全 文 ：植物学通报 2005, 22 (3): 307~312
Chinese Bulletin of Botany
①国家 973计划项目(G1999016000)和国家转基因植物研究与产业化专项(JY03A1802)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: wangyucheng1029@yahoo.com.cn
收稿日期: 2004-01-07 接受日期: 2004-07-05 责任编辑: 孙冬花
研 究 论 文
差异显示技术研究 NaHCO3胁迫下
星星草基因表达①
王玉成② 杨传平 刘桂丰 姜 静
(东北林业大学林学院 哈尔滨 150040)
摘要 用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinellia tenuiflora)基因的表达。经Reverse North-
ern检测, 获得了7个差异表达的基因片段。其中, 6个为胁迫后诱导表达, 1个为胁迫后抑制表达。序列
同源性分析表明, 胁迫诱导表达的6个基因片段中, 1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,
其余5个可能为新序列, 胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高。本研究为
进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础。
关键词 星星草, 差异显示, NaHCO3胁迫
Studies of Gene Expression in Puccinellia tenuiflora under
NaHCO3 Stress Using Differential Display Technology
WANG Yu-Cheng② YANG Chuan-Ping LIU Gui-Feng JIANG Jing
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040)
Abstract The differential display technique was used to study gene expression of Puccinellia
tenuiflora treated with NaHCO3. Seven differentially expressed gene segments were obtained
through Reverse Northern detection. Among them, six segments were induced and one was
inhibited by NaHCO3. A homologous analysis revealed that one of the six NaHCO3-induced
gene segments was homologous to the genes encoding calcium-dependent protein kinases
（CDPKs）; the other five might be new sequences. The NaHCO3-inhibited gene segment was
homologous to a putative adaptor protein-encoding gene. This research provided basic informa-
tion for further study of the mechanism on salt resistance in P. tenuiflora.
Key words Puccinellia tenuiflora, Differential display, NaHCO3 stress
星星草(Puccinellia tenuiflora)属于禾本
科碱茅属植物, 须根系发达, 茎丛生, 耐盐且耐
旱能力强, 为盐生草甸优势种和建群种, 是进
行抗旱和耐盐研究的良好材料。目前, 在星
星草的耐盐性方面已经进行了许多研究, 例如,
系统地研究了星星草和朝鲜碱茅的生物学特
308 22(3)
性、耐盐性及营养成分等方面, 并进行了田
间试验和室内试验, 准确测定了它们各个生物
期的耐盐性(徐恒刚等, 1995)。研究了星星草
对碱化土壤化学性质的影响, 认为星星草使碱
化土壤化学性质发生较明显的变化是降低了
可溶性盐含量(孙国荣等, 2002)。对星星草泌
盐能力进行了初步研究, 认为星星草具有泌盐
能力, 不同生育时期星星草的泌盐能力相差不
大, 但生长不同年份的星星草泌盐能力有所区
