全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 91~98
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金(30270708)和中国科学院生命科学与生物技术青年创新课题资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zmhu@genetics.ac.cn
收稿日期: 2004-03-12 接受日期: 2004-07-19 责任编辑: 白羽红
专 题 介 绍
差减抑制杂交技术在植物研究中的应用①
姜淑梅 吕晓梅 胡赞民②
(中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101)
摘要 差减抑制杂交技术在医学研究中应用较多, 而在植物研究中的应用较少, 近几年有所增加。本
文介绍了目前差减抑制杂交技术在植物发育、逆境胁迫或人为诱导条件下差异基因表达以及不同组织
中差异基因表达和突变等研究方面的应用。随着研究的不断深入, 差减抑制杂交技术将在植物新基因
的发现和克隆中发挥更大作用。
关键词 差减抑制杂交, 差异表达, 基因克隆
Application of Suppression Subtractive Hybridization
in Plant Research
JIANG Shu-Mei LÜ Xiao-Mei HU Zan-Min②
(Institute of Genetics and Developmental Biology, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101)
Abstract Suppression subtractive hybridization (SSH) has been widely used in medical research
but less in plant science up to date. In this paper we review the application of SSH in plant
research, including research into plant development, differential expression of genes induced by
environmental stress and/or artificial control, differential expression in tissues and mutants. SSH
may play a more important role in the discovery and cloning of new genes in plant research.
Key words Suppression subtractive hybridization (SSH), Differential expression, Gene cloning
1 差减抑制杂交技术发展
高等生物大约含有 10万个不同的基因,
但在生物体发育过程中只有 15%(Liang and
Pardee, 1992), 即1.5万个基因按时空顺序有序
地进行表达, 这种表达方式即为基因的差别表
达(differential expression)。基因表达的变化
是调控细胞生命活动过程的核心机制(吴乃虎,
2000)。因此, 通过比较同一类细胞在不同生
理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达
差异, 可为分析生命活动过程提供重要信息, 为
此人们建立了一系列研究方法。早期建立的
示差筛选(differential screening)和差减杂交
(subtractive hybridization)技术(Liang and
Pardee, 1992)目前仍广泛应用。示差筛选成
功的典型例子是生长因子调节基因的分离
92 22(增刊)
(Okumura et al., 1994), 这两种方法的共同特
点是: 均适用于分离经特殊处理而被诱发表达
的基因, 并且不需任何有关目的基因的核苷酸
信息。此外, 两项技术的采用首先都要拥有两
种不同的细胞群体, 几个表达诱导目的基因的细
胞群和不表达诱导目的基因的细胞群, 并分离出
各自的总mRNA, 经反转录后制备的cDNA探针
分别与表达目的基因的细胞 cDNA文库进行
杂交筛选, 挑出含有目的基因的菌落, 作进一
步研究(李捷等, 1999)。由于两方法灵敏度低
且重复性差, 使这两种技术不能广泛应用。
近年来, 基于PCR基础上克隆新基因的方
