全 文 ：植物学通报 2005, 22 (6): 687~691
Chinese Bulletin of Botany
①“十五”国家科技攻关项目(2001BA70)、“十五”国家科技攻关重大项目( 2 0 0 2 B A 5 1 7 4 0 2 )和河北省科
技攻关项目(03276408D-4)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: jzjysh@cau.edu.cn
收稿日期: 2005-03-29 接受日期: 2005-05-27 责任编辑: 白羽红
实 验 简 报
管花肉苁蓉与柽柳试管苗离体接种的研究①
马东明 杨太新 陈庆亮 翟志席 郭玉海②
(中国农业大学农学与生物技术学院 北京 100094)
摘要 用去果皮的种子对柽柳长根实生苗和试管苗进行接种, 建立管花肉苁蓉种子与柽柳的离体接
种体系, 用体视显微镜观察接种情况并用整体透明方法观察侵染情况。结果表明, 寄主柽柳的试管苗
与管花肉苁蓉种子的共培养能够建立管花肉苁蓉-柽柳接种复合体, 这将为研究寄主-寄生物相互关系
提供有效的实验体系。
关键词 管花肉苁蓉, 离体, 接种
In vitro Inoculation of Cistanche tubulosa Seeds on Tube
Seedlings of Tamarix chinensis
MA Dong-Ming YANG Tai-Xin CHEN Qing-Liang ZHAI Zhi-Xi GUO Yu-Hai②
(College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094)
Abstract To develop an in vitro inoculation system of Tamarix chinensis with seeds of
Cistanche tubulosa, we removed the pericarp before seeds were inoculated on roots of tube
seedlings and seedling plants of T. chinensis. Investigations of inoculation were carried out by
stereo microscopy, and observations of infection involved use of the whole clearing method. C.
tubulosa-T. chinensis inoculation complex can be established through culture of seeds of C.
tubulosa together with radicated T. chinensis, which may offer an effective experimental system
for the study of host-parasite interactions.
Key words Cistanche tubulosa, In vitro, Inoculation
管花肉苁蓉(Cistanche tubulosa)为列当
科(Orobanchaceae)肉苁蓉属多年生寄生草本
植物, 常寄生于沙生灌木柽柳属(Tamarix)的根
部, 它通过一个称为吸器的特有结构从柽柳体
内吸取水分、无机和有机营养来维持其生
存。管花肉苁蓉以干燥带鳞叶的肉质茎入药,
具有补肾阳、益精血及润肠通便等功效(屠鹏
飞等, 1994; 宋志宏等, 2000)。目前管花肉苁
蓉已在内蒙古(李天然等, 2002)和河北吴桥引种
栽培成功, 但存在的突出问题是种子接种成功
率低、接种成功的周期长且接种上的肉苁蓉
寄生生长不同步。自然条件下由于土壤中复
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杂的成分(如土壤微生物)及田间难以控制因素
的影响, 使寄生植物和寄主植物之间寄生关系
的研究较为困难。在无菌培养条件下建立起
寄生植物和寄主的接种体系, 可以使寄生植物
和寄主相互作用的生化及生理机制的研究(如
寄主分泌何种物质刺激寄生植物种子的萌发,
寄生植物和寄主建立寄生关系的过程等)得以
简化。在离体接种方面, Losner-Goshen等
(1996) 用列当(Orobanche aegyptiaca)成功侵
染了寄主番茄(Lycopersicon esculentum);
Zhou等(2004)用列当(Orobanche minor)种子
离体接种寄主番茄和红三叶草( T r i f o l i u m
pratense)以及欧洲油菜(Brassica napus)也获
得了成功。管花肉苁蓉和寄主柽柳的离体接
种体系还未见报道。对管花肉苁蓉 -柽柳接
种复合体的探索, 将为管花肉苁蓉种子萌发刺
激物质的确定、研究种子萌发、吸器发育乃
