全 文 ：植物学通报 2005, 22 (5): 532~540
Chinese Bulletin of Botany
①通讯作者。Author for correspondence. E-mail: Duyg@dicp.ac.cn
收稿日期: 2004-12-09 接受日期: 2005-06-24 责任编辑: 白羽红
植物代谢组学的研究方法及其应用
尹 恒 李曙光 白雪芳 杜昱光①
(中国科学院大连化学物理研究所 大连 116023)
摘要 代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物。植物代谢组学是
指对植物抽提物中代谢组进行高通量、无偏差全面分析的技术。近年来, 植物代谢组学研究取得了很
大进展。本文介绍了其含义、历史沿革及研究方法, 并用典型实例阐释了它的应用方向。
关键词 植物, 代谢组, 代谢组学, 研究方法, 应用
Research Advances in Plant Metabolomics
YIN Heng LI Shu-Guang BAI Xue-Fang DU Yu-Guang①
(Dalian Institute of Chemical Physics, the Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023)
Abstract The metabolome refers to all the low-molecular-weight metabolites present in an
organism or cell in a particular physiological period. The term plant metabolomics is used for
defining the technology of high-throughput, nonbiased analyses of the metabolome of plant
extracts. Research into plant metabolomics has advanced greatly during recent years. This re-
view introduces the definition, history and research approaches of plant metabolomics and
gives several typical examples to elucidate the application of plant metabolomics.
Key words Plant, Metabolome, Metabolomics, Research approachs, Application
近年来, 随着生命科学研究的发展, 尤其是
在完成拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻
(Oryza sativa)等植物的基因组测序后, 植物生
物学发生了翻天覆地的变化。人们已经把目
光从基因的测序转移到了基因的功能研究。
在研究DNA的基因组学、mRNA的转录组学
及蛋白质的蛋白组学后, 接踵而来的是研究代
谢物的代谢组学(Hall et al., 2002)。代谢组学
的概念来源于代谢组, 代谢组是指某一生物或
细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代
谢产物, 代谢组学则是对某一生物或细胞在一
特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时
进行定性和定量分析的一门新学科(Goodacre,
2004)。它是以组群指标分析为基础, 以高通
量检测和数据处理为手段, 以信息建模与系统
整合为目标的系统生物学的一个分支。
代谢物是细胞调控过程的终产物, 它们的
种类和数量变化被视为生物系统对基因或环
境变化的最终响应(Fiehn, 2002)。植物内源代
谢物对植物的生长发育有重要作用(Pichersky
综述
5332005 尹恒等: 植物代谢组学的研究方法及其应用
and Gang, 2000)。植物中代谢物超过20万种,
有维持植物生命活动和生长发育所必需的初
生代谢物; 还有利用初生代谢物生成的与植物