别(阎秀峰等, 1994); 对星星草的适应性及耐盐
生理进行了研究, 认为星星草生态幅度窄, 但
对盐碱生境具有较强的适应力 ( 王苹等 ,
1997)。此外, 一些学者还对星星草进行了
Na2CO3和NaHCO3的耐受性方面研究, 以及
星星草与其他植物耐盐性比较等研究。目前,
对星星草的耐盐研究多集中于抗性生理等方
面, 但对其耐盐分子机理的研究尚未见报道。
本实验应用差异显示技术对NaHCO3胁迫后
星星草基因的差异表达情况进行了研究, 并通
过Northern检测, 克隆到了7个NaHCO3胁迫
后差异表达的基因片段, 为系统地研究星星草
耐盐分子机理奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料处理
将温室中盆栽星星草(Puccinellia tenui-
flora)的同一无性系分成两份, 一份用NaHCO3
处理, 另一份作为对照。用40 g.L-1的NaHCO3
处理68小时取材(叶片部分), 同时取未经处理
的同一无性系作对照。
1.2 试剂及仪器
实验用各种引物、RNasin、ExTaq酶、
pMD18-T、DL-2000 marker和 cDNA syn-
thesis Kit均为宝生物工程(大连)有限公司产
品; 逆转录酶SuperscriptTMⅡ为 Invitrogen产
品; DNaseⅠ为Promega产品; dNTP为上海生
工生物技术服务公司产品; 尼龙膜是Hybond-
N+型, 为Amershampharmacia Biotech公司产
品; 实验用扫描仪型号为Power lookⅢ, Umax
公司生产; 实验用电泳仪为DYY-Ⅲ-12B型, 北
京六一仪器厂生产; 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
槽是Hoefer SQ3 Sequencer, 为Amershamph-
armacia Biotech公司产品。
1.3 RNA的制备与纯化
向1.5 mL离心管中加入0.6 mL CTAB提
取液[2.5 %(W/V)CTAB , 硼砂0.025 mol.L-1,
NaCl 1.4 mol.L-1, pH=8.5, DEPC处理]和β巯
基乙醇0.06 mL; 星星草叶片用液氮研磨后, 加
入离心管中, 65 ℃温浴6分钟, 迅速置于冰上,
待冷却后, 加入Tris苯酚和氯仿各0.3 mL, 用
漩涡振荡器剧烈振荡 3分钟; 12 000 g离心 5
分钟, 转移上清液到新离心管中, 向上清中加
入Tris苯酚和氯仿各0.3 mL, 剧烈振荡2分钟,
12 000 g离心5分钟, 取上清液; 用等体积氯仿
抽提 1次; 向上清液中加入等体积的 LiCl(4
mol.L-1) 和1/2体积的无水乙醇, 混匀, 冰浴
10分钟 , 12 000 g离心10分钟 , 沉淀RNA;
用75%的乙醇洗涤沉淀, 溶于适量的DEPC
水中待用。
向PCR管中依次加入4 mL 10×DNaseⅠ
buffer, 4 mL DTT(0.1 mol.L-1), DNaseⅠ
10 U, RNasin 40 U, 然后加入20 mg总RNA,
加 DEPC水补足 40 mL, 37 ℃保温 1小时。
将反应液移到 1.5 mL离心管中, 用Tris-苯
酚和氯仿抽提纯化RNA, 向抽提后的上清液
中加入2.5倍体积无水乙醇, -70 ℃放置10
分钟, 离心沉淀RNA, 用75%的乙醇洗涤沉
淀1次, 沉淀溶于适量的DEPC水, 电泳检测
RNA的质量, 用紫外分光光度计对RNA进
行纯度检测及定量。
1.4 差异显示
对照和 NaHCO 3处理的 2 种星星草总
RNA, 分别用 3种锚定引物(T12A、T12C和
T12G)进行反转录, 共进行 6个反应。反转录
3092005 王玉成等: 差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达
体系为: 2 mg总RNA, 4 mL 5×Reaction buffer,
2 mL DTT(0.1 mol.L-1), RNasin 40 U, 2 mL dNTP
(10 mmol.L-1 each), 2 mL锚定引物(10 mmol.L-1
), SuperscriptTMⅡ 200 U, 反应体积为20 mL。
室温放置10分钟, 42 ℃保温1小时, 70 ℃保
温 10分钟, -20 ℃保存。
上述反转录产物稀释 10倍, 用作PCR模
板, PCR体系如下: 2 mL 10×buffer, 0.04 mL
dNTP(10 mmol.L-1 each), ExTaq1.2 U, 锚定引
物2 mL(10 mmol.L-1), 10 bp引物1 mL(10 mmol.