至寄生过程以及工厂化组培生产管花肉苁蓉
种苗都具有一定的理论价值和实践意义。
1 材料与方法
1.1 材料来源
管花肉苁蓉种子来源于新疆于田种植场,
由中国科学院新疆生物土壤沙漠研究所刘铭
庭教授提供, 经鉴定为管花肉苁蓉(Cistanche
tubulosa),采收年份为 2002年。管花肉苁蓉
的寄主中国柽柳(Tamarix chinensis)来自中国
农业大学科学园温室。
1.2 实验方法
1.2.1 柽柳离体快速繁殖体系的建立 以
柽柳的幼嫩枝条为外植体, 经过起始培养、
增殖培养和生根诱导建立柽柳的离体快速繁
殖体系。
1.2.2 管花肉苁蓉种子的处理 经过初步分
级的种子放于冰箱(2~5 ℃)进行为期2周到2个
月的低温层积, 完成生理后熟。将种子剥去
果皮后浸于 70%乙醇 30秒, 然后用 2 %次氯
酸钠消毒 3~5分钟,再用无菌水冲洗 5次。
1.2.3 管花肉苁蓉种子与生根柽柳试管苗
的接种 将已长根的柽柳实生苗和再生苗从
三角瓶转移到盛有MS培养基的9 cm培养皿
中, 转移时要倾斜45°接入, 以使根系可以沿着
培养基表面向下生长而不至于使根扎入培养
基中, 并使根尽量处于培养皿中央, 绿色的茎
叶部分处于边缘。然后把剥去果皮并消毒过
的管花肉苁蓉种子在无菌条件下接种于柽柳
试管苗的根周围。用折成长方形的铝薄纸把
处于培养皿中央的柽柳试管苗的根和管花肉
苁蓉种子包裹上, 以使培养皿的中央尽量保持
黑暗; 培养皿的边缘则不包, 使少量漫射光得
以进入来维持绿色茎叶的生长。每只培养皿
约接60粒种子, 3次重复, 培养皿置于(25±2)
℃条件下培养, 定期用OLYMPUS SZH10型体
视显微镜观察管花肉苁蓉种子萌发和接种于
寄主根的情况, 记录并照相。
1.2.4 柽柳根(管花肉苁蓉种子已成功侵染)
的整体透明 把已接种管花肉苁蓉种子的柽
柳根用FAA(5 mL冰醋酸、5 mL甲醛和90 mL
浓度为 70 %的乙醇)固定液固定并保存。材
料以爱氏苏木精进行染色,在冬青油中透明后
用OLYMPUS SZH10型体视显微镜观察。此
方法参考杨弘远(1986)对胚珠和子房的整体染
色透明方法并加以修改。
2 结果与讨论
2.1 管花肉苁蓉种子萌发与初生吸器的形成
生根柽柳试管苗与管花肉苁蓉种子的共
培养方式见图 1A。30天后统计种子萌发和
接种情况, 结果见表1。从表1中可以看出, 有
试管苗的培养基中的种子萌发率都显著高于
对照(无柽柳试管苗的培养皿); 而一次成苗和
生根诱导两种培养方式下的种子萌发率差异
显著, 前者的种子萌发率高于后者。共培养
下的种子萌发的形态与对照的有所不同: 对照
培养中种子一般形成芽管(germ tube)(图1B),
进而发育为圆锥状的顶端膨大的初生吸器
6892005 马东明等: 管花肉苁蓉与柽柳试管苗离体接种的研究
(primary haustorium)(图 1 C)。共培养方式下
萌发的种子一般首先是珠孔端呈现“露白”,
而后逐渐突起, 使原来类似球状的种子变为近
似椭球状, 进而发育为类似瘤状物的器官(图1
D, E)。
印度学者Rangan和 Rangaswamy (1968)
研究了Cistanche tubulosa种子在人工培养基
中的萌发情况, 发现在无寄主根系分泌物的
WB培养基(加入一定量的椰乳和水解酪蛋白)
上种子萌发形成一种叫芽管的器官。本实验
发现在不加入柽柳试管苗根系分泌物的MS
培养基上的管花肉苁蓉种子也能够萌发, 芽管
状器官与Rangan和Rangaswamy (1968)所观
察到的芽管形态类似。管花肉苁蓉初生吸器
(图1C)的形态与盛晋华等(2004)描述的荒漠肉
苁蓉种子的初生吸器形态相似。实验中还观
察到在没有寄主根存在(对照)的条件下, 种子
形成初生吸器后便停止发育, 这可能是由于缺
乏寄主的某种刺激吸器进一步发育的刺激因
子所致, 这也是导致共培养下的种子萌发的形
态与对照的不同的原因之一。
Kadry和Tewfic (1956)的研究认为, 列当
科植物Orobanche crenata在有寄主存在的情
况下种子的球形胚能够形成一团不规则的组
织 , 他把这种组织称为瘤状物。李天然等
(1989)在田间研究荒漠肉苁蓉种子的萌发与寄
主梭梭(Haloxylon ammodendron)的关系时也
发现这种瘤状物。本实验观察到在有寄主根
系分泌物情况下也有此种瘤状物的出现。笔
者认为把这种瘤状物称为“附着器”
(holdfast)比较合适。这种附着器固定到寄主
植物上后, 通过附着器与寄主根的某种作用机
制来促使功能性吸器的发育, 从而建立起寄生
植物与寄主间的桥梁, 寄生植物即是通过吸器
从寄主中吸收水分、营养来维持自身的生
存。这种功能性吸器诱导因子的本质是什么
还有待进一步研究。
2.2 管花肉苁蓉种子与寄主根生长的关系
与柽柳根的相对距离大于1 cm的管花肉
苁蓉种子虽然在寄主根的某种萌发刺激物质
的影响下能够萌发, 但往往因为萌发的种子在
伸长过程中逐渐耗尽胚乳中储藏的营养物质
而停止生长, 萌发种子的远端常常接触不到寄
