全 文 ：植物学通报 2006, 23 (3): 255~261
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-10-09; 接受日期: 2006-03-10
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30271045)和黑龙江省杰出青年科学基金(JC-02-11)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: E-mail: xfyan@mail.hl.cn
.研究报告.
氮素形态对黄檗幼苗生长及氮代谢相关酶类的影响
李霞1,2 阎秀峰1* 刘剑锋1,2
(1东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040) (2吉林师范大学生命科学学院 四平 136000)
摘要 通过改变水培溶液中NH4+-N和NO3--N的比例, 研究了不同氮素形态对黄檗(Phellodendron
amurense)幼苗生长及氮代谢相关酶类的影响。结果表明, 硝态氮比例较高的营养供给比铵态氮比例较高
的营养供给有利于黄檗幼苗的生长, 叶片叶绿素含量和可溶性蛋白含量也高。在NH4+-N/NO3--N为25/75
时黄檗幼苗具有最大生物量。在铵态氮比例大的营养供给下, 黄檗幼苗的谷氨酰胺合成酶(GS)活性增强,
而在硝态氮比例大的营养供给下幼苗的硝酸还原酶(NR)活性则较高, 叶片中的硝态氮较低。营养液的氮
素形态及其组成通过影响GS与NR的活性而调控黄檗幼苗的氮素代谢。
关键词 黄檗, 氮素形态, 氮素代谢
Effects of Nitrogen Forms on Nitrogen Metabolism-related En-
zymes and Growth of Phellodendron amurense Seedlings
Xia Li1, 2, Xiufeng Yan1*, Jianfeng Liu1, 2
(1 College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040)
(2 School of Life Sciences, Jilin Normal University, Siping 136000)
Abstract The NH4+-N/NO3--N ratio of nutrient solutions was shifted to study the effects of
nitrogen forms on enzymes related to nitrogen metabolism of corktree seedlings (Phellodendron
amurense). Nutrient solutions with a higher NO3--N than NH4+-N content were beneficial for growth,
and the content of chlorophyll and soluble protein in leaves with this treatment was also high. The
highest biomass occurred when the NH4+-N/NO3--N ratio reached 25/75. Glutamine synthetase (GS)
activity in corktree seedlings increased with NH4+-N ratio, whereas nitrate reductase (NR) activity
increased with increasing NO3--N ratio. The nitrogen form and ratio in nutrition solution could
control nitrogen metabolism by affecting GS and NR activities.
Key words Phellodendron amurense, nitrogen forms, nitrogen metabolism
硝态氮(NO3--N)和铵态氮(NH4+-N)是植物
可利用的主要无机氮素形态(Margolis et al.,
1988; von Wirén et al., 1997), 二者对植物生长和
代谢产生不同的生理效应(孙羲, 1980; 何念祖和