L-1), 稀释反转录产物 2 mL, 加超纯水至 2 0
mL。P C R 反应条件如下 , 9 4 ℃预变性 1
分钟 , 94 ℃ 30秒 , 40 ℃ 2分钟 , 72 ℃ 30
秒 , 4 0 个循环 , 7 2 ℃延伸 6 分钟。共应
用 2 0种 1 0 b p引物 , 进行 1 2 0种反应。对
产生的扩增条带多且表达差异高的引物 ,
重复进行实验 1 次。
1.5 电泳及差异条带的获得
将 PCR产物 95 ℃加热 3分钟变性, 迅速
置于冰上, 取4 mL PCR产物, 加入0.8 mL变性
上样缓冲液进行电泳, 电泳介质为6%的变性
聚丙烯酰胺凝胶(8 mol.L-1尿素), 45 W恒功率
电泳至二甲苯青(FF)到凝胶底部时, 停止电
泳。银染 , 方法参照《分子生物学实验技
术》 (郝福英, 1998), 电泳胶用Power lookⅢ
扫描仪扫描图像。通过目视比较, 直接从凝
胶中切下差异条带。
将切下的差异条带置于PCR管中加入20
mL无菌水, 将条带碾碎, 90 ℃温浴10分钟, 离
心取上清液, 加入0.3倍体积2 mol.L-1 NaAc,
3倍体积无水乙醇, 12 000 g离心10分钟。沉
淀用70%乙醇洗涤1次, 用10 mL无菌水溶解,
全量用于条带再扩增。PCR体系除 dNTP用
0.1 mL (10 mmol.L-1 each)外, 其余与差异显示
的PCR体系相同。将PCR扩增的产物进行琼
脂糖凝胶电泳, 检测回收效果, 将回收后的差
异片段克隆到 pMD18-T上。
1.6 差异表达序列的反向Northern检测
取NaHCO3处理68小时的材料和对照材
料的总 RNA各 500 mg, 分别用 PolyATtract®
mRNA Isolation System Ⅲ(Promega公司)试剂
盒分离mRNA。取处理和对照材料的mRNA
各 2 mg, 用 cDNA synthesize试剂盒合成
cDNA的第一和第二链, 合成的双链cDNA分
别用地高辛进行探针标记(DIG-High Prime,
Roche); 将回收后的片段提取质粒, 用pMD18-
T两端测序引物(RVM和M13-47)作PCR引物
进行扩增, 将PCR扩增产物热变性后取3 mL分
别点样于2张尼龙膜上, 紫外交联5分钟, 预杂
交20小时后, 用处理和对照的星星草cDNA探
针分别进行杂交, 杂交6小时后进行免疫学检
测(生色法), 具体操作步骤见DIG High-primer
and Detection KITⅡ说明书。
1.7 差异表达序列的测序与同源性分析
将 Reverse Northern检测为差异表达的
克隆用M13-47引物进行测序, 将测序结果提
交 GenBank, 获得基因序列注册号。同时,
对各序列分别进行BLASTX和TBLASTX同
源性分析。
2 结果分析
2.1 RNA的质量检测
从星星草叶片中提取的RNA用DNaseⅠ
处理后, 变性琼脂糖凝胶电泳检测显示 28S
rRNA和18S rRNA条带清晰, 且28S rRNA条
带亮度高于18S rRNA条带(图1), 紫外分光光
度检测A260nm/A280nm比值为2.0, 说明RNA质
量良好, 可以用于进一步实验。
2.2 差异显示及条带的回收
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示 ,
NaHCO3处理前后基因有较明显的表达差异
(图2)。其中,在用同一引物进行的2次DD-PCR
中, 有90%左右条带在位置和亮度上完全相
同, 说明其重复性较高。根据目视比较, 共
310 22(3)
果可见, 大部分PCR产物表现为明显的单一
条带(图3), 说明回收成功, 共有50个条带被
成功回收。
2.3 Reverse Northern检测结果
将差异片段的PCR回收产物点在尼龙膜
上, 共5行(图4 A～E), 每行10个(图4 1～10),
经杂交检测发现, NaHCO3胁迫后共有7个基
因的表达量出现明显差异。
如图可见, 杂交点 B5、B8、B9、C2、
C8、D2和D3共 7个点有较明显杂交信号差
异, 其中C2点为NaHCO3处理后表达量下降的
基因, 其余各点的基因则在NaHCO3处理后表
达或表达量增加。
2.4 基因的序列同源性比较
各序列的BLASTX与TBLASTX同源性分
析结果见表 1。
从基因序列相似性分析结果可以看出
CF198398和CF198401基因与已知基因同源性
较高, 而且BLASTX与TBLASTX的结果符合
较好, 为已知基因。其他基因则为新基因或
与功能未知蛋白同源性较高。
3 讨论
差异显示技术 1992年由Liang和 Pardee
