全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 29~36
Chinese Bulletin of Botany
①国家 863计划子课题项目(2001AA241173)和河南省自然科学基金项目(0211030900)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: lwgwm@163.com
收稿日期: 2004-05-20 接受日期: 2004-08-08 责任编辑: 孙冬花
综述
植物离体组织染色体加倍诱导同源四倍体①
刘文革② 阎志红
(中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009)
摘要 随着生物技术的迅速发展, 通过植物离体组织人工诱导多倍体已经成为获得多倍体植株的有
效途径。本文就植物离体组织染色体加倍诱导同源四倍体的研究进展做一介绍, 详细评述了植物离体
组织细胞加倍的途径、影响植物离体组织加倍的因素、利用不同诱导剂进行处理效果比较及离体组织
材料的早期倍性鉴定技术等, 并展望了植物离体诱导同源四倍体的前景。
关键词 同源四倍体, 离体, 染色体加倍
In Vitro Induction of Autotetraploids in Plants
LIU Wen-Ge② YAN Zhi-Hong
(Zhengzhou Fruit Research Institute, the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009)
Abstract Artificial chromosome doubling in vitro is an efficient approach to produce polyp-
loidy plants. This paper reviews advances in in vitro induction of autotetraploids in plants. It
compares methods and the influence of chromosomal manipulation in vitro as well as different
chromosome-doubling inhibitor capacities and introduces the identification of the different ploidy
levels in early in vitro regeneration. It also discusses the potential of obtaining polyploidy
plants through in vitro induction.
Key words Autotetraploid, In vitro, Chromosome-doubling
自1937年Blakeslee和Avery发现秋水仙
素 (colchicine) 诱导染色体加倍的效果以后, 掀
起了植物诱变多倍体育种的热潮。1937年也
被称为“多倍体新时代的开始”, 许多植物
已经获得了人工多倍体(巴拉诺夫, 1958)。人
工多倍体植物在生产上的应用越来越广, 诸如
三倍体无籽西瓜(Citrullus lanatus)、甜菜
(Be ta vu lgar i s )及四倍体白菜(Brass i ca
oleracea)等(刘文革等, 2003)。以前主要用秋
水仙素等诱导剂对植株整体诱导获得同源四
倍体, 即通过处理植株的生长点来达到染色体
加倍的目的。随着现代生物技术的迅速发展,
植物组织培养技术的成熟, 通过植物离体组织
诱导同源四倍体已经成为获得多倍体植株的
有效途径, 通过秋水仙素或其他诱导剂离体诱
导多倍体在许多作物上都有报道。本文就植
物离体组织染色体加倍诱导同源四倍体的研
究进展做一介绍。
30 22(增刊)
1 离体组织细胞染色体加倍的途径
1.1 利用植物组织培养过程中自发出现四
倍体无性系变异获得四倍体再生植株
四倍体作为一种最常见的无性系变异发
生于从幼胚子叶、3～7 天的幼苗子叶、真
叶、来自原生质的愈伤组织以及胚性体再生
的植株。Odake等(1993)用液体培养基诱导芦
笋(Asparagus officinalis)胚性体的再生植株几
乎全是四倍体。Rugini 等(1996)从油橄榄
(Olea europaea)的混合多倍体突变体离体组织
中分离出三倍体和四倍体橄榄植株。Ezura
等(1992)发现在甜瓜(Cucumis melo)组织培养
过程中, 愈伤组织中的二倍体细胞百分率降低,
四倍体细胞百分率增加, 再生植株中四倍体植
株占 26%～37%。在西瓜幼胚子叶和无性胚
再生的植株中也观察到了四倍体变异
(Compton and Gray, 1994)。Zhang 等(1994)
利用诱导再生植株过程中发生染色体数目变
异, 获得了较高频率的西瓜四倍体变异。
1.2 在培养过程中, 用秋水仙素等诱导剂
处理培养材料使染色体加倍
将外植体第一次离体培养时, 直接接种在
含秋水仙素的诱导培养基上, 诱发变异一段时
间再依次转入分化培养基和成苗培养基培养成
再生变异株。Zhang 等(1994)在西瓜幼胚子叶
不定芽再生的前7 天, 于再生培养基中添加0.