主根, 该种子萌发所形成的瘤状物在继续发育
的过程中逐渐进行脱分化, 最终形成淡黄色松
散的愈伤组织(图 1F)。
与柽柳根相对距离较近的种子所形成的
“瘤状物”(附着器官)在接触到寄主根的情况
下, 以一种寄生植物所特有的机制刺穿柽柳根
的皮层, 并与寄主根连接， 从而建立寄生关系
(图 1G)。接种成功的根用爱氏苏木精和冬青
油处理后可以观察到柽柳的皮层和韧皮部均
表 1 共培养下的管花肉苁蓉种子萌发和接种情况
Table 1 Seed germination and inoculation of Cistanche tubulosa in the presence of host roots
Type of Number of Number of Ratio of Significance Number of seeds Ratio of Significance
tube seedling treated germinated germination of parasitizing on inocul- of
seeds seeds (%) difference* host roots ation (%) difference*
Regeneration 1 8 0 45 25.0 b 8 4 .4 b
of seedling
after multip-
lication
Direct regen- 1 8 0 57 31.6 a 15 8 .3 a
eration of
seedling
Control 1 8 0 10 5 .5 c - - -
* 在 0.05水平上差异显著 * Means significance of difference at 0.05 level
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变得透明。管花肉苁蓉的吸器与寄主柽柳的
木质部相连接(图1H), 但也有个别种子发育成
的瘤状物虽然与寄主根相接触, 但未能与寄主
成功建立寄生关系而逐渐黄化, 以致死亡(图
1 I )。
本实验用再生苗和实生苗对管花肉苁蓉
离体接种率进行了比较。发现一次成苗所生
的根对接种有稍好的效果, 接种率达8.3%, 增
殖后生根所得的试管苗与种子的接种率为
4.4%, 并且两者对管花肉苁蓉种子接种率方面
有显著差异(表1)。一次成苗培养方式下的种
子萌发率和接种率均比生根诱导方式高, 这可
能是一次成苗生成的根较壮, 更有利于萌发刺
激物质和吸器诱导分子的合成。
图 1 管花肉苁蓉与柽柳试管苗的离体接种
A. 生根的柽柳与管花肉苁蓉种子的共培养; B. 管花肉苁蓉种子的芽管; C. 管花肉苁蓉种子的初生吸器;
D, E. 瘤状物的形成; F. 萌发种子形成的愈伤组织; G, H. 种子成功侵染寄主根; I. 瘤状物虽与寄主接触, 但
未能与寄主成功建立寄生关系。GT. 芽管; PH. 初生吸器; T. 瘤状物; HR. 寄主根; P. 寄生物. 比例尺 =
0.5 mm
Fig. 1 In vitro inoculation of Cistanche tubulosa seeds on tube seedling of Tamarix chinensis
A. Culture of seeds of Cistanche tubulosa together with radicated Tamarix chinensis; B. Germ tube of Cistanche
tubulosa; C. Primary haustorium of Cistanche tubulosa ; D,E. Tubercle formation; F. Callus of germinated seeds;
G,H. The successful infection on host roots; I. A tubercle failed to develop parasitic connection with host roots
even though it was attached to host. GT. Germ tube; PH. Primary haustorium; T. Tubercle; HR. Host root; P.
Parasite. bar=0.5 mm
6912005 马东明等: 管花肉苁蓉与柽柳试管苗离体接种的研究
离体条件下管花肉苁蓉种子成功接种的
几率和种子与根的相对位置有关, 多数种子是
与寄主根的尖端“融合”生长, 这主要发生
在根毛区。只有很少的种子与寄主建立寄生
关系的部位发生在非根毛区。这是否与柽柳
根分泌刺激物质的部位主要为根毛区有关？
这还有待验证。通过寄主柽柳的离体快速繁
殖得到的试管苗能与管花肉苁蓉种子建立管
花肉苁蓉-柽柳接种复合体, 但形成接种复合
体的接种率还较低, 实验方法和接种装置的设
计还有待进一步改进。
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