法不断涌现, 其中以Liang和Pardee(1992)首次
提出的mRNA差异显示 (mRNA differential
display reverse transcription PCR, DDRT-PCR)
技术和Hubank和Schatz (1994)提出的代表性
差示分析(representational difference analysis,
RDA)技术以及Diatchenko等(1996)提出的差
减抑制杂交( s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v e
hybridization, SSH)技术为代表。DDRT-PCR
技术在应用中存在假阳性高的问题, 而 RDA
技术不能有效检测到基因上调表达, 差减抑制
杂交(SSH)技术则克服了以上技术的缺点, 该方
法具有假阳性率低、高敏感性、速度快及效
率高的优点, 缺点是需要几微克的mRNA, 否
则限制低丰度的差异表达基因的检出, 而且研
究材料的差异不能太大, 最好是细微差异。
随着基因芯片技术的发展, cDNA微列阵
(cDNA microarray)技术也被应用于检测基因的
表达, 其优点是可以同时对大量基因, 甚至整
个基因组的基因的表达差异进行对比分析, 是
目前进行高通量基因表达分析的最为有效的
手段之一(Carulli et al., 1998)。但其存在的缺
陷也是相当明显的: 1)假阳性高, 只能用于基因
差异表达的初步筛选; 2)成本高, 由于芯片制作
的工艺复杂, 信号检测也需专门的仪器设备, 一
般实验室难以承担其高昂的费用; 3)芯片实验
技术上有多个环节尚待提高, 如在探针合成方
面, 如何进一步提高合成效率及芯片的集成程
度是研究的焦点。样品制备的简单化与标准
化则是芯片应用进一步普及的前提(Hardiman,
2002; Wang et al., 2003)。目前, 在多基因表
达水平研究中, 联合应用SSH和cDNA芯片技
术更具优点。由于SSH筛选步骤富集了差异
表达基因的数量同时又减少了多种看家基因
的量, 因此, 利用高通量的cDNA芯片技术对
SSH文库中的cDNA片段进行筛选, 会大大提
高筛选效率的阳性率。Yang等(1999)对联合
应用SSH和cDNA芯片技术筛选差异表达基
因的方法进行了探讨, 并利用这种方法成功地
分析了两种不同乳腺癌细胞系间的差异表达
基因。王金惠等(2003)联合应用SSH和cDNA
芯片技术, 分析了人体肝癌细胞(HepG2)急性
低氧处理以及低氧习服处理后基因表达谱的
改变。
2 SSH技术特点
SSH技术运用杂交的二级动力学原理, 丰
度高的单链 cDNA退火时产生同源杂交的速
度要快于丰度低的单链cDNA, 从而使得丰度
有差别的单链 cDNA相对含量达到基本一
致。而所谓抑制PCR, 则是利用非目标序列
片段两端的反向重复序列在退火时产生类
似发卡的互补结构, 无法与引物配对, 从而
有选择地抑制了非目的基因序列的扩增, 具体
过程见图 1。
SSH技术采用两次差减杂交和两次PCR,
大大提高了该方法的特异性, 降低了假阳性
率。并且该技术在反应中将丰度不同的单链
分子含量均一化 , 保证能够检测出低丰度
mRNA, 加上速度快、效率高的优点, 使此技
术近几年得到广泛应用。
SSH技术在医学上应用很广泛, 最近几年
在植物上应用逐渐增多。最先是Gurskaya等
(1996)利用SSH技术分离和克隆了植物血球凝
集素(phytohemagglutinine, PHA)和豆蔻酰佛
932005 姜淑梅等: 差减抑制杂交技术在植物研究中的应用
波醇乙脂(phorbol-12-myristate-13-acetate,
PMA)诱导的细胞转录物, 并获得了 6个低丰
度的上游调控序列。现在SSH技术已经应用
在植物差异表达研究的更多方面, 以下对其应
用作一概述。
3 差减抑制杂交技术在植物研究
中的应用
3.1 差减抑制杂交技术在植物发育研究中
的应用
在调控细胞生命活动的过程中, 基因按时
图 1 差减抑制杂交的原理
Fig.1 Mechanism of SSH (Diatchenko et al., 1996)
94 22(增刊)
间和空间顺序有序地进行表达。在植物生长
发育的各个阶段, 基因的表达也是不同的。
通过比较同一类细胞或组织在不同生长发育
阶段的基因表达差异, 对了解植物生长发育过
程的基因调控机制及发现发育相关基因有很
大帮助。利用SSH技术成功地分离植物不同
发育阶段的差异表达基因已有成功的报道。
刘军等(2000)应用SSH技术对与水稻幼穗发育
相关基因进行了研究, 分别以水稻茎尖分生组
织为对照群体, 幼穗分生组织为目标群体(Pb/
