAPI及 H33258等昂贵的核染料, 从
而降低实验成本。
参考文献
郝建华 , 强胜 (2006). 被子植物有性和无融合生殖过程中胼胝质壁
的动态变化及其生理学意义. 植物生理学通讯 42, 141-147.
何兰花 , 卢家现 (2000). 用改良苯酚品红染色液替代醋酸洋红染色
液的研究. 生物学杂志 17(2), 28-29.
李师翁 , 屠骊珠 (1990). 用苯胺蓝压片法观察小孢子和雄配子体发
育过程中胼胝质的动态. 植物学通报 7, 60-63.
申业 , 申家恒 , 郭德栋 , 方晓华 , 刘丽萍 (2006). 甜菜无融合生殖
单体附加系M14大孢子发生期间细胞壁胼胝质的变化. 作物学
报 32, 894-898.
王元军 (2005). 植物体内的胼胝质. 生物学通报 40, 18-19.
Adrienne R, Leanne D, Sarah TT, Arlette F, Sophie N (2005).
Post-meiotic cytokinesis and pollen aperture pattern ontogeny:
comparison of development in four species differ ing in aper-
ture pattern. Am J Bot 92, 576-583.
Penet L, Nadot S, Ressayre A, Forchioni A, Dreyer L, Gouyon
PH (2005). Multiple developmental pathw ays leading to a single
morph: monosulcate pollen (examples from the asparagales).
Ann Bot 95, 331-343.
458 植物学通报 25(4) 2008
A New Method for Callose Fluorescence Observation of Microspore
Mother Cells During Meiosis
Xiaorui Liu1, Zukeng Chen2, Jiaxi Liu1*
1 Co lle ge of L ife Scien ces, Capital Normal Un iversit y, Bei jin g 1 0004 8, Chi na
2 State Key La boratory o f Systemat ic and Evolut ion ary Botany, Inst itute o f Bota ny, Chi nese Acade my of Scie nce s,
Be ijin g 1 000 93, Chi na
Abstract Staining w ith the improved carbol f uchsin-aniline blue f luorescence method is a convenient and ef f icient w ay to
observe the behavior of the callose w all of mic rospore mother cells dur ing meiosis. The photos are vivid and colorf ul and show red
cy toplasm, carmine chromosomes, and kelly callose; the contrast is strong and demonstrates a 3-D effect. Cytoplasm and chromo-
somes appear as red f luorescence under the excitation of blue light, and the chromosomes are clear on staining w ith only improved
carbol fuchsin. Therefore, improved carbol f uchs in can be used as the f luorochrome to nuc lear DNA to reduce the costs of the use
of DNA-spec if ic f luorochrome such as DA PI and H33258.
Ke y w ords an il i ne-blue , call ose, ca rbo l fu chsin
Liu XR, Chen ZK, Liu JX (200 8). A new method for callose fluorescence observation of microspore mother cells during meiosis. Chi n Bu ll Bot
25 , 45 5-45 8.
* Author for correspondence. E-mail: Liu-jiaxi@263.net
(责任编辑: 白羽红)
第九届 ISSS种子生物学大会在波兰召开
第九届国际种子科学学会 (ISSS) 种子生物学大会于 2008年7月6-11日在风景秀丽的波兰Olsztyn 召开。会议由ISSS
和Warm ia and Mazury大学联合主办, Ryszard J. Górecki、Patricia Berjak和 J. Derek Bewley 3位教授共同主持。国
际上250名种子生物学学者参加了会议, 其中青年学生占 20%。
会议有83个大会报告和 227份墙报, 涉及种子发育与成熟、种子休眠与萌发、种子技术与应用、种子胁迫耐性、种
质资源保存和种子生态等内容。这些报告和墙报已由Pol is h Journal o f Natural Sciences 出版了论文摘要集。会议还集
中讨论了种子生物学的发展趋势, 本次大会的新亮点是: (1) 活性氧在种子发育、萌发和脱水过程中的信号分子作用; (2) 植
物种质资源的长期保存; (3) 种子生态; (4) 种子是生物燃料的重要资源。华人学者朱利民 (香港中文大学生物系)、顾兴友
(Col lege of Agricul ture and Bio log ical Sciences, South Dakota State Universi ty)、张浩 (香港中文大学生物系)、夏可
(中国科学院昆明植物研究所) 和宋松泉 (中国科学院植物研究所) 参加了本次会议。顾兴友、张浩和宋松泉分别作了题为
“qSD7-1 is the first dormancy QTL cloned from weedy rice”、“Soil seed bank composi tion and developm ent in the
restored quarries in Hong Kong”和“Changes in res piration rates and pathways and reactive oxygen species scav-
enging enzym es in m itochondria involved in desiccation sens itivi ty of Antiaris toxicaria Axes”的大会报告。
大会选举产生了第九届 ISSS理事会和理事会主席。南非KwaZulu-Nata l大学生物和资源保护科学学院的 Patricia
Berjak教授当选为第九届 ISSS理事会主席。此外, 会议组委会对参加会议的青年学生评选了优秀报告奖, 并颁发了Michael
Black基金会和Daniel Come 基金会的奖励证书和奖金。会议决定, 2010年在巴西萨尔瓦多 (Salvador) 召开第十届 ISSS
种子生物学大会, 详情请登录 ISSS网站http://www.SeedSciSoc.org。我国具有丰富的植物种质资源, 也是一个农业大国,
并拥有一大批优秀的种子生物学研究人员。建议国内种子生物学研究人员积极准备, 在2010年的 ISSS种子生物学大会上
充分展示我国种子生物学的研究成果。
(中国科学院植物研究所 宋松泉)