孟赐福, 1987; 崔晓阳, 2001; 张彦东和白尚斌,
2003; 马新明等, 2003; Lenka et al., 2004; Dong et
al., 2004)。硝态氮是一种较铵态氮耗能的无机
氮源, 它的不合理施用易造成氮肥的流失及植物
体内硝酸盐的积累, 而铵态氮的过量施用有可能
抑制植物对K与Ca的吸收, 引起植物体内多方
面代谢失调, 使植物发生铵中毒(张春兰等, 1990;
杜猛军等, 1992)。植物在长期进化中形成了对
256 23(3)
不同氮素形态具有选择吸收的特性(Boxman and
Roelofs, 1988; Marschner et al., 1991; Kronzucker
et al., 1997; Malagoli et al., 2000)。黄檗(Phell-
odendron amurense)是我国名贵中药黄柏的药
源植物, 已被列为国家二级保护植物。虽然黄
檗作为木材与中药原料都很著名, 但关于氮素形
态对黄檗生长及氮代谢相关酶类的影响鲜见报
道。有研究表明, 森林树种中源于酸性土壤环
境的通常喜铵, 来自于pH值较高土壤的树种则
有喜硝的倾向(张福锁等, 1995)。黄檗一般适生
于中性或微酸性土壤, 这是否表明黄檗为喜铵植
物并不明确。氮素是影响生物碱生物合成和
积累的重要营养因子(Baricevic et al., 1999;
Bensaddek et al., 2001; Al-Humaid, 2003), 黄檗中
的主要药用成分小檗碱和药根碱等生物碱的生
物合成过程需要氮素参与。本研究以黄檗为
材料, 旨在初步探讨NH4+-N和NO3--N两种形
态氮素比例对黄檗生理过程的影响, 为生产中合
理施用氮素, 进一步提高黄檗有效药用成分提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 植株培养及处理方法
黄檗(Phellodendron amurense)幼苗在光照
培养室内培养, 温度控制在18～25℃, 每日光照
时间 8小时, 光照强度为 1 200 mmol.m-2.s-1。
水培容器为长 50 cm、宽 37 cm、高 13 cm的
塑料盆, 上覆具孔泡沫板(用于黄檗幼苗的固
定)。2004年 6月从苗圃选取生长一致的一年
生黄檗幼苗, 先用自来水培养2天, 再以1/2浓
度的 Hoag lands 营养液培养 7 天, 继之以
Hoaglands全营养液培养 7天后进行不同氮素
形态处理。处理用营养液采用略做修改的
Hoaglands营养液, 按不同NH4+-N/NO3--N比例
分为 5组(100/0、75/25、50/50、25/75和 0/
100), 总氮浓度均为15.0 mmol.L-1, 大量元素组
成如表1, 微量元素参照张志良和瞿伟菁(2003)
的方法配制(2.860 mg.L-1 H3BO3; 1.015 mg.L-1
MnSO4; 0.079 mg.L-1 CuSO4.5H2O; 0.220 mg.L-1
ZnSO4.7H2O; 0.090 mg.L-1 H2MoO4)。为维持
NH4+-N和NO3--N浓度及离子平衡, 每天用0.1
mmol.L-1的KOH或HCl将营养液pH值调至
6.0左右。为抑制硝化作用, 向溶液添加硝化抑
制剂 2-氯 -6-三氯甲基吡啶, 使其浓度达到 4
mmol.L-1。每个处理设 3个重复, 每个重复 40
株, 营养液3天更换1次, 全天用泵通气, 并相应
地补充损失的水分。
1.2 采样与测定方法
于处理后的第 1、6、13、22和 33天, 分
别采集黄檗幼苗顶端完全展开的第一片成熟叶
片, 并进行各项生理指标的测定, 每重复 5株。
叶绿素含量采用丙酮提取比色法(张志良和瞿伟
菁, 2003)测定, 可溶性蛋白含量采用考马斯亮兰
比色法(Bradford, 1976)测定, 硝态氮和铵态氮测
定参照 Richardson等(1999)方法, 硝酸还原酶
(nitrate reductase, NR)的测定采用活体法(周树
和郑相穆, 1985; 张志良和瞿伟菁, 2003), 谷氨酰
胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的测定参照
Miflin和Lea(1977)的方法, 用752型紫外可见分
光光度计测定吸光值。处理后第33天, 测量黄
檗幼苗的株高和茎直径(基部), 测定单株生物量,
重复 8株。所得数据用 SAS ver 8.1 for Win-
dows进行统计分析, 用方差分析(ANOVA过程)