05%秋水仙素, 使再生植株中四倍体频率由对
照的8%(不加秋水仙素)提高到52%, 大大提高
了利用组织培养再生四倍体的频率和效率。
将经外植体诱导的细胞、胚状体、愈伤
组织及不定芽等转入含有秋水仙素的诱导培
养基中, 经一定时间处理后, 再转入分化培养
基和成苗培养基培养成再生变异株, 并经筛选
固定。刘俊等( 2 0 0 2 )对芦荟( A s p a r a g u s
officinalis)组织培养诱导出的丛生芽、微块
茎及愈伤组织分别用不同浓度秋水仙素处理,
丛生芽和微块茎能较好地诱导出变异体。陈
柏君等(2000)用黄芩(Scutellaria baicalensis)
带绿色芽点的愈伤组织直接接种在含秋水仙
素的培养基上, 组培材料的生长或分化都不同
程度受到抑制, 部分死亡, 但存活的材料都陆
续分化成苗, 以浓度10 mg.L-1的秋水仙素处
理的诱导率最高, 为 16.7%。
2 影响植物离体组织加倍的因素
2.1 基因型
供体植株的基因型对离体诱导四倍体效
果影响特别大, 利用组织培养离体诱导同源多
倍体在许多植物上都很成功。报道的药用植
物有:宁夏枸杞(Lycium barbarum)、白术
(Atractylodes macrocephala)、丹参(Salvia
miltiorrhiza)、黄芩、川白芷(Atractylodes
m a c r o c e p h a l a )和金荞麦( F a g o p y r u m
tataricum)等(陈柏君等, 2000); 花卉作物有:南
荻(Tr iar rhena lu ta r io rpar ia )、大岩桐
( S i n n i n g i a s p e c i o s a )、刺槐( R o b i n i a
pseudoacacia)及百合(Lilinm brownn)等(Rose
et al., 2001); 果树作物有:苹果(Malus pumila)
(Bouvier et al., 1994)、猕猴桃(Actinidia spp.)
和葡萄(Vitis vinifera)等。以上植物大多以
根、茎和叶等器官为收获对象且大多通过营
养繁殖, 因此获得很好效果。蔬菜作物有:西
瓜、甜瓜、黄瓜(Cucumis sativus)、芦笋、
黄花菜( H e m e r o c a l l i s c i t r i n g )、番茄
(Lycopersicon esculentum)、白菜和蚕豆
(Vicia faba)(刘文革等, 2003); 农作物有:水稻
(Oryza sat iva )、玉米(Zea mays )、高粱
(Sorghum vulgare)及甜菜等。以种子繁殖为
目的的一年生作物离体诱导四倍体相对较
难。同一作物不同品种其诱导率也不同。
2.2 外植体的种类
诱导多倍体的离体材料一般是愈伤组
织、胚状体和茎尖组织, 也可以用叶片和子
房(Frederick and Xubai, 1991)等材料直接诱导,
不同的外植体对四倍体变异影响很大。
312005 刘文革等: 植物离体组织染色体加倍诱导同源四倍体
愈伤组织 组织分化再生能力较强的作
物, 诱导染色体加倍用愈伤组织或胚状体为材
料较好。因为愈伤组织的细胞可以分散, 秋
水仙素处理可以提高染色体加倍的效率。吴
清等(2001)对金荞麦的同源四倍体诱导认为,
处理材料以愈伤组织较为理想, 最好是将带绿
色芽点的愈伤组织直接浸泡于0.1%秋水仙素
溶液中10 小时, 再接种于不含秋水仙素的培养
基上使其分化成苗。何立珍等(1997)用南荻
的幼穗和下胚轴产生的带绿芽点愈伤组织进行
诱导。在0.05%秋水仙素的培养基上处理24～
48 小时, 经培养而诱导成变异试管苗。张承
妹和陆家安(1995)认为黄瓜组织培养中只有秋
