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甲苯胺蓝介导的光动力疗法对多重耐药铜绿假单胞菌的杀伤作用
王钰铖
作者单位: 解放军总医院激光医学科(北京市，100853)
背景与目的
多重耐药(Multidrug-Ｒesistant，MDＲ)铜绿假单
胞菌感染给全世界带来严峻考验，传统的抗菌药物
受疗效与毒性所限，需发展新的替代疗法。光动力
疗法(Photodynamic therapy，PDT)能够用于多种疾
病的治疗，在抗感染方面对耐药菌也有效。甲苯胺
蓝(Toluidine blue O，TBO)是一种广泛应用的光敏
剂，在本研究中笔者比较了它对铜绿假单胞菌 MDＲ
菌株及抗生素敏感株的光动力疗效，并探索其杀伤
机制。
材料与方法
一、材料
MDＲ铜绿假单胞菌 60 株，由台湾大学医院提
供;另外 19 株抗生素敏感临床菌株作为对照。
MDＲ 定义为对以下五类抗生素均耐药:头孢菌素
类、碳青霉烯类、哌拉西林 /三唑巴坦、喹诺酮类及氨
基糖苷类。对这些抗生素均敏感视为抗生素敏感菌
株。
二、方法
1. PDT 杀伤效应 对三株 MDＲ 临床菌株
(PA330、PA450 及 PA03-05)进行 PDT 效应检测，
抗生素敏感的标准菌株 ATCC 27853 作为对照。将
108 CFU /mL菌液与不同浓度 TBO(0 ～ 50 μM)避光
孵育 20 min后，以波长 630 nm LED光源照射 30 min
(功率密度 50 mW/cm2，能量密度 90 J /cm2) ，以菌
落计数法测定存活细菌数。
2. DNA片段分析 以 PA450 及 ATCC 27853 为
对象，应用脉冲场电泳分析 PDT 处理后细菌 DNA
变化。
3. 蛋白质羟基实验 以 PA450 及 ATCC 27853
为对象，将对照组及光动力组的菌液超声破坏获得
粗提取物，以 2，4-二硝基苯肼(DNPH)标记法测定
蛋白质羟基含量。
4. 外排泵活性检测 以 60 株临床耐药菌为对
象，环丙沙星作为底物，检测 100 μM 外排泵抑制剂
CCCP与其协同抗菌作用。
5. 光动力最小致死剂量(Minimum Lethal Drug
Concentration，MLC)测定 将菌株分为三组:表达外
排泵的 MDＲ 菌株，不表达外排泵的 MDＲ 菌株及抗
生素敏感菌株。将菌液在不同浓度光敏剂条件下进
行 PDT处理后，分别以菌落计数法测定细菌存活
量，无细菌生长对应的最小光敏剂剂量为 MLC值。
6. TBO的吸收 选择两株表达外排泵菌株(PA
03-05 和 PA 04-04)及两株不表达外排泵菌株
(ATCC 27853 和 PA450) ，将菌液与 10 μM-TBO 孵
育不同时间，检测前 20 min 加入 100 μM CCCP，以
荧光定量法测定细菌对光敏剂的吸收。
结 果
一、PDT杀伤效应
随着 TBO 剂量增加，PDT 抗菌作用增强，当
TBO剂量为 20 μM时，细菌存活浓度减少 6 ～ 7 log。
TBO浓度为 5 和 10 μM时，对四个菌株的杀伤作用
略有差别 (PA03-05 ＞ PA330 ＞ PA450 ＞ ATCC
27853)。表达外排泵的菌株 PA03-05 对 TBO-PDT
甚至更敏感，提示 TBO介导的 PDT对所有菌株都有
效，敏感性与抗生素耐药性无关。
二、DNA及蛋白质变化分析
脉冲场电泳结果显示，PDT 处理后 PA450 及
ATCC 27853 均形成 DNA 碎片(～ 50-150 kb) ;蛋白
质羟基实验结果显示，PDT 处理后蛋白质游离羟基
形成增多，提示 PDT 对 MDＲ 菌株及抗生素敏感菌
株作用方式相似。
三、MLC值比较
60 株MDＲ临床菌株中有 11 株在含有 CCCP条
件下，环丙沙星 MIC值增加 2 ～ 4 倍，提示有外排泵
表达。对三组中菌株 MLC值进行分析，表达外排泵
的 11 株菌 MLC值为 1 ～ 10 μM，不表达外排泵的菌
株 MLC值为 2. 5 ～ 10 μM。表达外排泵的耐药菌及
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中国激光医学杂志 2014 年 6 月第 23 卷第 3 期 Chin J Laser Med Surg，June 2014，Vol 23，No. 3
抗生素敏感菌株 MLC90均为 5 μM，不表达外排泵的
耐药菌 MLC90为 10 μM。三组的 MLC50均为 5 μM。
四、TBO的吸收
加入 CCCP 后，表达外排泵的 PA03-05 与 PA
04-04 对 TBO 的吸收增加，而不表达外排泵的
PA450 及 ATCC 27853 对 TBO 吸收不增加，提示
TBO是外排泵的底物。虽然外排泵能够排出 TBO，
但比较它们的 MLC值，外排泵并不影响 PDT效应。
结 论
TBO介导的 PDT 对铜绿假单胞菌的杀伤作用
与抗生素耐药性无关，外排泵不影响其作用。
［Tseng SP，Teng LJ，Chen CT，et al． Toluidine
blue O photodynamic inactivation on multidrug-resist-
ant pseudomonas aeruginosa［J］． Lasers in Surg and
Med，2009，41:391-397．］
王春喜等 大隐静脉曲张激光光凝后曲张血管超微结构的观察(见正文第 117 页)
图 1 正常静脉 SEM ×10 000
Fig. 1 Normal vein SEM ×10 000
图 2 曲张静脉 SEM ×10 000
Fig. 2 Varicose vein SEM ×10 000
图 3 激光光凝后 SEM ×10 000
A. 内皮细胞即将脱落 B. 内皮脱落后局部溃疡形成 C. 染色质趋边
Fig. 3 After laser treatment SEM × 10 000
A. Endothelial cell exfoliation B. Ulceration post endothelial cell exfoliation C. Marginal aggregation of chromoplasm
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