检验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 氮素形态对黄檗幼苗生长的影响
不同氮素形态的配比对黄檗的生长影响明
显。表2是处理结束时(第33天)黄檗幼苗的生
长状况。可以看出, 处理Ⅳ的株高显著高于其
他4个处理, 而处理Ⅰ的株高显著低于其他4个
处理 , 茎直径和生物量的情况也是如此。
NH4+-N/NO3--N为25/75时, 黄檗幼苗的生长状
况最好, 而单独供给NH4+-N(即NH4+-N/NO3--N
为 100/0)时, 黄檗幼苗的生长状况最差。
2.2 氮素形态对黄檗幼苗叶片中叶绿素含
2572006 李霞 等: 氮素形态对黄檗幼苗生长及氮代谢相关酶类的影响
量的影响
氮素是叶绿素的主要组成元素, 叶片叶绿
素含量明显受到氮素供给的影响。由图1可见,
各处理黄檗幼苗叶片的叶绿素含量随处理时间
的变化趋势相似, 随处理时间增加而叶绿素含量
逐渐降低。从处理后第33天的结果看, 处理Ⅳ
的叶绿素含量显著高于其他4个处理(P<0.01),
处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的叶绿素含量极显著高于处
理Ⅴ(P<0.01), 其中处理Ⅰ和Ⅱ之间差异不显著
(P＞0.05), 但均显著高于处理Ⅲ(P<0.01)。
对应于黄檗幼苗在处理后第 33天的生长
状况(表 2) , 叶片的叶绿素含量也是处理Ⅳ
(NH4+-N/NO3--N为25/75)的最高。不过, 在黄
檗幼苗生长状况最差的处理Ⅰ(NH4+-N/NO3--N
为100/0)的情况下, 叶片的叶绿素含量并不是最
低, 而叶绿素含量最低的处理Ⅴ(NH4+-N/NO3--
N为0/100)的情况下, 黄檗幼苗的生长状况良好
(表2, 图1), 叶片中的叶绿素含量与幼苗生长状
况之间并不一致。
2.3 氮素形态对黄檗幼苗叶片中铵态氮和
硝态氮含量的影响
总体上, 各处理黄檗幼苗叶片的铵态氮含
量随处理时间的增加呈下降趋势, 但除处理Ⅰ外
表 1 处理用营养液中大量元素的组成
Table 1 Components of different mass elements nutrition solution treatments
NH4+-N/ Ca(NO3)2 KNO3 (NH4)2SO4 NH4NO3 CaCl2 KCl KH2PO4 MgSO4
Treatment
NO3--N (mmol.L-1) (mmol.L-1) (mmol.L-1) (mmol.L-1) (mmol.L-1) (mmol.L-1) (mmol.L-1)(mmol.L-1)
Ⅰ 100/0 0 0 7.5 0 5 5 2 2.5
Ⅱ 75/25 1.25 1.25 5.625 0 3.75 3.75 2 2.5
Ⅲ 50/50 0 0 0 7.5 5 5 2 2.5
Ⅳ 25/75 3.75 3.75 1.875 0 1.25 1.25 2 2.5
Ⅴ 0/100 5 5 0 0 0 0 2 2.5
表 2 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗的生长状况
Table 2 Phellodendron amurense seedlings growth condition under different NH4+-N/NO3--N ratios
NH4+-N/ Height Stem diameter Biomass
Treatment
NO3--N (cm) (mm) (g.plant-1)
Ⅰ 100/0 33.54d 2.4e 1.59e
Ⅱ 75/25 38.72c 3.4d 2.06d
Ⅲ 50/50 45.53b 3.5cd 2.32b
Ⅳ 25/75 47.42a 4.5a 2.65a
Ⅴ 0/100 45.61b 3.9b 2.30bc
表中各列不同字母表示差异显著(a=0.05) Different letters in same columns of the table show the significant
differences (a=0.05)
图 1 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗叶片
的叶绿素含量
Fig. 1 Chlorophyll content in leaves of Phellodendron
amurense seedlings under different NH4+-N/NO3--N
ratios
258 23(3)