水仙素作用于愈伤组织的胚性细胞才能分化
出四倍体再生植株, 而黄瓜愈伤组织的表面常
为不能分化的薄壁细胞, 秋水仙素难以透入。
不定芽 彭菲和郭昱(2000)对川白芷的
叶轴切段进行离体诱导加倍时, 当叶轴外植体
上刚刚开始出现不定芽的分化时, 立即用秋水
仙素溶液处理, 效果明显。郑思乡等(1995)也
认为采用不定芽诱导技术对苎麻(Boehmeria
nivea)多倍体的稳定效果最佳, 不定芽是由表
皮单细胞或邻近几个细胞发育而来, 若发生的
部位为多倍体细胞, 则不定芽为完全多倍体, 此
时最适合做诱变处理。刘俊等(2002)对芦荟
组织培养诱导出的丛生芽、微块茎和愈伤组
织分别用不同浓度秋水仙素处理, 丛生芽和微
块茎能较好地诱导出变异体。
茎尖 马国斌和王鸣(2002)用西瓜和甜瓜
茎尖离体诱导四倍体, 其诱导频率受茎尖苗
龄、培养基中激素浓度、秋水仙素浓度以及
处理时间等因素的影响。8 天左右苗龄的茎
尖, 在含有0.1%秋水仙素和较低浓度细胞分裂
素的液体培养基中处理24 ～48 小时的诱导方
法最有利于四倍体的产生。用茎尖为诱导材
料的好处是不必建立材料的再生系统, 因此对
大多数作物都适用。
子叶和叶片 刘庆忠等(2001)以苹果‘皇
家嘎拉’品种成年树上的离体新梢叶片作为外
植体, 在含有低浓度(25 mg.L-1)秋水仙素的液
体培养基上长时间(5天)接触共培养诱导, 可有
效诱导四倍体。Adelberg 等(1994)对甜瓜子
叶再生四倍体的条件进行了研究得出, 从子叶
近胚轴端子叶组织再生的植株四倍体频率显
著高于从子叶其他部位再生的植株。不同作
物离体材料的选择不同。
2.3 诱导组织块的大小
培养方式和接种愈伤组织团块大小等对
加倍效果有一定的影响。张俊莲等(1997)分
析秋水仙素对当归(Anglica sinensis)多倍体愈
伤组织诱导的影响因素, 认为团块大小对诱导
处理结束时二倍体和四倍体细胞的比例无显
著影响, 对八倍体细胞的比例影响达显著水平,
小块愈伤组织中 8x细胞比大块中高 7.83%。
但也和处理时间有关, 较短时间秋水仙素处理,
小块接种物因为更充分的诱导作用而获得较
多的多倍体体细胞。
2.4 培养基中激素种类和浓度
主要是不通过秋水仙素诱导时, 培养基中
的激素种类和浓度对多倍体再生植株的诱导
影响很大。郭启高等(2000)在对西瓜子叶离
体培养过程中, 在芽再生培养基中仅添加BA,
出现较高的四倍体诱导频率, 通过对根尖染色
体数目的检测, 有些品种的四倍体诱导频率可
达40%～50%。顾蔚(1999)试验得出, 植物激
素能引起蚕豆愈伤组织染色体发生加倍和减
倍, 特别在NAA为5 mg.L-1, KT为0.5 mg.L-1
时能获得较多的单倍体, 同时NAA在30 mg.
L-1, KT在7.5 mg.L-1能产生78.18%的四倍体
细胞, 说明较高浓度的植物激素组合有利于刺
激其愈伤组织中染色体的加倍过程。NAA是
一种较为适宜的生长调节剂, NAA浓度不仅影
响愈伤组织的质量, 而且影响再生苗频率及染
色体加倍率。较高的 NAA浓度可导致较低
的愈伤组织再生苗分化率和很高的染色体加
倍率; 相反, 低浓度NAA则产生高频率的再生
32 22(增刊)
苗分化率与低频率的染色体加倍率。只有当
NAA浓度较为适宜时(2 mg.L-1), 可得到较高
的再生苗分化率(达60%～70%)和再生苗的染
色体加倍率(50%～60%), 为选择所需倍性植株
提供了更多的机会(王清等, 1997)。
2.5 诱导方式
2.5.1 固体培养基法 Adaniya和Shirai(2001)
对生姜(Zingber offcinale)的茎尖秋水仙素诱
导四倍体, 认为固体培养比液体培养更有效。
在MS培养基中加入2.0 mg.L-1 BA、0.05 mg.