抗病和抗逆关系密切的次生代谢物, 所以对植
物代谢物进行分析是十分必要的。
但是, 由于植物代谢物在时间和空间都具
有高度的动态性(Stitt and Fernie, 2003)。尤
其是次生代谢物种类繁多、结构迥异, 且产
生和分布通常有种属、器官、组织以及生长
发育时期的特异性, 难于进行分离分析, 所以
人们一直在寻找更为强大的检测分析工具。
在代谢物分析领域, 人们已经提出了目标分
析、代谢产物指纹分析、代谢产物轮廓分析
和代谢表型分析、代谢组学分析等概念。20
世纪90年代初, Sauter等(1991)首先将代谢组
分析引入植物系统诊断, 此后关于植物代谢组
学的研究逐年增多。随着拟南芥等植物的基
因组测序完成以及代谢物分析手段的改进和
提高, 今后几年进入此研究领域的科学家和研
究机构将越来越多。
1 研究方法
代谢组学分析流程包括样品制备、代谢
物成分分析鉴定和数据分析与解释。由于植
物中代谢物的种类繁多, 而目前可用的成分检
测和数据分析方法又多种多样, 所以根据研究
对象不同, 采用的样品制备、分离鉴定手段
及数据分析方法各不相同。
1.1 样品制备
植物代谢物样品制备分为组织取样、匀
浆、抽提、保存和样品预处理等步骤
(Weckwerth and Fiehn, 2002)。代谢产物通
常用水或有机溶剂(如甲醇和己烷等)分别提
取, 获得水提取物和有机溶剂提取物, 从而把
非极性的亲脂相和极性相分开。分析之前,
通常先用固相微萃取、固相萃取和亲和色谱
等方法进行预处理(邱德有和黄璐琦, 2004)。
然而植物代谢物千差万别, 其中很多物质稍受
干扰结构就会发生改变, 且对其分析鉴定所采
用的设备也不同。目前还没有适合所有代谢
物的抽提方法, 通常只能根据所要分析的代谢
物特性及使用的鉴定手段选择合适的提取方
法。而抽提时间、温度、溶剂成分和质量
及实验者的技巧等诸多因素也将影响样品制
备的水平。
1.2 成分分析鉴定
对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴
定是代谢组学研究的关键步骤, 也是最困难和
多变的步骤。与原有的各种组学技术只分析
特定类型的物质不同, 代谢组学分析对象的大
小、数量、官能团、挥发性、带电性、电
迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很
大, 要对它们进行无偏向的全面分析, 单一的
分离分析手段往往难以保证。色谱、质谱、
核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸
收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离
分析手段及其组合都被应用于代谢组学的研
究(许国旺和杨军, 2003), 一般根据样品的特性
和实验目的, 可选择最合适的分析方法。目
前最常用的分离分析手段是气相色谱和质谱
联用(GC/MS)、液相色谱和质谱联用(LC/
MS)、核磁共振(NMR)以及傅里叶变换红外
光谱与质谱联用(FTIR/MS)。
1.2.1 气相色谱和质谱联用, 液相色谱和
质谱联用 色谱是最常用和有效的分离分析
工具, 其与质谱的联用则可以完成从成分分离
到鉴定的一整套工作。GC/MS和 LC/MS可
以同时检测出数百种化合物, 包括糖类、有
机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代
谢物(Taylor et al., 2002; Tolstikov and Fiehn,
2002)。GC/MS有很好的分离效率且相对较为
经济, 但需要对样品进行衍生化预处理,这一步
骤会耗费额外的时间, 甚至引起样品的变化。
受此限制, GC/MS无法分析膜脂等热不稳定性
的物质和分子量较大的代谢产物。Roessner
等(2000, 2001a, 2001b)利用GC/MS对马铃薯
534 22(5)
(Solanum tuberosum ‘Desirée’)进行高通量代
谢物分析, 同时检测到150种化合物, 其中 77
种被鉴定为氨基酸、有机酸或糖。利用 GC/
MS进行代谢组学研究的代表性工作是Fiehn
等(2000)的一系列有关植物代谢的研究。他
们用GC/MS 对模式植物拟南芥的叶子提取物