Sb), 进行差减杂交。通过差示筛选鉴定了40
个在 Pb/Sb中特异表达或表达增强的候选克
隆, Northern杂交验证, 至少有40%的候选克
隆代表了在 Pb/Sb中特异表达或表达增强的
基因。其中有18个为RHP (rice and hypothe-
tical)基因。且获得的大部分 cDNA为水稻中
首次克隆。通过对获得的特异表达基因序列
的分析, 推测水稻从营养生长转为生殖生长涉
及大量的基因表达调控事件, 不仅有重要的转
录因子活跃其中, 而且还存在丰富的信号转导
和物质、能量代谢。SSH 在研究植物花发
育、叶片衰老及根茎发育中也得到应用, 并
分离到相关基因。如Kim等 (1999a, 1999b) 应
用SSH技术研究了康乃馨花成熟相关基因, 并
克隆到与动物分泌磷脂酶(secretory phosph-
olipases, LPA2) 同源的基因及半胱氨酸蛋白酶
抑制因子。Hinderhofer和Zentgraf (2001) 用
SSH方法进行了拟南芥与叶片衰老相关基因
的研究, 分离并验证WRKY53在叶片衰老早期
表达并可能在叶片衰老中起到调节作用。罗
志勇等(2003)构建了四年生和一年生人参根
组织mRNA群体间正向差减cDNA文库, 获
得6个根发育阶段差异性表达基因, 并认为
这 6个基因可能在人参皂苷生物合成中发
挥了重要作用。
3.2 差减抑制杂交技术在特殊诱导研究中
的应用
植物在自然条件下受到逆境胁迫或人工
特异诱导时, 会产生各种应激性反应并引发相
关基因表达发生变化。病虫胁迫、温度变
化、水分胁迫、化学药剂及辐射胁迫等, 都
会使植物发生生理生化变化。从本质上说,
这些均是基因表达变化的结果。研究外界刺
激产生的基因差异表达, 对揭示植物的应激性
反应本质, 帮助改良农作物、经济树种及牧
草等适应性有深远意义, 尤其在研究农作物应
激及病理变化, 如对小麦、水稻和玉米等重
要粮食作物所作的相关研究, 对作物遗传育种
工作有更为深远的应用价值。
3.2.1 病虫胁迫研究 在作物育种工作中,
抗病育种是重要的育种目标。通过生物工程
技术已将若干个抗病基因转化到作物中, 获得
了抗病材料。但对相当部分病虫胁迫机制并
不清楚, 如发挥抗性的主效或专一基因、启
动抗性反应的信号转导等问题。SSH的原理
和技术非常适合探讨这方面的问题, 所以在植
物上, SSH技术被越来越多地应用在研究各种
胁迫条件下的差异表达。
骆蒙等 (2002a,2002b)以抗白粉病品系
‘百农 3217’בMardler’BC5F4为材料, 构
建了一个白粉病菌接种初期的抑制消减杂交
c D N A 文库 , 获得 7 6 0 条表达序列标签
(expressed sequence tags, EST), 其中 54.1%
与抗病相关基因同源。在 GenBank上进行
BLASTn与BLASTx分析, 结合文库高密度点
阵膜的杂交差示筛选, 获得功能已知的抗病相
关 EST 65种, 199条。并分析了抗病相关基
因表达谱, 有助于了解小麦抗白粉病过程中信
号转导及基因表达等情况。
Xiao等 (2001) 研究了35S启动子的PTO
基因在马铃薯中的表达情况, 对了解植物抗病
过程中激活抗性反应的机制有重要意义。
SSH技术在研究大豆线虫与植物及植物与真
菌共生等相互作用中也得到应用 (Gao et al.,
2001; Voiblet et al., 2001; Matvienko et al.,
2001; Journet et al., 2002)。
952005 姜淑梅等: 差减抑制杂交技术在植物研究中的应用
3.2.2 温度和水分胁迫 温度和水分对作物
的生长发育是十分重要又紧密相连的因素。
多年来, 对作物抗低温、耐旱涝的研究一直
在进行。尤其是对其复杂的生理生化反应机
制的研究。近年来, 利用分子生物学技术分
离相关基因的研究取得较大进展, 并通过生物
工程技术改良了部分作物的抗逆性。SSH技
术在研究温度和水分胁迫条件下基因的差异
表达也取得一定进展。
Bahn等 (2001) 对大麦 (Hordeum vulgare
cv. ‘Dongbori’) 进行低温处理, 获得了160个
低温诱导大麦的 c D N A 克隆 , 通过低温、
NaCl、脱水和ABA诱导, 进一步分析它们的
差异表达。并证明BLTI2基因是依赖于ABA
调节的低温诱导表达基因, 基因序列分析认为
BLTI2是一个新发现的低温诱导跨膜蛋白。
高鹏等(2003)以淹水处理(submergence-
treated, ST)的玉米幼苗根部 cDNA为目标群
体, 进行SSH, 共得到95个差异表达的cDNA
片段, 其中 21个可能是新基因。相关研究还
有 Happe和Kaminski(2002)用SSH方法成功