L-1 NAA和0.2%秋水仙素处理茎尖8天, 是诱
导生姜四倍体最有效的方法。王鸿鹤等
(1999)认为, 将重瓣大岩桐的叶片预培养一周,
转到含不同浓度秋水仙素的固体培养基中处
理, 另外用预培养的外植体浸入秋水仙素溶液
中, 比较得出, 固体培养法比液体浸泡处理法
好, 认为液体浸泡处理法对外植体的伤害更直
接。周嘉裕等( 2 0 0 2 )以辣椒( C a p s i c u m
frutescens)的下胚轴为外植体, 在MS+6 BA2.
0 mg.L-1 +IAA 1.0 mg.L-1培养基中诱导出愈
伤组织, 再用加入秋水仙碱的培养基和液体浸
泡两种方法处理愈伤组织, 结果表明: 加入秋
水仙碱的培养基法优于液体浸泡法, 加倍率可
达 8 0 %。
2.5.2 液体培养基浸泡法 直接用秋水仙素
溶液浸泡外植体后再转到不含秋水仙素的诱
导培养基上培养。van Duren等(1996)认为用
15 mmol.L-1 oryzalin和2%DMSO的液体培养
基处理香蕉SH-3362的茎尖7 天, 是最有效产
生四倍体再生组织和低细胞嵌合体的离体诱
导方法。Li 等(1999)把西瓜的茎尖放入含0.1
mg.L-1秋水仙素的液体培养基中, 在弱散射光
下, 用摇床摇动24 小时, 再接种到固体培养基
上培养, 此法最有利于西瓜和甜瓜四倍体产
生。吴清等(2001)对金荞麦的同源四倍体诱
导认为, 直接浸泡在秋水仙素溶液中优于接种
在附加秋水仙素固体培养基上, 前者最高的诱
导率可达 43.3%。
2.5.3 用棉球蘸取秋水仙素溶液覆盖于组
织块上 周朴华等(1995)对黄花菜诱导时认
为, 用浸有0.05%秋水仙素+2%二甲基亚砜溶
液的棉花覆盖带芽状突起的球状体, 诱变率达
60.0%～65.2%。刘俊等(2002)也认为以0.2%
的秋水仙素棉球覆盖处理芦荟的丛生芽48 小
时诱变效果最好。
2.6 诱导剂的浓度和处理时间
在培养基中秋水仙素的加入对分化的起
始及幼苗的长势均有一定的抑制作用, 且浓度
越高抑制作用也越明显。随着处理秋水仙素
浓度的提高及时间的延长, 外植体和愈伤组织
等死亡率及受害率也随之提高, 而且再生能力
也相应下降。诱变的关键是既要获得较高的
变异率又要保持较高的成活率。在某个剂量
范围内多倍体变异率随诱变剂量的升高而增
加, 当超过某一剂量时, 变异率反而有所下降。
选择合适的浓度和处理时间, 对诱导染色体加
倍至关重要。最适宜的秋水仙素浓度和处理
时间决定于植物物种对秋水仙素的敏感性。
不同物种、不同外植体及不同处理方式所用
秋水仙素浓度不同。刘选明等(1996)得出, 在
秋水仙素溶液中加入适当浓度二甲亚砜对龙
牙百合小鳞茎的加倍效果有促进作用, 但浓度
偏高或浸泡时间过长则出现负效应。
3 不同诱导剂进行诱导
3.1 秋水仙素
秋水仙素是最普遍被用来诱导染色体加
倍的化学诱导剂, 秋水仙素能抑制细胞有丝分
裂时纺锤丝的形成, 而使分裂了的染色体停留
在赤道板上不向两极移动, 细胞中间也不形成
核膜。这样染色体的分裂虽照常进行, 但细
胞未分裂, 从而使细胞核内的染色体加倍。
离体诱导用秋水仙素作诱导剂在许多作物上
都很成功, 但在许多物种上, 秋水仙素容易产
生副作用, 诸如不育及植株生长不正常, 由于
细胞分裂的不同步性, 而得到畸形植株(Chalak
332005 刘文革等: 植物离体组织染色体加倍诱导同源四倍体
and Legave, 1996)。秋水仙素对离体叶片有
较强的毒害作用, 能明显抑制不定芽的分化, 其
毒害作用使其分化的植株生长缓慢, 继代几次
后, 在培养中逐渐褐化死亡(王长泉等, 1997)。
3.2 二硝基甲苯类除草剂