进行了研究,定量分析了326 个化合物,并确定
了其中部分化合物的结构。
LC/MS中目前应用较广的是高效液相色
谱和质谱联用(HPLC/MS)。HPLC与GC原理
相似, 但在进样前不需进行衍生化处理, 适合
那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子
量较大的化合物。HPLC/MS选择性和灵敏度
都较好, 但分析的时间相对较长, 且需依赖纯
的参照物。Fiehn(2003)利用 HPLC/MS检测
笋瓜(Cucurbita maxima ‘Gelber Zentner’)叶柄
和叶片抽提物, 检测到了超过400种代谢物, 有
90种被定性, 其中大部分是氨基酸、糖和糖
苷。Huhman和 Sumner(2002)在紫花苜蓿
(Medicago sativa,Polish variety Kleszczewska)
和蒺藜状苜蓿 (Medicago truncatula)中各鉴
定出15个和27个皂角甙, 并在紫花苜蓿中找
到了 2个新的乙二酸皂角甙。
最近, 由 LC/MS发展而来的毛细管电泳
质谱联用技术(CE/MS)也被应用到代谢组学研
究中。CE/MS分离样品效率比普通的色谱质
谱联用要高得多, 更为便利的是其耗时很短, 往
往在 10分钟内就能完成一个样品的分析过
程。Tolstikov等(2003)用CE/MS对拟南芥进
行代谢组分析, 分离效果远远超过了Fiehn等
用GC/MS进行的先期工作, 检测到超过700个
不同的色谱峰值, 其中包括许多以前未检测到
的脂类化合物及次生代谢物。
色谱质谱连用技术是目前植物代谢组学
研究中应用最多的方法, 它具有分离效率高、
灵敏度好及经济实用等优点。但需要解决的
主要问题是: 大量色谱峰的识别问题以及方法
的重现性问题。
1.2.2 核磁共振 在代谢组学领域, 核磁共振
最初被用于病理生理学和药理毒理学方面
(Nicholson et al., 1999),但目前也已被广泛用
于植物代谢组学研究(Blingly and Douce,2001),
其优点是非常明显的。首先, 不同于质谱具
有离子化程度和基质干扰等问题, NMR没有偏
向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。其
次, NMR无损伤性,不破坏样品的结构和性质,
可在接近生理条件下进行实验,可在一定的温
度和缓冲液范围内选择实验条件,可以进行实
时和动态的检测。此外, NMR 氢谱的谱峰与
样品中各化合物的氢原子是一一对应的, 所测
样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关
的谱峰, 图谱中信号的相对强弱反映样品中各
组分的相对含量, 更为直观(颜贤忠等, 2004)。
因此, NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂
成分。Ward等(2003)用1H-NMR 对多种不同
生态型的拟南芥进行了代谢组分析, 在碳水化
合物和脂肪族物质中都发现了差异, 说明了植
物代谢物和生态型差异的相关性。Hyung-
Kyoon等(2004)用1H-NMR对野生型和过表达
水杨酸合成基因的转基因烟草(N i c o t i a n a
tabacum)的叶片和叶脉进行了研究, 通过进行
TMV嫁接和对照实验, 得到多个峰值变化, 大
部分峰被鉴定为氯原酸、苹果酸和糖。此实
验提供了一种有效的不需过多步预处理程序
的区分野生型和转基因植物的方法。当然
NMR也有其缺点, 与GC/MS和LC/MS相比,
NMR的缺点是灵敏度低,有可能形成信号重
叠,且其对样品制备的要求很高。同时因为动
态范围有限, 很难同时测定生物体系中共存的
浓度相差较大的代谢产物。
1 . 2 . 3 傅里叶变换红外光谱质谱联用
FTIR/MS联用最近也被应用于植物代谢组学
分析。FTIR主要测定样品中各成分的功能基
团和高极性键的振动, 而特定的化学结构有特
定的吸收频率, 通过测定实验样品的红外吸收
频率和强度, 可以辨别出各个成分。FTIR具
5352005 尹恒等: 植物代谢组学的研究方法及其应用
有扫描速度快、光通量大、高分辨率、高
信噪比及测定光谱范围宽的特点; 缺点在于不
可区分异构物, 且组分片段和一些络合离子也