建立, 从理论上讲该技术可以系统地分离样品
之间所有差异表达的基因, 已被广泛应用于发
育基因和疾病相关基因的克隆(Rosenblum and
Yager,1997)。该技术具有简便、敏感性高、
再现性好和快速等优点。因此, 是进行星星
草抗盐机理研究的理想技术之一。
根据 Reverse Northern杂交结果可以看
出, 获得的差异表达基因绝大多数为高表达基
因, 即在NaHCO3胁迫前有一定表达量, 在胁
迫后则表达量升高, 这可能是植物在盐碱胁迫
生理过程中抗性基因表达的特点之一。获得
的基因片段中CF198398序列与钙依赖性蛋白
激酶(CDPKs)同源性较高, CDPKs为植物重要
的胁迫信号转换的蛋白。在植物细胞中, 钙
图 1 星星草总 RNA凝胶电泳图
泳道1. 星星草总RNA (NaHCO3 处理); 泳道2. 星
星草总 RNA (对照)
Fig. 1 The gel graph of RNA of Puccinellia tenuiflora
Lane 1. Total RNA of P. tenuiflora (NaHCO3 treated);
Lane 2. Total RNA of P. tenuiflora (control)
图 2 星星草差异显示的部分结果 (箭头所指处
为差异表达的基因片段)
泳道 1. NaHC03处理的星星草; 泳道 2. 对照星星
草
Fig. 2 Partial results of DD-PCR of Puccinellia
tenuiflora (arrows show differentially expressed gene
segments)
Lane 1. P. tenuiflora treated with NaHCO3; Lane2.
Control group of P. tenuiflora
获得了 56个差异片段。将用 PCR扩增回收
的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳, 由电泳结
3112005 王玉成等: 差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达
图 3 回收差异表达 cDNA片段重扩增
泳道 1. DL-2000标准分子量; 泳道 2~11. 重扩增 cDNA片段
Fig. 3 Reamplified cDNA from differentially expressed bands
Lane 1. DL-2000 marker; Lane 2-11. Reamplified cDNA fragments
图 4 Reverse Northern杂交选择差异表达基因片段(分别用A～E和 1～10表示行和列序号)
1. 用 NaHCO3处理的星星草 cDNA作探针进行的杂交; 2. 用对照星星草 cDNA作探针进行的杂交
Fig. 4 Reverse Northern dot blotting for verifying of differentially expressed gene segments (A-E and 1-
10 denote the sequence numbers of rows and columns respectively)
1. Hybridization using cDNA of Puccinellia tenuiflora treated with NaHCO3 as probes; 2. Hybridization
using control group P. tenuiflora’s cDNA as probes
离子作为第二信使, 其信号传递的主要途径之
一就是通过CDPKs发挥功能进行的。CDPKs
广泛存在于植物体内, 是目前植物体内研究最
深入的蛋白激酶(陈硕和陈珈, 2001)。在植物
中, CDPKs成员CDPK1和CDPK1a可能是控
制胁迫信号转换的正向调节者 (Sheen, 1996)。
Saijo等(2000)通过对编码水稻CDPKs成员的
OsCDPK7基因研究认为, 该基因可以被盐和
寒冷胁迫所诱导, 对水稻抵抗干旱和盐旱胁迫
的耐受力起正向调控作用。因此, 在星星草
抗胁迫生理过程中, 也可能存在类似的调控机
制。其余的NaHCO3胁迫后诱导表达的序列
可能代表新基因 , 它们的功能未知 , 但在
NaHCO3处理前后基因的表达量差异明显, 说
明与盐胁迫明显相关, 有进一步研究的价值。
星星草抗盐碱能力强, 因此是进行植物抗
盐碱分子机理研究的良好材料, 通过对星星草
抗盐分子机理的研究, 克隆出其抗盐的关键基
因, 用于抗盐转基因植物的培育, 将对植物抗
盐基因工程育种具有重要的意义。