变化幅度不是很大(图2)。处理初期, 各处理间
的铵态氮含量变化较大, 到处理后期, 各处理间
的铵态氮含量差异变小。在处理最后(第33天),
处理Ⅰ(NH4+-N/NO3--N为100/0)的铵态氮含量
显著高于其他 4个处理(P<0.01), 而其他处理
(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)间的铵态氮含量则无明显
差异(P＞ 0.05)。
不同处理的黄檗幼苗叶片中硝态氮含量随
处理时间的变化趋势是相近的, 除第6天的硝态
氮含量较高外, 总体上相对稳定。不同处理间
的硝态氮含量虽有差异, 但不是很大, 而且缺乏
对应于供给氮素差异的明显规律(图 3)。
2.4 氮素形态对黄檗幼苗叶片中可溶性蛋
白含量的影响
不同处理的黄檗幼苗叶片中, 可溶性蛋白
含量均随处理时间的延长而呈上升趋势(图4)。
处理后第1天, 处理Ⅰ和Ⅲ的可溶性蛋白含量较
高, 处理Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ的相对较低, 且处理Ⅰ和
Ⅲ的可溶性蛋白含量显著高于处理Ⅱ、Ⅳ和
Ⅴ的(P<0.05)。此后, 处理Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的可溶
性蛋白含量上升迅速, 而处理Ⅰ和Ⅱ上升相对缓
慢, 至处理后第 33天, 处理Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的可溶
性蛋白含量间无显著差异(P＞0.05), 而显著高
于处理Ⅰ和Ⅱ(P<0.01)。由此看来, 营养液中
NO3--N比例的增加似乎对黄檗幼苗中可溶性
蛋白的积累有一定的促进作用。
2.5 氮素形态对黄檗幼苗叶片中NR活性
的影响
不同处理的黄檗幼苗叶片中, NR活性存在
较大的差异(图5)。处理后第1天, 处理Ⅳ和Ⅴ
的NR活性显著高于其他处理(P<0.01), 而二者
图 2 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗叶片
的铵态氮含量
Fig. 2 Ammonium content in leaves of Phellodendron
amurense seedlings under different NH4+-N/NO3--N
ratios
图 3 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗叶片
的硝态氮含量
Fig. 3 Nitrate content in leaves of Phellodendron
amurense seedlings under different NH4+-N/NO3--N
ratios
图 4 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗叶片
的可溶性蛋白含量
Fig. 4 Soluble protein content in leaves of Phellod-
endron amurense seedlings under different NH4+-N/
NO3--N ratios
2592006 李霞 等: 氮素形态对黄檗幼苗生长及氮代谢相关酶类的影响
之间差异不显著(P>0.05)。处理Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ的
NR活性依次降低, 彼此间差异显著(P<0.01)。
此期叶片中的NR活性与营养液中的硝态氮含
量存在对应关系, 即溶液中的硝态氮含量高, 黄
檗幼苗叶片中的NR的活性也高。处理后第33
天, 处理Ⅴ的NR活性仍是最高, 且显著高于其
他处理(P<0.01)。此期处理Ⅲ和Ⅳ间与处理Ⅰ
和Ⅱ间的NR活性分别相近(P>0.05), 且处理Ⅲ
和Ⅳ的NR活性显著低于处理Ⅰ和Ⅱ的NR活性
(P<0.05)。
与叶片中的硝态氮含量(图 3)对比分析可
知, 叶片的NR活性与硝态氮含量在处理间有对
应关系。NR活性较高的处理, 硝态氮含量就比
较低; 而NR活性较低的处理, 硝态氮含量就较
高。处理Ⅴ的营养液中硝态氮比例最高, 在处
理后的第1天, 处理Ⅴ幼苗叶片中的硝态氮含量
亦最高。随着处理时间的增加, NR活性有所降
低, 但减弱速率慢于其他处理, 结果在处理后33
天时仍是最高, 其硝态氮含量与其他处理相比也
较低。处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的硝态氮含量与