对其有影响, 由于离子抑制不能进行定量分
析。Aharoni等(2002)利用高分辨率的 FTIR/
MS联用仪器对凤梨草莓(Fragaria ananassa)
组织进行了分析, 依据不同的质荷比找到了
5 844个不同质量的物质, 并根据对化合物中高
含量的元素的精确质量测定估计了其中一半
以上物质的化学结构式。结果表明, 在草莓
的不同组织中都含有多种类的初生代谢物(如
氨基酸、脂肪酸和碳水化合物)及次生代谢物
(如类黄酮和萜类化合物)。
1.3 数据分析与解释
样品成分分析鉴定之后, 需要对所获得的
数据进行相应的整合处理, 这也是代谢组学研
究中十分关键的步骤。应用高通量的检测分
析工具可以得到海量的数据, 如果不对其进行
合理的处理, 这些纷扰的数据反而对研究工作
是有害无利的。可应用模式识别和多维统计
分析等方法从这些大量的数据中获得有用的
信息, 这些方法能够为数据降维, 使它们更易
于可视化和分类。目前数据分析常用的两类
算 法 是 基 于 寻 找 模 式 的 非 监 督 方 法
( u n s u p e r v i s e d m e t h o d )和有监督方法
(supervised method)。
1.3.1 非监督方法 非监督方法是用来探索
完全未知的数据特征的方法, 对原始数据信息
依据样本特性进行归类, 把具有相似特征的目
标数据归在同源的类里, 并采用相应的可视化
技术直观地表达出来。应用在此领域的常见
方法有聚类分析(cluster analysis)和主成分分
析(principal components analysis, PCA)等。
聚类分析依据物以类聚的原理分析具有
相似性的事物, 将分类对象置于一个多维空间
中, 根据事物彼此不同的属性进行辨认, 将性
质相近的归入一类, 这样归在同一类的事物具
有高度的相似性; 聚类分析就是把事物按其相
似程度进行分类, 并找出每一类事物共同特征
的分析工具。具体到代谢组学中, 被归入一
类的物质有相同的特征, 可能有相同的功能作
用, 这样通过同一类事物中一个研究较为清晰
的物质可以推断该类中其他物质的功能作用。
聚类分析过程通常可分为以下步骤: 数据收集
并且收集相应的变量; 产生一个相似矩阵; 决定
把目标总体细分为几类, 及其对每一种类别相
应的定义; 实施聚类分析, 产生结果。
主成分分析是目前应用最为广泛的多维
分析方法之一。PCA 的特点是将分散在一组
变量上的信息集中到某几个综合指标, 即主成
分(principal component, PC) 上,利用这些主成
分来描述数据集内部结构,实际上也起着数据
降维的作用。主成分是由原始变量按一定的
权重经线性组合而成的新变量。这些变量具
有以下性质: 1) 每一个PC 之间都是正交的; 2)
第1个PC 包含了数据集的绝大部分方差, 第
2个次之,依此类推。这样,由头 2个或 3个PC
作图,就能够很好地代表数据集所包含的生物
化学变化(Sumnera et al., 2003)。
1.3.2 有监督方法 如果存在一些有关数据
的先验消息和假设, 有监督方法比非监督方法
更适合且更有效。有监督方法在已有知识的
基础上建立信息组(class information),并利用
所建立的组对未知数据进行辨识、归类和预
测。在这类方法中, 由于建立模型时有可供
学习利用的训练样本, 所以称为有监督学习。
应用于该领域的常见方法有线性判别分析
(linear discrimination analysis)、偏最小二乘
法 -显著性分析(PLS-discrimination analysis)
和人工神经元网络(artificial neural networks,
ANN)(Lindon et al., 2001)。
1.3.3 网上数据库 在信息时代, 利用网络
资源进行研究是必不可少的。而对千头万绪
的植物代谢物研究, 建立相应的网上数据库也
是势在必行的。这些数据库的建立也有利于
联结代谢组学与其他系统生物学分支的关系
536 22(5)
(Oliver et al., 2002; Ge et al., 2003)。目前, 最
为成熟的数据库是关于模式植物拟南芥的
The Arabidopsis Information Resource (TAIR)
(Rhee et al., 2003), http://www.arabidopsis.