二硝基甲苯类除草剂(DNH)也可作为诱导
剂, 此类除草剂的作用是通过干扰纺锤体的机
制而抑制细胞分裂中期的有丝分裂(唐除痴等,
1998)。如甲基胺草磷(amiprophos methyl,
APM)、氨氟乐灵(pronamide)、氨磺乐灵
(oryzalin)和氧乐灵(trifluralin), 这些在离体情况
下对植物微管蛋白作用比秋水仙素更有效
(Morejohn et al., 1987; Hansen et al., 1998)。
Oryzalin诱导剂在玉米(Wan et al., 1991)、苹
果(Bouvier et al., 1994)和猕猴桃(Chalak and
Legave, 1996)等作物上, 用于离体染色体加倍
方面, 被认为比秋水仙素更有效。Oryzalin在
低浓度下使植株多倍体化是由于oryzalin和微
管蛋白的高亲和性及形成oryzalin-微管蛋白
复合体, 更主要的是oryzalin通过影响Ca2+在
微管丝组装中的作用干扰细胞器的Ca2+运输
系统, 这也可能是oryzalin高效诱导多倍体化
的原因。这两种因素共同作用导致 oryzalin
使更多微管解聚合, 最终导致产生四倍体的频
率比秋水仙素(仅一种作用)高(Ganga and
Chezhiyan, 2002)。
Eeckhaut 等(2002)对杜鹃花(Rhododen-
dron micranthum)的离体诱导用 oryzalin和
triflualin对种子萌发产生的无菌幼苗进行处
理, 获得四倍体变异株, 而秋水仙素处理的大
部分死亡。Takamura 等(2002)用黄草消
(surflan)对Lily进行诱导, 在低浓度情况下(0.
0025%)仍然可以产生多倍体, 在浓度为 0.
0075%时, 其诱导多倍体频率可以达 86%、
68%及 100%。Surflan也是一种能诱导有丝
分裂多倍体化的化学试剂, 其只含有 4 0 %
oryzalin的活性成分, 对植物的副作用小, 比
colchicine 和oryzalin更便宜, 在离体诱导情况
下可以作为 oryzalin的替代物。
此外, 还可以利用N2O气体对植物进行诱
导成四倍体(Berdahl and Barker, 1991)。
4 离体组织材料的早期倍性鉴定
在离体培养研究过程中, 对诱导的组织材
料进行有效的倍性鉴定是不可缺少的。常需
要对植株或所需要的材料进行倍性鉴定, 以期
获得不同的倍性材料。以下是几种倍性早期
鉴定方法。
4.1 染色体直接计数法
通过对试管苗生根后的根尖细胞染色体
直接计数, 是最有效的方法。郭启高等(2000)
在离体培养过程中利用不定芽叶尖染色体计
数, 可以在组织培养早期100%检出倍性, 即可
转入分化培养基进行扩繁。
4.2 扫描细胞光度仪鉴定
采用扫描细胞光度仪(也叫倍性分析仪)进
行鉴定, 用流式细胞测定法迅速测定叶片单个
细胞核内DNA含量, 根据DNA含量的曲线图
推断细胞的倍性。特别是在离体培养过程中,
试管中的芽或小植株很小且很嫩时, 此方法仅
用1 cm×1 cm的样品就很容易决定其材料倍性
(刘庆忠等, 2001), 从而能快速地在试管苗时期
进行染色体倍性分析。该方法可以节约大量
的时间和种植费用, 而且不受植物取材部位和
细胞所处的时期限制 , 可以是叶片、茎、
根、花、果皮和种子等, 近些年在许多作物
上都得到使用(Ben et al., 2000)。但该方法测
定费用太高。
4.3 细胞形态学鉴定法
关于叶片保卫细胞的大小、单位面积上
的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目