分离了绿藻 (Chlamydomonas reinhardtii)厌
氧环境诱导表达的基因 HYDA。
渗透调节是植物适应干旱逆境的重要生
理机制, 对渗透保护因子、渗透调节及特异
表达基因的研究是目前研究植物耐旱机制较
为瞩目的方面。郭新红等(2001)利用 SSH分
离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因
的cDNA片断, 发现3个在甘露醇处理下特异
表达或表达增强的基因。Zhang等(2002)利用
SSH在绿藻中克隆了盐诱导后叶绿体果糖1,6-
二磷酸醛缩酶基因。Chen等(2002) 用SSH技
术研究了水稻施用卅烷醇(triacontanol)后诱导
表达的基因, 并推断了它在植物生长中可能起
到的作用。
3.2.3 辐射胁迫 辐射育种是植物育种的方
法之一。植物经过不同射线辐射会诱变很多
种变异, 从直观可见的形态变异到基因突变均
有发生。通过SSH技术可以对经过辐射诱导
和未诱导的材料进行基因表达的研究。
Sävenstrand等(2002) 用SSH技术研究了低水
平紫外线辐射(UV-BBE,300 0.13 W.m–2)诱导
Pisum sativum 中差异表达的基因, 发现了6个
差异表达基因, 其中2个是因UV-B处理mRNA
水平分别提高和受抑制的新基因, 揭示了已知
基因在紫外线辐射诱导下发生的转录水平的
异常变化。与通过臭氧处理的对照比较分析
发现, 有相似的基因表达变化发生。这一研
究对了解植物应激反应机制及不同外界刺激
诱导的基因差异表达做出了贡献。
3.2.4 差减抑制杂交技术在植物组织差异
研究中的应用 部分基因的表达有组织特异
性, SSH技术对发现新的组织特异性表达基因
有一定帮助。如Kim等(2001) 用SSH技术研
究在辣椒胎座中差异表达的基因。Kloos等
(2002) 研究了甜菜主根中差异表达的基因。
但SSH技术不适宜对差异较大的材料进行研
究, 当驱动方(driver)和实验方(tester)差异较大
时, 消减杂交后出现的差异基因会很多, 对进
一步筛选、检测及鉴定目的基因十分不利,
所以SSH技术在植物组织差异中的应用受到
一定限制。
另外, SSH技术还被应用到突变研究, 如
王永胜等(2001)对一株水稻矮化突变体进行差
异表达研究, 希望获得与矮化相关基因信息, 结
果分别从正向差减文库和反向差减文库中筛
出 10个阳性克隆。相信 SSH技术在研究植
物突变中会得到更多的应用。
研究证实, SSH特别适合于研究发育阶段
转型前后, 个体内部器官之间, 以及受环境影
响较大的差异表达基因的克隆。近几年应用
SSH技术在植物中克隆到全长并进行初步功
能分析的一些新基因见表 1。
4 结束语
目前, 在植物研究中应用SSH技术, 以研
96 22(增刊)
参 考 文 献
究逆境胁迫或人为诱导条件下差异基因表达
为多, 并发现很多基因参与特定条件诱导下特
异表达, 其中有相当部分为从未发现的新基因,
而对部分已知功能的基因, 在某些诱导条件下
也进行特异表达, 则受到研究者更多关注。
SSH技术具有敏感程度高、效率高和假阳性
率低的优点 , 其技术关键和障碍是酶切后
cDNA和接头(adaptor)的连接效率及实验中需
要样本量较大, 因为连接效率不高会使某些差
表 1 近年应用SSH技术克隆的新基因
Table 1 New genes cloned by using SSH in recent years
基因名称 所用材料 文献来源
CFMI-3 康乃馨 Carnation Kim et al., 1999a
CFMI-5 康乃馨 Carnation Kim et al., 1999b
BLTI2 大麦 Hordeum vulgare cv. ‘Dongbori’ Bahn et al., 2001
WRKY53 拟南芥 Arabidopsis thaliana Hinderhofer and Zentgraf, 2001
DsALDP 盐藻 Dunaliella salina Zhang et al., 2002
HYDA 雷氏衣藻 Chlamydomonas reinhardtii Happe and Kaminski, 2002
异表达基因难以发现, 而有些特殊样本不易获
得则限制了mRNA取样量。相信SSH技术能
进一步用于揭示基因的功能及参与表达调控
的机制的研究。
自从1996年SSH技术提出并被应用在各
方面的研究, 已经实施了一系列技术改进。
相信随着SSH技术的日臻完善, 该技术将会在
植物研究中有更广泛的应用。
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