o r g。其他常用的网上植物资源有 h t t p : / /
www.york.ac.uk/res/garnet/garnet.htm, http: /
/ www.maizegdb.org, http://www.genome.ad.jp/
kegg/ pathway. html。此外网上已有一些与
代谢和代谢组学有关的数据库(Raoul et al.,
2004), 主要介绍以下几个。
ArMet (http://www.armet.org)是一个
涵盖大部分植物代谢组学研究工作的网站,
包含了这些工作开展的时间, 甚至还有详细
的实验步骤, 并将代谢物信息标准化, 以便于
研究者交流。
DOME (关于 OMEs的数据库, http://
medicago.vbi.vt.edu/dome.html) 有许多关于代
谢物的原始数据和分析结果, 同时也有对人们
感兴趣的一些植物物种的分子生物学研究, 分
析结果用多维统计软件处理后可用于 OMEs
的浏览器(BROME)浏览。
MetaCyc (http://metacyc.org) 是一个
关于代谢物的数据库, 阐述了超过150种生
物体中的代谢途径, 包含了从大量的文献和
网上资源中得到的代谢途径、反应、酶和
底物的资料。
MMP(http:/ /www.chem.qmul.ac.uk/
iubmb/enzyme) 对主要代谢途径及涉及的关键
酶进行了详尽的描述。
2 代谢组学在植物中的应用
虽然植物代谢组学目前尚处于萌芽阶段,
但其应用前景是十分广阔的(Maloney, 2004)。
下面介绍其中的部分应用。
2.1 代谢组分析
应用代谢组学技术可同时对大量代谢物
进行定性定量分析, 常用来观察植物在环境条
件改变下的代谢物变化; 也可用于研究同一植
物不同部位或不同时期的代谢物种类与含量
变化; 也可根据相关联的代谢物的量的变化,
推测相应的代谢途径和代谢网络。F i e h n
(2003)利用GC/MS对笋瓜(Cucurbita maxima
‘Gelber Zentner’)的叶柄脉管抽提物和叶片抽
提物进行了代谢物分析, 得到了400多个峰, 通
过与质谱数据库比对, 对其中一小部分进行了
定性, 初步判断为何种物质; 比较了叶柄与叶
片间代谢物组分的不同。值得注意的是, 即
使个体中每种代谢物的量变化很大, 其各组分
间的比值也能一直维持稳定, 这说明了植物中
的代谢物虽然种类繁多, 但都是互相关联的。
植物利用复杂的机制来维持体内主要代谢物
相对稳定的水平。对代谢组的分析力求可检
测样品中每种代谢物, 并可监测各种条件变化
下代谢物的变化, 这是进行功能基因组学研究
的基础。
2.2 代谢途径的描述
在对某一代谢途径中所有代谢物进行了
系统研究后, 下一步工作就是对代谢途径的描
述。在找到该途径一系列底物、产物、中
间体和关键酶的基础上, 阐明这条代谢途径的
调节机制和关键调节位点。用代谢组学手段
可以方便地找到调节位点——因为在该处, 底
物和关键酶的浓度将会发生相反的变化
(Rolleston,1972)。 Tiessen等(2002)用HPLC
对马铃薯块茎进行了代谢组分析, 检测了淀粉
合成途径中的一系列底物、中间物、酶及产
物量的变化, 再通过对野生株和含有异源腺苷
二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)转基因株
马铃薯进行对比研究, 提出了淀粉合成途径中
一种新的调节机制——在离开母体情况下, 马
铃薯块茎中淀粉合成关键酶AGPase的催化亚
基AGPB会发生可逆的氧化还原反应形成二
聚体, 使 AGPase失活, 从而抑制淀粉生成。
目前, 代谢组学应用于此方面的研究报道尚不
多见, 主要原因是确定代谢途径比测定代谢物
更为困难, 往往只能进行间接的定性估计, 从
5372005 尹恒等: 植物代谢组学的研究方法及其应用
一个个点的代谢物到一条完整的代谢途径还
有很长的路要走。
2.3 基因功能研究
代谢产物是基因表达的终产物, 基因表达
上极微小的变化也可导致代谢物的大幅改
变。以前往往通过可见的表型改变来判断基
因表达水平的升降, 耗时较长, 且有时候基因
表达变化无法引起表型改变, 而此时植物体中
某些代谢产物的含量却会发生变化。这时,
利用代谢组学方法检测代谢物的变化就可以
判断基因表达水平的变化, 从而推断基因的功