与倍性具有高度的相关性。Sari等(1999)根据
保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保
卫细胞中叶绿体的数目, 可以有效区分倍性。
Tambong等(1998)对Cocoyam的小球茎利用
秋水仙素离体诱导时, 观察气孔长度和保卫细
34 22(增刊)
参 考 文 献
胞的长度与染色体数目呈正相关。Compton
等(1999)及刘文革等(2005)用二乙酸盐荧光黄
(fluorescein diacetate, FDA)涂抹在西瓜离体幼
叶的下表皮上, 在显微镜和紫外光下观察保卫
细胞叶绿体的荧光, 二倍体和四倍体的每对保
卫细胞的叶绿体数目平均分别为9.7和17.8。
Cohen和Yao (1996)认为用气孔长度比
其他方法都简单易行, 不需要昂贵的设备 ,
仅需要用胶带揭掉表皮, 用塑料印膜印记既
可。测定气孔保卫细胞的大小与染色体数
目检验法相结合, 可以快速准确地筛选出加
倍植株。
4.4 逆境胁迫法
郭启高等(2000)在西瓜子叶离体组织培养
中利用西瓜二倍体和四倍体对高温和低温的
不同反应, 进行倍性鉴定。他们在 50 ℃下处
理西瓜再生苗 10小时, 二倍体的外植体全部
受害甚至死亡, 四倍体的外植体无一死亡, 其
85%以上的外植体还可正常发育。在 0 ℃下
处理5小时, 二倍体死亡率达100%, 四倍体超
过 60%的外植体还能正常生长。因此通过此
方法鉴定的倍性符合度为 90%和80%。这种
方法省掉了独立的单株倍性鉴定过程, 只需对
试管再生苗进行一次短时处理, 即可筛选出四
倍体, 但此方法还需要进一步研究。
4.5 植物形态学鉴定法
不同倍性植株在早期幼苗形态上有比较
明显的差别, 主要表现叶片大、厚且多汁, 植
株较壮。在植株生长的不同时期抓住这些肉
眼易辨的典型特征, 就能够简便快速地将变异
成的四倍体植株筛选出来。但这需要很有经
验的眼光, 个别倍性不能确定的植株, 可以用
其他方法加以辅助鉴别 (刘文革和王鸣 ,
2002)。
5 展望
应用组织培养进行多倍体诱导与植株或
种子诱变方法相比, 具有明显的优越性。在
组织培养条件下, 可以反复大批量地在培养瓶
中处理植物愈伤组织及丛生芽等, 从而大大提
高了诱导成功率, 这在植株或种子处理中是难
以做到的; 其次, 组织培养条件不受季节等自
然条件的影响, 诱导条件易于控制, 可以大大
缩短诱导所需要的时间; 另外, 组织培养条件
诱变后的植株, 用试管苗进行根尖染色体鉴定,
比田间更直接。通过离体培养获得四倍体可
以提高再生植株群体中四倍体的频率, 容易控
制诱导条件, 减少异倍性嵌合体。同时鉴定
和筛选出来的多倍体可以立即用组织培养在
短期内迅速繁殖出大量的试管苗, 为多倍体品
种的筛选增加了机会。
通过秋水仙素诱导剂离体诱导多倍体在
许多作物上做了大量工作。近年来, 人们利
用低毒的二硝基甲苯类除草剂(DNH)作为诱导
剂, 取得了很大的进展。最近我们采用3种二
硝基苯胺类诱导剂( t r i f lu ra l in , bu t ra l in ,
pendimethalin)对西瓜子叶、茎尖及愈伤组织
进行诱导, 已经获得四倍体西瓜植株。二硝
基苯胺类诱导剂比秋水仙素毒性小, 诱导频率
高, 且成本较低, 很有发展前景。但对于许多
植物通过离体诱导获得同源四倍体途径, 由于
受到植物基因型及器官组织等影响, 就要针对
某种植物进行探索, 找出适合某种植物离体诱
导的技术体系, 这样人们才能诱导出更多的人
工多倍体植物来。
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