312 22(3)
参 考 文 献
陈硕, 陈珈 (2001) 植物中钙依赖蛋白激酶(CDPKs)的
结构与功能. 植物学通报, 18: 143-148
郝福英 (1998) 用差异显示法分离特异表达的基因片
段. 见: 朱玉贤,朱圣庚,李云兰,周先碗,李茹主编, 分
子生物学实验技术. 北京大学出版社, 北京, 90-94
孙国荣, 阎秀峰, 李晶, 余政哲 (2002) 星星草对碱化
土壤化学性质的影响. 草地学报, 10: 179-183
王苹, 李建东, 欧勇玲 (1997) 松嫩平原盐碱化草地星
星草的适应性及耐盐生理特性的研究. 草地学报,5
(2): 80-84
徐恒刚, 包纯志, 葛澄明, 张萍, 李临杭 (1995) 重度耐
盐牧草星星草和朝鲜碱茅的比较研究. 中国草地, 17
(2): 14, 43-47
阎秀峰, 孙国荣, 李景信, 李敬兰, 佟振宇, 赵彬 (1994)
星星草泌盐能力的初步研究. 草业科学, 11(3): 36-
表 1 差异表达基因片段的BLAST同源性分析结果
Table 1 Result of differentially expressed gene segments BLAST analysis
Position in GenBank Result of BLASTX Expect Result of TBLASTX Expect
hybridiz- accession analysis analysis
ation number
membrane
B5 CF198398 OsCDPK7[Oryza sativa] 4e-14 OsCDPK7 [Oryza sativa] 8e -33
Calcium-dependent protein 9e-14
kinase [Zea mays]
B8 CF198399 Hypothetical protein 3 .8 Low similarity
[Plasmodium falciparum 3D7]
B9 CF198400 P0039A07.8(function 2e-14 P0039A07.8 [Oryza sativa] 8e -18
unknown) [Oryza sativa]
C2 CF198401 Putative adaptor protein 7e-32 Putative adaptor protein 9e -32
[Oryza sativa] [Oryza sativa]
C8 CF198402 No similarity Low similarity
D2 CF198403 Hypothetical protein 0.19 Mouse DNA sequence from 4e -05
[Homo sapiens] clone RP23-145E1 on
chromosome 4(Mouse)
D3 CF198404 No similarity Low similarity
OsCDPK7, 根据 Saijo等(2000)报道, 其为钙依赖性蛋白激酶基因, 克隆自水稻
OsCDPK7, according to Saijo’s report (Saijo et al., 2000), it was calcium-dependent protein kinase and cloned
from Oryza sativa
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Rosenblum ND, Yager TD (1997) Changing patterns
of gene expression in developing mouse kidney, as
probed by differential mRNA display combined with
cDNA library screening. Kidney International, 51:
920-925
Sheen J (1996) Ca2+-dependent protein kinases and
stress signal transduction in plants. Science, 274:
1900-1902
Saijo Y, Hata S, Kyozuka J, Shimamoto K, Izui K
(2000) Over-expression of a single Ca2+-dependent
protein kinase confers both cold and salt/drought
tolerance on rice plants. The Plant Journal , 23:
319-327