NR活性间也表现出类似的对应关系。
2.6 氮素形态对黄檗幼苗叶片中GS活性的
影响
由图6可知, GS活性变化与NR刚好相反,
其活性总趋势是逐渐上升的。处理后第 1天,
处理Ⅳ和Ⅴ的GS活性较高, 显著高于处理Ⅰ、
Ⅱ和Ⅲ的结果(P<0.01)。随着处理时间的延长,
处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的GS活性有较快的增长, 而
处理Ⅳ和Ⅴ的酶活性增长缓慢, 与处理后第1天
相反, 在处理后第33天, 处理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的GS
活性较高, 显著高于处理Ⅳ和Ⅴ的(P<0.01)。
结合铵态氮的变化规律可知(图2), 随着处
理时间的增加, 幼苗叶片中铵态氮比例较高的处
理, GS的活性也高。处理后第33天, 处理Ⅰ的
叶片铵态氮含量显著高于其他各处理(P<0.01),
其叶片的 GS活性亦为最高。
3 讨论
通常情况下, 与单一的铵态氮或硝态氮营
养相比, 适度比例的铵态氮和硝态氮对绝大多数
的旱作作物生长发育有促进作用(Crawford and
Chalk, 1993)。本实验中, 在NH4+-N/NO3--N为
25/75时黄檗幼苗获得了最大的生物量(表2), 此
时黄檗幼苗叶片中的叶绿素含量最高(图 1)。
在植物NR活性与蛋白质含量的关系方面, 国内
图 5 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗叶片
的NR活性
Fig. 5 Nitrate reductase activity in leaves of Phellod-
endron amurense seedlings under different NH4+-N/
NO3--N ratios
图 6 不同NH4+-N/NO3--N配比下黄檗幼苗叶片
的GS活性
Fig.6 Glutamine synthetase activity in leaves of
Phellodendron amurense seedlings under different
NH4+-N/NO3--N ratios
260 23(3)
外学者进行过许多研究 , 结论很不一致。
Hageman和Flesher (1960)以玉米为材料研究表
明, 叶片NR活力与蛋白质含量之间存在显著的
正向相关性。但是, 也有一些人研究认为NR活
性与蛋白质含量相关性不显著(Campbell and
Smarrelli, 1986)。朱长甫等 (1992)研究认为大豆
籽粒蛋白质与叶片NR活性呈显著负相关。在
本研究中, 总体看来硝态氮比例较高的营养供给
(处理Ⅳ和Ⅴ)比铵态氮比例较高的营养供给(处
理Ⅰ和Ⅱ)有利于黄檗幼苗的生长, 其NR活性
较高, 叶片中可溶性蛋白含量也相对较高(图
4)。由此可见, 黄檗幼苗叶片中可溶性蛋白的
含量随NR活性的增加而提高, 这与Hageman
和Flesher (1960)的结果较为相似。尽管有研究
表明, 森林树种中源于酸性土壤环境的通常喜
铵, 而黄檗一般适生于中性或微酸性土壤, 看来
黄檗应属于所谓的喜硝树种。也许幼苗和成
树对土壤营养供给的反应是有差异的。
NR、GS和GOGAT是植物氮素代谢的关
键酶, 特别是GS参与多种氮代谢的调节, 是氮
代谢中心的多功能酶。其中, NR是一种诱导
酶, 其活性取决于介质中的NO3-浓度。在一
定浓度范围内, 植物体内的NO3-浓度与NR的
活性呈正相关, 且NR只有在NO3-溶液中经过
一段时间的诱导才能逐步形成。然而, 近年也
有研究表明, 即使同一物种, 不同品种间的NR
活性并非只受硝态氮的激活。中筋小麦豫麦
49在施用铵态氮时, 3种氮素同化关键酶活性均
有较大增强(王小纯等, 2005)。在本研究中, 随
着处理时间的延长, 硝态氮比例高的处理下幼苗
的NR活性也高, 33天时, 纯铵态氮供应植株中
的NR活性也很高, 这可能与铵态氮对NR存在
某种未知的激活机制有关。随着处理天数的
延长, 铵态氮比例高的处理下, 黄檗幼苗的GS
活性也高(图3), 硝态氮比例高的处理下幼苗的
NR活性也高, 叶片中的硝态氮反而较低。这可
能与铵态氮促进GS的活性、硝态氮促进NR
活性导致NO3-同化而降低叶片中NO3-含量有
关, 营养液的氮素形态及其组成通过影响GS与
NR的活性而调控黄檗幼苗的氮代谢。
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