能及其对代谢流的影响 (Stitt and Sonnewald,
1995; Stitt,1999)。Lytovchenko等(2002)通过
对马铃薯叶片大量代谢物, 特别是光合作用途
径中的中间体和终产物进行分析, 研究了质体
葡萄糖磷酸变位酶(plastidial phosphoglu-
comutase)基因在光合作用中对碳流的影响, 发
现在其表达水平低的情况下, 虽然植物表型没
有变化, 但是植物组织中的淀粉、糖和有机
酸的含量都有一定降低。这说明质体葡萄糖
磷酸变位酶基因表达水平的变化对植物的几
条主要代谢途径都有很大的影响。
2.4 与转录组学和蛋白质组学技术整合
转录组学、蛋白质组学和代谢组学是一
个有机的整体, 它们都是系统生物学(system
bio logy )的重要组成部分。生物信息是按
DNA→mRNA→蛋白质→代谢产物方向流动
的, 将所获得的这几者的信息联系起来, 有利
于从整体研究生物系统对基因或环境变化的
响应, 如可判断代谢物的变化是从哪一个层面
开始发生的。Ferrario-Mery等(2002)整合了
关于转录、酶活性及代谢物的数据研究烟草
中的碳氮代谢相互作用。通过对NH4代谢过
程中主要代谢物的定量分析, 以及先前掌握的
关于氮在转录层面的知识, 分析了谷氨酰胺合
成酶(glutamine synthetase)在氮代谢过程中的
作用, 得到结论是代谢物量的变化与转录水平
无关, 而与转录后修饰调节有关。有的研究
者同时应用了多种组学方法进行研究, 也取得
了很好的成果。Yamazakia 等(2003)利用
H P L C / P D A / E S I - M S 对红色和绿色紫苏
(Perilla frutescens var. crispa)的叶片和茎秆
进行了代谢组分析, 检测到了大约 50个峰。
对其中与花青素有关的物质进行了定性定量
鉴定和对比, 然后用mRNA差异显示技术对从
两种紫苏的叶片中提取到的mRNA进行了筛
选, 找到了一些差异基因。通过对这两种方
法所获得的数据进行分析, 推断了一些影响紫
苏成色的基因。
3 问题与展望
目前, 关于代谢组学的研究工作虽开展得
还不多, 但是越来越多的研究者正投身于此领
域。第 1届植物代谢组学大会于 2002年 4月
在荷兰举行, 期间成立了国际植物代谢组学委
员会( I n t e r n a t i o n a l C o m m i t t e e P l a n t
Metabolomics, ICPM)并建立了该委员会的国
际官方网站(http://www.metabolomics.nl), 大
大促进了全世界此领域研究者的交流。第 2
届植物代谢组学大会于2003年在德国柏林的
戈尔姆举行。第 3 届植物代谢组学大会于
2004年 6月在美国的爱荷华州举行。这些国
际性的会议极大地促进了植物代谢组学的研
究。在我国, 关于植物代谢组学的研究也正
在逐步展开, 邱德有和黄璐琦(2004)用基因芯
片和代谢组学技术研究丹参品质形成的分子
机理, 试图通过转录组学和代谢组学研究来揭
示丹参品质形成的原因。军事医学科学院、
中国科学院植物研究所及中国科学院大连化
学物理研究所等单位也正投入到植物代谢组
学的研究浪潮中。
但是, 在一项新技术的发展道路上, 必然会
遇到各种各样的问题。目前代谢组学面临的
主要问题主要有以下几方面: 1)分离分析工具
的偏差和局限性; 2)海量数据中去粗取精的方
法; 3)格式纷繁的数据归一化和数据库的建立;
538 22(5)
参 考 文 献
4)代谢组学技术和其他组学技术的连用。植
物代谢组学技术可应用在植物学的许多方面,
随着它积累的数据和信息量越来越大, 其在
植物学各个领域的应用价值也与日俱增。
它不仅能对单个代谢物进行全方面的分析,
更能帮助人们更好地了解生物体中的代谢途
径、生物体中各种复杂的相互作用及生物
系统对环境和基因变化的响应, 最终着眼于
将植物代谢组学和其他组学技术整合起来,阐
述植物从基因到表型的整套复杂系统是如何
运行的。相信随着更有力的成分分析设备
的使用, 更多种分离分析手段的整合, 更强大
的数据挖掘和分析工具的出现, 更完备的代
谢组数据库的建立 , 植物代谢组学将在生
物、农业、医药及环境等研究领域产生深
远的影响。
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